基于多肽化學的合成和純化技術及未來的挑戰

陳曉宇

（盤錦檢驗檢測中心，遼寧 盤錦 124000）

0 引言

多肽是介于氨基酸和蛋白質間的物質，已發現存在于生物體內的多肽達數萬種，多肽能起到蛋白質的活性基因作用。多肽中的神經肽是神經元間重要的化學信使，生物活性肽是由酶水解蛋白質產生具有生物功能的肽，酪蛋白生物活性肽具有生理功能。隨著人們對多肽氨基酸功能的了解深入，多肽合成技術日益成熟，多肽藥物開發逐漸受到重視，通過多肽合成可以為多肽生物合成反應機制提供重要信息。多肽的化學合成技術日趨成熟，近年來固相法合成多肽成為常規方法。加強多肽化學合成與純化技術研究對多肽的應用具有重要意義。

1 多肽的應用研究

肽是a 氨基酸以肽鍵連接形成的化合物，人體很多活性物質以肽的形式存在，肽主要作用是調節各系統和細胞的生理功能[1]。肽可以調節人體生理功能發揮生理活性，對人的細胞活性與生命非常重要。多肽是重要的生物調節物，由氨基酸分子脫水縮合成化合物為二肽，多肽是三個以上氨基酸分子脫水縮合成的化合物。多肽類型分為生物活性與人工合成多肽，活性肽包括免疫神經活性肽與其他活性肽等，生物提取多肽具有很強的活性，人工合成多肽需要篩選才能被人體安全使用。目前人們只能合成相對較短的肽鏈，固相合成技術存在很大局限性，尋找綠色環保的多肽合成技術是未來發展面臨的挑戰。

活性多肽包括谷氨酰胺肽、生長刺激多肽等，活性多肽營養價值豐富，主要生物效應是刺激靶細胞增殖分化，活性多肽對胚胎發育具有重要作用[2]。研究發現活性多肽具有調節B 細胞和真皮樹突形成發育等功能，刺激結締組織、合成纖維細胞等分泌細胞淋巴因子和胞外蛋白等，活性多肽通過調節不同細胞活動參與組織器官形成調節，對創傷后引發器官受損功能削弱具有重要的修復重建功能。目前活性多肽廣泛應用于醫藥食品及化妝品等領域，活性多肽使蛋白質藥物活性作用位點集中于較短的多肽鏈上。食用多肽主要作用是維持機體正常生理活動，食品顯著特點是易吸收可作為營養添加劑。

2 多肽化學合成與純化技術

多肽產物在制藥工業中應用取得巨大發展，多肽合成方式分為化學與生物合成，化學合成含有特定順序多肽時不需要反應基團保護合成目標產物的定向性[3]。多肽液相片段合成法在蛋白質合成領域取得重大突破，以多肽液相和固相和合成法為基礎發展出組合化學法等。多肽生物合成法包括酶解法與發酵法，以DNA 重組技術為主導的基因工程法應用于多肽的合成。圖1 為多肽合成示意圖，目前對活性多肽分離純化采用反相高壓液相色譜等方法取得良好效果。

生物活性多肽制備方法包括重組菌生產、化學合成法與酶解法等。化學合成廣泛應用于生產高價值的短到中長藥理級肽。提取法提倡使用奶酪原料，提取法成功的關鍵是發酵用菌的選擇，菌種的改良是重要工作[4]。重組DNA 法生產多肽存在生產效率問題，由于許多生物活性肽氨基酸較少，可設計疊加方案將活性肽基因串聯成重復序列設計酶切位點，簡單媒介工藝可得到小分子多肽。酪啡肽制備酶解法關鍵是選擇合適的酶確定水解條件，食物蛋白水解研究中涉及枯草桿菌蛋白酶等多種，酶的選擇要求專一性強，對酪啡肽水解制備中動物消化蛋白酶最為常見。有學者研究通過微生物蛋白酶嗜熱菌蛋白酶水解消化物得到阿片肽活性，在胃蛋白酶等處理后發現阿片肽活性。

生物活性肽分離純化普遍采用Sephadex 柱析層等方法取得較好效果。RPLC 在20 世紀80 年代后逐步應用于生物大分子的鑒定，RPLC 流動相以水為基本部分，流動相中的有機溶劑可能使肽的天然構象發生變化。研究用RPLC 對化學合成多肽進行分離純化純度達96.4%。圖2 為高效液相色譜HPLC 流程示意圖，超濾是利用膜的選擇性，通過溶液中組分透過膜的遷移速率不同實現非均相物系的分離[5]。HPCE 是溶質以電場為推動力實現高效快速分離的新型電泳技術，HPCE 具有高效快速等特點，目前廣泛應用于無機離子、手性化合物等研究分析中。生物制品分離純化技術成為產業化的關鍵，要根據分離多肽物質性質采用分離手段，應結合使用多種分離分析方法滿足對樣品純度的要求。未來會建立完整的多肽類物質分離提純技術，滿足科研及生產的需要。

圖2 高效液相色譜HPLC 流程示意圖

3 多肽化學合成與純化技術未來發展

隨著科技的進步，生產肽的方法不斷發展。常用的生產方式包括酸解法、固相合成法等，多肽固相合成將目的肽氨基酸C 端通過共價鍵與固相載體連接，多肽固相合成法不斷完善能夠合成具有生物活性的多肽，但仍存在直接合成序列短、合成效率低等問題。多肽液相分段合成作用日益突出，多肽液相分段合成天然化學連接存在一些局限，施陶丁格連接法為多肽片段連接途徑開拓廣闊的思路。

多肽組合技術為快速合成生物活性肽類化合物提供全新的思路，組合化學技術需要相關科學的發展完善。多肽組合化學技術應用需要有先進的分離純化手段配套，敏感有效快速的分析鑒定手段。活性多肽的研究為動物生理化學等學科提供廣泛的研究領域，如何實現高效率分離純化與檢測鑒定等成為研究的熱點。生物制品分離純化技術對推動我國多肽類保健食品產業化具有重要意義，各種新的分析方法及聯用技術推動其研究進展。我國活性多肽將在分離純化方法深度研究、多肽結構化學銹蝕等領域開展更多攻關。目前國內對酪啡肽研究停留于結構層次，生物活性肽研究突破食物蛋白僅提供氨基酸的舊概念，如何進行低成本大批量生產等成為新的研究熱點。

4 結語

隨著醫療衛生方面對多肽產品需求日益增加，多肽合成技術的出現有助于解決多肽類為主要成分的重要應用需求問題，應用多肽合成技術合成多肽滿足中藥資源需求。多肽產業高速發展需要更加方便有效易于實現規模化生產的合成及分離純化技術。目前多肽產業發展面臨研發諸多問題，應通過完善原有技術等途徑保證多肽產業的發展。多肽組合化學技術應用需要設計合成策略，在多肽藥物開發中應用組合化學技術作為尋找肽類藥物先導化合物工具。