高效液相色譜法測定萬古霉素血藥濃度的分析與研究

蘇洪濤,藍 妮

(廈門大學附屬第一醫院,福建 廈門 361000)

萬古霉素是一種廣譜抗生素,常用于治療多種感染疾病,為了確保該藥物的療效和安全性,需要進行血藥濃度監測[1]。HPLC被廣泛應用于萬古霉素血藥濃度的分析與研究[2]。HPLC是一種常用的分離和定量分析技術,HPLC基本原理是將待測樣品通過一個固定填充物的柱子進行分離。樣品溶解于流動相中,并由一液體泵推動流經柱子的流動相。在柱子內部存在著一種固定的填充物,稱為固定相[3]。樣品中的組分會根據其與固定相的親疏水性質的不同以及其他化學相互作用的差異,在流動相的作用下分離出來。分離出的各個組分可通過檢測器進行監測和定量。HPLC中的流動相通常為有機溶劑和水的混合物,根據樣品的性質和分離要求進行選擇和調節,流動相的選擇對分離效果和分析速度有重要影響[4]。進樣器用于將待測樣品精確地引入流動相中,常見的進樣方式包括手動進樣和自動進樣系統。柱子是HPLC的核心組件,也稱為色譜柱或固定相柱,柱子內部填充有具有特定吸附性質的顆粒狀材料,如硅膠、碳氫化合物、反相材料等,不同的柱子和填充物適用于不同的分離類型。檢測器用于檢測樣品在柱子中分離過程中的化學或物理性質的變化,常見的檢測器包括紫外-可見光譜檢測器、熒光檢測器、電化學檢測器等[5]。數據系統用于采集、處理和分析檢測器得到的數據,通過數據系統可以實現峰面積的計算、峰識別和結果輸出等功能。HPLC技術具有高分辨率、高靈敏度、高重復性等優點,能夠同時分析多種組分,且可用于定量分析和結構鑒定[6]。本文采用去甲基萬古霉素作為內標,對萬古霉素血藥濃度進行了檢測,結果準確、簡便,現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器與試藥

島津高效液相色譜儀:LC-20AB泵,SIL-20A型全自動進樣器,CTO-20A型色譜柱,SPD-20AV型紫外線檢測器,DGU-20A3型在線脫氣裝置,LC-解決方案工作站;Millipore Simplicity純水儀;Eppendorff Centrifuge 5804R低溫高速離心機;AL 104-IC電子天平;XH-B型漩渦混合器。

萬古霉素對照品,去甲萬古霉素對照品,色譜純為乙腈,分析純為磷酸二氫鉀及磷酸,水為Millipore水儀制得的超純水。

1.2 實驗方法

1.2.1 色譜條件

色譜柱:依利特Hypersil BDSC8(4.6mm×250mm,5μm),40℃柱溫;流動相:20 mmol磷酸二氫鉀,pH值調節到3.1;采用梯度洗脫,條件如下:0～6.5min,B為乙腈,從10%下降到5%;6.5～6.51 min,B為50%;10.0～10.01min,B由5%上升到10%,10.01～17.5 min,B為10%。流速1.0 mL/min;檢測波長236 nm;進樣量20μL內標法定量。

1.2.2 流動相的配制

精確稱取1.361 g磷酸二氫鉀,將其溶于500 mL超純水中,再添加100 μL磷酸,在溶解和均勻混合之后,用0.45μm的水相濾膜進行過濾,得到pH為3.1的20 mmol/L的磷酸二氫鉀溶液。

1.2.3 儲備液的配制

對照品儲備液:取10 mL容量瓶,準確稱量適當數量的萬古霉素參照物,以超純水溶解,定容后得萬古霉素參照物1.05 mg/mL;將1mL的溶液置于10mL的容量瓶內,用超純水稀釋至刻度后,經充分攪拌后,得105mL的標準溶液,于4℃冷藏保存。

內標工作液:精確稱取去甲萬古霉素對照品適量,將其放入25 mL的容量瓶中,以超純水溶于定容,攪拌均勻,制成200 mg/L的內標液。并在4℃下冷藏。

1.2.4 血樣處理

取血漿樣品0.4 mL,放入2.0 mL的離心管內,加入25 μL的內標液,攪拌均勻后,加入乙腈0.8 mL,漩渦振動3min,14000 r/min的離心8min,再將1 mL的上清液放入玻璃試管,再加二氯甲烷3 mL,漩渦振動3min,3000 r/min的離心6min,再將20 mL的上清液放入樣品。定量采用內標法。

2 結果

2.1 線性關系考察

取一份空白血漿,并精確地添加不同量的萬古霉素對照品儲備液,使血漿中的藥物濃度分別為1.313、2.625、5.25、10.5、26.25、52.5、105 mg/L,按照血樣進行處理,以被測物峰面積與內標峰面積的比值Y對X(mg/L)進行線性回歸,權重為1/X。得回歸方程為:Y=0.0620X+0.1020,r=0.9990。本實驗的線性范圍為1.310～105.00 mg/L,最低檢測濃度(S/N≥3)為0.658 mg/L。

2.2 方法的專屬性考察

采用不同的樣品前處理方式及層析分離條件,分別測定了空白血漿、內標物及對照品及內標物的層析圖譜。在萬古霉素的出峰位置,去甲萬古素的出峰位置,沒有顯著雜質干擾,內標萬古霉素保留時間為4.65min,去甲萬古素的保留時間為5.55min。

2.3 回收率試驗

絕對回收率:精密抽取對照品儲備液,配制出濃度為5.25、26.25、78.75 mg/L的含藥血漿各5份,按照血樣進行處理進樣,將兩者峰面積進行記錄,并將其與相應濃度對照品峰面積進行對比,得出絕對回收率,3種濃度血漿樣品的絕對回收率(n=5)分別為66.58%、70.51%、69.79%,去甲萬古的回收率(n=5)為73.88%。

方法回收率:將三種濃度分別配制成5.25、26.25、78.75 mg/L的含藥血漿,每一種濃度分別為5份,將其作為血液樣品進行處理,然后進樣,對其濃度進行測定,并對其進行計算,從而計算出檢出量與添加量的比值,從而得到方法的回收率。見表1。

表1 相對回收率與精密度

2.4 精密度試驗

配制出5.25、26.25、78.75 mg/L三種濃度的含藥血漿,各5份,將其作為血液樣品進行處理,在同一天進行測量,并連續測量4天,計算出日內和日間的精密度。見表1。

3 討論

萬古霉素是一種廣譜抗生素,屬于糖肽類抗生素,它是一種通過抑制細菌細胞壁合成而發揮作用的藥物[7]。萬古霉素主要用于治療由對其他抗生素耐藥的細菌引起的感染,萬古霉素可通過靜脈注射或靜脈滴注進行給藥,通常在醫院的嚴密監測下使用[8]。萬古霉素的副作用相對較少,但仍可能出現一些不良反應,包括過敏反應、紅斑性瘙癢病、腎功能損傷等。此外,長期使用萬古霉素可能導致腸道菌群失調,增加耐藥菌感染的風險。在使用萬古霉素之前,應該先進行細菌敏感性測試,以確定細菌對該藥物的敏感性,此外,患者需要定期進行肝功能和腎功能的監測,以確保安全使用。HPLC是一種精準、靈敏且可靠的分析技術,常用于藥物血藥濃度的測定,在萬古霉素的分析中,HPLC能夠有效地分離和定量目標藥物,并且具有較高的分析速度和準確性[9]。在進行萬古霉素血藥濃度的HPLC分析之前,需要對血液樣品進行適當的制備,通常采用蛋白沉淀、提取等方法將萬古霉素從血液中分離出來,然后使用合適的溶劑進行稀釋和洗脫以得到待測樣品。為了實現準確的血藥濃度測定,需要建立萬古霉素的標準校準曲線,繪制得到校準曲線,并根據曲線計算樣品中萬古霉素的濃度[10]。此外,還需要在分析過程中加入質控樣品進行質量控制,以確保分析結果的準確性和可靠性。

HPLC可以檢測非常低的濃度,能夠確定萬古霉素在血液中的濃度;HPLC能夠通過優化分離柱和流動相的條件,實現對萬古霉素與其他組分的有效分離,從而避免干擾物質對測定結果的影響;HPLC具有良好的定量能力和可重復性,能夠提供準確的萬古霉素濃度數據;HPLC是一種高效的分析方法,能夠在較短的時間內完成樣品的分離和測定,提高工作效率;HPLC可以根據需要選擇不同類型的柱和檢測方式,適應不同樣品類型和分析要求,使其具有很大的靈活性[11-12]。綜上所述,HPLC作為一種高靈敏度、高選擇性、高精確度和重復性的分析技術,是測定萬古霉素血藥濃度的理想方法之一。本文研究結果顯示,本測定法在1.310～105.00 mg/L有較好線性關系(r=0.9990),日內、日間精密度均≤5.21%,絕對回收率>66%。

綜上所述,HPLC法檢測血液中萬古霉素的含量,具有快速、可靠、結果準確等優點。