多西環素聯合甲硝唑干預對LPS誘導的大鼠子宮內膜炎Th1/Th2的影響

姚 祺,林東梅,林臻影,楊燕燕,莊躍宏

(1.福州市第二醫院,福建 福州 350007;2.福建中醫藥大學動物實驗中心,福建 福州 350007;3.福建醫科大學基礎醫學院,福建 福州 350007)

子宮內膜炎作為一種慢性炎癥,長期反復感染可能導致子宮內膜細胞的免疫平衡失調,從而影響胚胎著床[1-2]。臨床研究表明,子宮內膜炎患者存在Th1/Th2免疫偏向,即免疫應答偏向于炎癥反應,而抑制胚胎植入所需的免疫耐受性反應[3-5]。目前,臨床上治療子宮內膜炎的主要方法是經驗性抗生素治療。多西環素聯合甲硝唑聯合用藥已成為一線治療方案,環丙沙星也被廣泛采用[6-7]。許多臨床研究顯示,口服抗生素可以改善妊娠結局,但其具體機制仍不完全清楚[8]。Th細胞能夠分泌不同炎癥因子,介導細胞免疫應答,子宮內膜炎進展中,炎癥導致大量細胞因子,如腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α),細胞介素-2(Interleukin-2,IL-2)、白細胞介素-4(Interleukin-4,IL-4)、白細胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)等產生[9-10]。而在藥物長期治療中,由于耐藥性等因素導致患者病情反復發作,為促進子宮內膜炎疾病治療的效果,因此,本研究于2022年6月至2022年12月選取50只無特定病原體(Specific Pathogen Free,SPF)級實驗大鼠成功孕育的SD雌性大鼠,飼養在福建中醫藥大學動物實驗中心,探討應用多西環素聯合甲硝唑用藥觀察聯合用藥對慢性子宮內膜炎(Chronicendometritis,CE)大鼠的Th1/Th2作用機制及效果,為慢性子宮內膜炎治療提供建議。

1 資料與方法

1.1 試驗動物造模及分組

研究時間:2022年6月至2022年12月。選取50只SPF級實驗大鼠成功孕育的SD雌性大鼠,飼養在動物實驗中心,根據隨機數字表法分為包括空白組、大鼠子宮內膜炎(CE)模型組、多西環素干預組、甲硝唑干預組及聯合用藥組,每組含10只大鼠,實驗動物均在相同時間段出生,體重控制在(220±20)g,以符合實驗相關標準。實驗室溫度被保持在18℃～26℃,相對濕度維持在45%～70%,光照強度在200～350照度,每天有12h的光照和12h的暗周期,且維持通風環境。實驗過程中動物自由飲水攝食,喂養飼料相同,飼鼠所用飼料和墊料均由實驗動物中心提供。SPF級實驗大鼠在適應性喂養一周后,空白組大鼠不接受任何干預處理,其余4組大鼠經適量麻醉藥劑麻醉松弛,將麻醉后大鼠倒提,向子宮內推注脂多糖(LSP),2.5～5 mL·kg-1的LSP,灌注12～24h后,建立大鼠CE模型,后連續灌胃給藥14d,同時模型組灌服生理鹽水90 mg·(kg·d)-1,多西環素干預組加以30 mg·(kg·d)-1灌胃多西環素片,甲硝唑干預組加以20 mg·(kg·d)-1灌胃甲硝唑,聯合用藥組灌胃多西環素30 mg·(kg·d)-1+甲硝唑20 mg·(kg·d)-1。本研究內容經本院倫理學委員會審閱同意開展本次研究。

1.2 取材、切片方法

不同干預組末次給藥2h后,取出大鼠稱取體重,后處死大鼠,麻醉后取腹主動脈血并分離血清,置于-80℃冰箱備用;解剖分離并稱取子宮部位及附件等臟器重量,置于-80℃冰箱備用;部分組織固定,制作蘇木精-伊紅法(HE)染色切片。

1.3 RNA的提取、逆轉錄及實時熒光 PCR法

提取大鼠子宮組織RNA,于-80℃冰箱取出子宮組織,在電子天平上稱取約200mg,加入 800μL RNAiso Plus Total RNA 提取試劑,提取組織中總 RNA,One drop 儀器測定總 RNA 濃度,取 2.50 μg總RNA作為模板反轉為 cDNA。同時按10μL實時熒光定量 PCR反應體系,反應條件為95 ℃,變性5min;95 ℃,10 s,60 ℃,30 s,72 ℃,30 s,共40個循環;溶解曲線條件為95 ℃,15 s,65 ℃,15 s,95 ℃,continues。同時根據溶解曲線判斷PCR產物純度,分析mRNA相對表達量。引物序列如表1。

表1 不同炎癥因子qRT-PCR引物序列

1.4 觀察指標

(1) 觀察不同分組大鼠子宮組織形態、子宮指數及病理改變。(2)取腹主動脈血通過酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測腫瘤壞死因子-α(TNF-α),白細胞介素2/4/6水平,同時通過全自動流式細胞儀檢測Th1細胞亞群分泌TNF-α和IL-2,Th2細胞亞群分泌IL-4和IL-6,并計算Th1/Th2。(3) 實時定量RT-PCR檢測子宮組織TNF-α、IL-2、IL-4、IL-6表達水平。

1.5 統計學方法

2 結果

2.1 不同子宮內膜炎模型組子宮組織病理學變化情況

不同組大鼠子宮組織病理學變化如圖1所示,模型組較空白組大鼠子宮宮腔出現粘連不全現象,子宮內膜水腫、血管充血,有炎癥浸潤表現,多西環素、甲硝唑單一干預下宮腔粘連、水腫、充血有所改善,內膜損傷較輕,聯合組干預下宮腔無粘連,水腫、充血改善顯著,無明顯內膜損傷情況。

2.2 不同子宮內膜炎模型組Th1/Th2比較

不同大鼠子宮內膜炎模型組Th1、Th2、Th1/Th2水平具有統計學差異,P<0.05,多西環素組、甲硝唑組及聯合用藥組Th1/Th2水平較模型組下降(P<0.05),且聯合用藥組較多西環素、甲硝唑單一用藥改善更顯著(P<0.05),差異具有統計學意義。結果見表2。

表2 不同大鼠子宮內膜炎干預模型的炎癥因子比較

2.3 不同子宮內膜炎模型組TNF-α、IL-2、IL-4、IL-6 mRNA表達情況

與空白組比較,子宮內膜炎模型組TNF-α、IL-4、IL-6mRNA水平降低(P<0.05),IL-2mRNA水平升高(P<0.05);與模型組相比,聯合用藥組TNF-α、IL-4、IL-6mRNA水平顯著降低(P<0.05),IL-2mRNA水平顯著升高(P<0.05),差異具有統計學意義。結果見圖2。

3 討論

近年慢性子宮內膜炎的發病率逐漸上升,給育齡婦女的身體健康和生育健康帶來了嚴重挑戰。子宮內膜炎的發病機制涉及多個因素,其中免疫失衡是一個重要的方面[11]。在子宮內膜炎的炎癥環境中,Th1細胞和Th2細胞的免疫應答出現偏向失衡,調節Th1/Th2細胞的免疫平衡,也成為治療子宮內膜炎的重要策略之一[12-14]。為了深入研究子宮內膜炎治療,本研究選擇了LPS誘導的大鼠子宮內膜炎模型,探索多西環素與甲硝唑聯合用藥干預下大鼠子宮組織炎癥因子表達及治療效果。

本研究中,炎癥因子的水平也在不同組間呈現差異。既往的研究表明,該聯合干預方案能夠顯著改善子宮內膜炎模型大鼠的癥狀和炎癥反應[15]。實驗結果表明,經聯合用藥處理后,大鼠子宮內膜的水腫、血管充血和炎癥浸潤現象均呈明顯減輕。同時本研究結果在姚琪[6]等人研究中也有證明,多西環素聯合甲硝唑用藥下明顯緩解子宮內膜損傷、壞死、細胞浸潤等,改善子宮內膜組織受損。研究表明TNF-α、IL-2/4/6等作為重要的炎癥細胞因子,能夠觸發炎癥細胞級聯反應從而激活或擴大炎癥反應[16-18]。Th細胞作為調控免疫應答的關鍵細胞,正常條件下Th1/Th2處于平衡狀態,研究模型組大鼠Th1/Th2明顯失衡,CD4+T細胞過度活化,導致炎癥反應的持續性和加重,進而可能加速大鼠CE的進展,多西環素、甲硝唑及聯合用藥組Th1/Th2失衡得到一定控制,同時聯合組Th1/Th2失衡改善更明顯,也提示聯合用藥有抑制CD4+T細胞增殖能力,引導Th2分化。而在不同造模組大鼠子宮組織中促炎細胞因子mRNA的檢測中,聯合組用藥對TNF-α、IL-2/4/6表達水平有顯著影響,減輕了子宮組織炎性反應。同時提示多西環素及甲硝唑聯用可能通過調節免疫失衡和抑制炎癥反應,影響免疫應答,發揮對子宮內膜炎的保護作用,可能是治療子宮內膜炎的作用機制之一。然而,本研究存在一定的局限性,研究尚需要臨床治療驗證,同時對于多西環素聯合甲硝唑治療子宮內膜炎的確切機制還需進一步深入研究,包括分子水平和細胞水平的機制分析等。

綜上所述,本研究表明多西環素聯合甲硝唑干預能夠改善子宮內膜炎模型大鼠的癥狀和炎癥反應,可能通過調節炎癥因子的水平來影響免疫應答。同時研究需進一步探究作用機制,以期為子宮內膜炎的治療提供更加科學和有效的策略和方法。