牛羊乳比例對Malatya干酪成熟品質(zhì)及抗氧化特性的影響

賈麗麗，王家栩，李嘉欣，王志敏，張密霞，馬春麗

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，乳品科學(xué)教育部重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150030）

Malatya干酪原產(chǎn)自塞浦路斯，是一種農(nóng)家Halloumi干酪。Halloumi干酪屬于一種成熟期較短的干酪，它采用獨特的酸凝和鹽水腌制工藝，從而使其具有致密的結(jié)構(gòu)和柔韌的口感[1]。同時，Malatya干酪還是一種高溫干酪，其燙漂工藝極具特色。最初的Halloumi干酪均是采用羊乳制作而成，近年來，Halloumi干酪開始混合牛羊乳制作，不僅可以綜合2 種乳源的優(yōu)點，還可以適當(dāng)降低成本[2-3]。

乳蛋白被認為是抗氧化活性物質(zhì)最重要的來源，這些抗氧化物質(zhì)主要是乳蛋白水解的小分子肽[4]，而干酪由于自身特點成為最重要的小分子肽來源[5]。研究發(fā)現(xiàn)干酪的抗氧化活性來源于成熟期蛋白的初級和深度水解，這一過程受乳蛋白來源、組成、含量等多方面影響[6]。相比于牛乳，羊乳中蛋白質(zhì)和脂肪含量更高。此外，羊乳中β-酪蛋白和αs2-酪蛋白含量高于牛乳，而牛乳中αs1-酪蛋白含量高于羊乳[7]。研究報道β-酪蛋白、αs2-酪蛋白及κ-酪蛋白是潛在的抗氧化肽前體[8-9]。盡管不同物種間的蛋白質(zhì)具有同源性，但仍具有一定的特異性，這也是導(dǎo)致不同乳蛋白制備干酪的抗氧化活性不同原因之一[10-11]。除了酪蛋白差異外，羊乳與牛乳在乳清蛋白、β-胡蘿卜素、中短鏈脂肪酸等成分組成上也不盡相同[12]，這些因素是影響干酪化學(xué)、物理及感官性質(zhì)的重要因素。先前的研究報道了混合牛羊乳制備新鮮干酪的理化特性及感官品質(zhì)，發(fā)現(xiàn)二者可以互補，恰當(dāng)?shù)谋壤梢灾谱鞲鼉?yōu)良的干酪[13-14]。

截止目前，國內(nèi)外鮮見關(guān)于牛羊乳混合制備Halloumi干酪中Malatya干酪的研究報道，對Malatya干酪成熟期品質(zhì)及抗氧化活性的變化機制探究是不清晰的。因此，本研究以牛羊乳比例分別為1∶0、3∶1、1∶1、1∶3、0∶1制備5 組Malatya干酪，研究摻入不同比例牛羊乳對傳統(tǒng)Malatya干酪得率、理化特性、質(zhì)構(gòu)、色值、熔融溫度和感官品質(zhì)的影響，以及對成熟期不同階段干酪蛋白水解性能及抗氧化活性的影響。以期為高品質(zhì)及高抗氧化性能的Malatya干酪開發(fā)提供全新的思路與技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料乳（新鮮羊乳、牛乳）黑龍江哈爾濱市香坊農(nóng)場；商業(yè)發(fā)酵劑（包含嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌）、凝乳酶（薩科凝乳酶）、福林-酚試劑 科漢森（北京）貿(mào)易有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）美國Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HYCV-30小型干酪機 黑龍江赫益乳業(yè)科技公司；K9840自動凱氏定氮儀 山東濟南海能儀器有限公司；UV-2600分光光度計 島津儀器（蘇州）有限公司；TA.XT Plus C質(zhì)構(gòu)儀 英國Stable Micro System公司；SA402B電子舌 日本Insent公司；PEN3電子鼻德國Airsense公司；XF-3A型水分活度儀 廈門雄發(fā)儀器儀表有限公司；pilot10-15EP真空冷凍干燥機北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；Discovery DSC250差示掃描量熱儀 美國TA儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 Malatya干酪的制作

參照Hayaloglu等[15]方法生產(chǎn)Malatya干酪，實驗組：牛羊乳質(zhì)量比分別為1∶0、3∶1、1∶1、1∶3、0∶1，干酪的生產(chǎn)工藝流程：

原料乳→巴氏殺菌（68 ℃，30 min）→冷卻（32～34 ℃）→添加商業(yè)發(fā)酵劑（發(fā)酵30 min）→添加0.015 g/100 mL氯化鈣、0.01 g/100 mL凝乳酶→凝乳40 min切割，靜置5 min→加熱排乳清（38～41 ℃）→壓榨成型→85 ℃熱乳清燙漂成型→排乳清→質(zhì)量分數(shù)5%干鹽鹽漬→真空包裝→4 ℃保存。

1.3.2 干酪得率的測定

計算干酪得率需要稱量并記錄原料乳、發(fā)酵劑、凝乳酶、食用鹽以及干酪成品的質(zhì)量。干酪得率按式（1）計算：

1.3.3 干酪組分測定

水分含量采用GB 5009.238—2016《食品水分活度的測定》中直接干燥法測定；蛋白質(zhì)含量采用GB 5009.5—2016《食品中蛋白質(zhì)的測定》中自動凱氏定氮法測定；水分活度參考GB 5009.238—2016《食品水分活度的測定》測定。pH值用pH計測定，將1 g干酪溶于10 mL去離子水中，混合并均質(zhì)，用pH計探頭直接進行測定。

1.3.4 干酪質(zhì)構(gòu)的測定

對干酪成熟期每個月取樣進行質(zhì)構(gòu)測定。參照Liu Lu等[16]方法，將干酪切成（2±0.06）cm3，樣品待測前統(tǒng)一放置在4 ℃，以防止溫度對產(chǎn)品質(zhì)地產(chǎn)生影響。質(zhì)構(gòu)儀參數(shù)：測試速率為1.0 mm/s，探頭前后測定速率為5.0 mm/s，壓縮比為30%，觸發(fā)值為5 g；第1次和第2次按壓之間的時間為5.0 s，探針類型為P/0.5。

1.3.5 熔融溫度的測定

參考趙賽楠[17]的方法，采用差示掃描量熱法（differential scanning calorimetry，DSC）測定干酪的熔融溫度，并稍作修改。稱取大約5 mg干酪樣品于鋁制坩堝中，樣品在50 ℃平衡5 min，以10 ℃/min的速率升溫至200 ℃，樣品測定時放置空坩堝作為空白對照。用前進行儀器校正，最終得到溫度與功率的變化曲線。

1.3.6 色值測定

參考Ibá?ez等[18]方法。每個干酪樣本隨機選擇5 個不重疊的位置進行測定，每個位置測定3 次，L*值代表樣品的亮度值，b*值代表樣品從藍色到黃色的程度，最終結(jié)果取多次測定的平均值。按式（2）計算白度值：

1.3.7 電子鼻分析

參照?tefániková等[19]方法并稍作修改。將2.5 g樣品放在Heracles II電子鼻配套的頂空瓶中封口。在50 ℃的儀器恒溫培養(yǎng)箱中靜態(tài)培養(yǎng)15 min，使用頂空自動進樣器注射器取出5 mL體積的頂空氣態(tài)化合物，分配到電子鼻注射器中用于每次分析。使用軟件Alpha Soft V14（Alpha M.O.S.）將測得的峰值進行建庫和主成分分析（principal component analysis，PCA）。電子鼻的10 個傳感器S1～S10：W1C為芳烴化合物；W5S為氮氧化物；W3C為氨，芳香分子；W6S為氫化物；W5C為烯烴，芳族，極性分子；W1S為甲基類；W1W為硫化合物；W2S為檢測醇，部分芳香族化合物；W2W為芳烴化合物，含硫有機化合物；W3S為烷類和脂肪族。

1.3.8 電子舌分析

干酪電子舌的測定采用Lipkowitz等[20]方法，并稍作修改。準確稱取3 g干酪，磨碎并溶于90 mL超純水均質(zhì)。將提取物離心（4 000 r/min、30 min）。除去上層脂肪，過濾，取70 mL濾液置于專屬燒杯中，使用電子舌儀器進行測定。

1.3.9 感官評價

參考Kaminarides等[21]的方法對成熟90 d Malatya干酪進行感官評價，由10 名測評成員（5 男5 女）組成，年齡均在20～28 歲之間，按照10 分量表對奶酪的味道（酸、甜、咸、苦、奶油味、乳味）、質(zhì)地（易碎、有嚼勁、有彈性、顆粒大小）和外觀（顏色、光滑度、孔眼）進行評分，最差的評分為1，最好的評分為10。味道和質(zhì)地屬性被賦予比外觀更高的優(yōu)先級，其得分分別乘以5和4。最終得分取平均值。每個測評員測定完一個樣品都需要漱口。

1.3.10 干酪水溶性提取物的制備

參考Liu Lu等[22]方法，稍作修改，將50 g奶酪磨碎，用200 mL去離子水均質(zhì)。將混合物以1 000 r/min均質(zhì)5 min，并在40 ℃水浴1 h。然后將混合物離心（4 ℃、3 000 r/min、10 min）。去除沉淀后，滲透液通過濾紙過濾，獲得干酪的水溶性提取物。所得濾液冷凍干燥后放于－20 ℃儲存。

1.3.11 pH 4.6-可溶性氮（soluble nitrogen，SN）含量的測定

根據(jù)宮春穎等[23]方法并稍作修改，準確稱取每個成熟期的干酪5 g，加入60 mL pH 4.6醋酸鹽緩沖溶液，60 ℃水浴1 h，離心（4 ℃、3 000 r/min，20 min），取上清液，移入消化瓶中進行凱氏定氮，最終結(jié)果以占干酪總氮量的百分數(shù)表示。

1.3.12 三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）-SN含量的測定

TCA-SN含量參考宮春穎等[23]方法并稍作修改，取上述1.3.11節(jié)中的上清液16 mL，加入體積分數(shù)12% TCA溶液4 mL，混合靜置1 h，取上清液定量移入消化瓶中進行凱氏定氮，最終結(jié)果仍以占干酪總氮量的百分數(shù)表示。

1.3.13 干酪總游離氨基酸含量的測定

采用改良的鎘-茚三酮法測定。取1 mL干酪水溶性溶液，與1 mL的鎘-茚三酮試劑混合，84 ℃加熱5 min，同時做空白實驗，冷卻后于507 nm波長處測定吸光度。利用甘氨酸的標準曲線計算總游離氨基酸含量。

1.3.14 干酪抗氧化活性的測定

1.3.14.1 DPPH自由基清除活性

使用Rai等[24]描述的方法測定DPPH自由基清除活性。取200 μL干酪水溶性提取物，添加2 mL 0.16 mmol/L DPPH自由基溶液，在室溫黑暗中培養(yǎng)30 min，使用分光光度計在517 nm波長處測量吸光度。按式（3）計算DPPH自由基清除率：

式中：A0為樣品的吸光度；A1為包含200 μL樣品和2 mL甲醇溶液的樣品空白的吸光度；A2為包含200 μL甲醇溶液和2 mL DPPH自由基溶液的對照吸光度。

1.3.14.2 還原抗氧化力

為了確定還原電位活性，采用Rai等[24]描述的方法。取100 μL干酪水溶性提取物，添加900 μL pH 6.6的0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液和900 μL質(zhì)量分數(shù)1%鐵氰化鉀溶液，充分混合，于50 ℃培養(yǎng)20 min，添加900 μL質(zhì)量分數(shù)10%三氯乙酸溶液，混合離心（8 000 r/min、10 min）。取900 μL上清液與等體積蒸餾水和質(zhì)量分數(shù)0.1% FeCl3溶液混合。用分光光度計在700 nm波長處測定還原活性。

1.3.14.3 超氧陰離子自由基清除活性

使用Rai等[24]描述的方法測定超氧陰離子自由基清除活性。取干酪水溶性提取物200 μL，加入1.8 mL磷酸鹽緩沖液（50 mmol/L，pH 8.2），然后加入3 mmol/L鄰苯三酚，溶于10 mmol/L HCl溶液中。在0 min和10 min時，使用分光光度計在325 nm波長處測量超氧陰離子自由基清除活性的吸光度。按式（4）計算超氧陰離子自由基清除率：

式中：A0和A10為干酪樣品在第0和10分鐘的吸光度；A0對和A10對為對照組（200 μL蒸餾水和2 mL pH 8.2的50 mmol/L磷酸鹽緩沖液）在第0和10分鐘的吸光度。

1.3.14.4 總抗氧化能力

采用Rai等[25]的方法測定干酪總抗氧化能力。向200 μL干酪水溶性提取物中添加3 mL試劑溶液（0.6 mol/L硫酸、28 mmol/L磷酸鈉、4 mmol/L鉬酸銨體積比為1∶1∶1）。將反應(yīng)混合物在95 ℃水浴培養(yǎng)90 min，然后冷卻至室溫，于695 nm波長處測定總抗氧化能力。

1.4 統(tǒng)計與分析

2 結(jié)果與分析

2.1 摻入不同比例牛乳對Malatya干酪得率的影響

由表1可知，不同比例的牛羊乳制備的Malatya干酪得率介于（10.90±0.20）%～（12.10±0.26）%之間。隨著羊乳比例升高，干酪得率呈現(xiàn)逐漸上升趨勢。純羊乳組干酪的得率最高，為（12.10±0.26）%，且摻入50%牛乳的干酪得率與純羊乳組無顯著差異（P＞0.05），這與趙賽楠等[26]的研究結(jié)果一致，羊乳比例更高，Halloumi干酪得率更高。產(chǎn)生這種結(jié)果的原因可能是原料乳中的營養(yǎng)成分存在差異，從而影響干酪得率。據(jù)報道羊乳中蛋白質(zhì)和脂肪含量高于牛乳，特別是β-酪蛋白[7]。

2.2 摻入不同比例牛乳對Malatya干酪理化性質(zhì)的影響

由圖1A可知，不同比例的牛羊乳制備的Malatya干酪的蛋白含量具有顯著差異（P＜0.05）。干酪中羊乳比例越高，蛋白質(zhì)含量增加。這與不同比例牛羊乳對干酪得率的影響一致，即蛋白質(zhì)含量更高的羊乳能夠增加制備的干酪中蛋白含量，進而增加干酪產(chǎn)量。此外，研究發(fā)現(xiàn)干酪成熟對蛋白質(zhì)含量也具有一定的影響，干酪成熟初期乳酸菌和各種酶代謝使蛋白質(zhì)發(fā)生一部分溶解，之后乳酸菌衰退自溶使蛋白質(zhì)含量處于穩(wěn)定狀態(tài)[27]。

圖1 牛羊乳比例對Malatya干酪理化性質(zhì)的影響Fig.1 Effect of cow to goat milk ratio on the physicochemical properties of Malatya cheese

不同的牛羊乳比例對成熟期干酪pH值的影響如圖1B所示，新鮮制備的所有干酪pH值介于5.25～5.36之間。Hayaloglu等[28]對多種土耳其干酪的調(diào)查中也報道了相似的結(jié)果，Malatya干酪pH值介于5.2～6.1之間。隨著成熟時間的延長，所有干酪的pH值逐漸降低。這是由于添加了作為發(fā)酵劑的乳酸菌，隨著成熟時間延長，乳酸菌增強了蛋白水解，從而降低干酪pH值。

水分含量是指干酪中自由水和結(jié)合水的總和，而水分活度指的是食品中自由水的含量，與干酪保質(zhì)期相關(guān)，是影響食品中微生物生長和繁殖最有力的證據(jù)。不同的牛羊乳比例導(dǎo)致制備的干酪水分含量和水分活度具有差異（圖1C、D）。羊乳比例更高的干酪含有更低的水分含量；隨著成熟時間的延長，水分活度與水分含量具有相同的變化趨勢。研究發(fā)現(xiàn)羊乳中的蛋白凝塊細且乳化狀態(tài)好，脂肪球粒徑更小，其蛋白-脂肪結(jié)構(gòu)體系更加致密，因此羊乳比例更高的干酪水分含量更低[29]。此外，在成熟期前60 d，所有干酪的水分含量和水分活度呈快速下降的趨勢，而在成熟期最后30 d則趨于穩(wěn)定。成熟初期干酪中各種大分子物質(zhì)逐漸被分解為小分子物質(zhì)，網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)遭到破壞，從而使結(jié)合水流失[30]。成熟后期干酪中蛋白質(zhì)等成分分解基本完成，從而結(jié)構(gòu)趨于穩(wěn)定，水分流失也逐漸緩和。

2.3 摻入不同比例牛乳對Malatya干酪質(zhì)構(gòu)的影響

不同牛羊乳比例對Malatya干酪成熟期的硬度、彈性、凝聚性和咀嚼性的影響如表2所示。干酪成熟初期，摻入牛乳比例增加，干酪的硬度和咀嚼性顯著降低（P＜0.05），純羊乳組干酪的硬度和咀嚼性最大。摻入牛乳的比例對干酪彈性和凝聚力方面影響并不顯著（P＞0.05），這可能是因為凝聚力和彈性與酪蛋白分子的大小及變性程度密切相關(guān)，經(jīng)過壓榨和熱燙后，Malatya干酪中的蛋白經(jīng)過重塑表現(xiàn)出較為相近的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[26]。此外，隨著成熟期的延長，干酪的質(zhì)構(gòu)特征有顯著變化（P＜0.05），主要表現(xiàn)為成熟期30～60 d期間干酪的硬度明顯降低，以及整個成熟期間干酪的黏彈性和咀嚼性逐漸降低。產(chǎn)生這些變化的原因是成熟前期蛋白質(zhì)和脂肪逐漸分解，改變干酪內(nèi)部的空間結(jié)構(gòu)，進而影響干酪的硬度、黏彈性和咀嚼性。

表2 牛羊乳的比例對Malatya干酪質(zhì)構(gòu)的影響Table 2 Effect of cow to goat milk ratio on the texture of Malatya cheese

2.4 摻入不同比例牛乳對Malatya干酪熔融溫度的影響

Malatya干酪常被用作燒烤原料，了解干酪凝塊的熱力學(xué)特性對于把握其在食品加工應(yīng)用中的特性具有積極作用。干酪成熟期結(jié)束時，檢測了不同比例牛羊乳制備干酪的DSC熱變曲線。由圖2可知，所有干酪100～130 ℃出現(xiàn)一個向下的吸熱峰，該峰值溫度即樣品發(fā)生熔融時的溫度。這一溫度主要反映干酪中蛋白質(zhì)熱變性溫度，特別是酪蛋白[31]。隨著羊乳比例的增加，干酪的吸熱峰明顯地向右遷移，牛羊乳比例為0∶1時，干酪熔融溫度達到最大。由此推測摻入不同比例的牛乳對干酪中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及聚集程度產(chǎn)生不同程度的影響，從而導(dǎo)致干酪的熔融溫度發(fā)生改變。蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性與干酪熔融溫度密切相關(guān)，熔融溫度越高標志蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性越好[32]，因此干酪的熱穩(wěn)定性也越好。

圖2 牛羊乳比例對Malatya干酪熔融溫度的影響Fig.2 Effect of cow to sheep milk ratio on melting temperature of Malatya cheese

2.5 摻入不同比例牛乳對Malatya干酪色值的影響

色差是干酪重要的表觀品質(zhì)，影響著消費者的接受度。同時色差值還是乳及其制品發(fā)生美拉德反應(yīng)的標志[33]。由圖3A可知，成熟初期，除純牛乳組外，摻入牛乳的比例對干酪的L*值無顯著影響（P＞0.05）。這表明不同比例牛羊乳新制備的干酪亮度都較高，反映了干酪美拉德進行程度低。隨著成熟時間的延長，干酪的L*值逐漸降低，羊乳比例更高的干酪L*值降低更加緩慢。成熟第90天時各組差異顯著（P＜0.05），純羊乳干酪L*值最高。

圖3 牛羊乳比例對Malatya干酪色差和白度值的影響Fig.3 Effect of cow to goat milk ratio on color parameters and whiteness value of Malatya cheese

如圖3B、C所示，不同比例牛羊乳制備的Malatya干酪在成熟初期b*值和白度值存在顯著差異（P＜0.05），牛乳比例更高的干酪b*值越高，白度值越低。這與干酪中的脂肪有關(guān)，研究表明脂肪球體積大、數(shù)量少會影響光的折射，從而使干酪顏色偏暗沉，進而b*值增加[34]。也有研究報道較小的脂肪球有利于干酪中β-胡蘿卜素與VA之間的轉(zhuǎn)化，這與干酪的白度值相關(guān)[35]。隨著成熟期的延長，所有干酪的b*值增加，白度值顯著降低（P＜0.05）。摻入50%牛乳組干酪的b*值與純羊乳組無顯著差異（P＞0.05）。

2.6 摻入不同比例牛乳對Malatya干酪感官特性的影響

2.6.1 電子鼻

電子鼻可以有效且全面地獲取干酪中揮發(fā)性風(fēng)味化合物的信息。由圖4A可知，W1S、W2S、W6S、W5S對5 組干酪的響應(yīng)值都較大，表明5 組干酪對這4 種傳感器的風(fēng)味特征明顯。5 組干酪對其他6 個傳感器的信號幾乎重疊，說明6 個傳感器檢測出的揮發(fā)性物質(zhì)組成基本一致，無明顯區(qū)分。

圖4 牛羊乳比例對Malatya干酪基于電子鼻和電子舌的風(fēng)味分析（A、C）和PCA（B、D）Fig.4 Flavor analysis (A,C) and principal component analysis (B,D) of Malatya cheese with different cow to goat milk ratios using e-nose and e-tongue

由圖4B可知，PC1和PC2貢獻率分別是80.1%和19.1%。總貢獻率可達99.2%。說明這2 個PC能夠表征干酪樣品的大部分特征。不同樣品之間比較分散，互不重疊，氣味差異較大。由雷達圖可知，與氣味變化最明顯的是甲基類物質(zhì)。純牛乳組與其他組干酪距離較遠，說明純牛乳組干酪與其他4 組干酪風(fēng)味差異最顯著。這與金嫘等[36]使用電子鼻檢測羊乳中摻入牛乳的氣味研究結(jié)果是一致的，摻入牛乳比例越高，氣味越明顯。總的來說電子鼻的雷達分析圖譜和PCA均能很好地區(qū)分這幾組干酪。

2.6.2 電子舌

使用電子舌對不同干酪的風(fēng)味進行分析。電子舌傳感器有酸味、苦味、咸味、澀味、鮮味、濃厚度等幾種。由圖4C可以看出，5 組干酪在酸度、澀味兩方面的值均不大于0，說明這兩種滋味對干酪的影響很小。鮮味、苦味、苦味回味、澀味回味、咸味和濃厚度的響應(yīng)值都大于0，其中濃厚味的值最大，并且5 組干酪是有差別的，這表明不同比例牛羊乳混合制得的干酪可以改變滋味。

由圖4D可知，PC1貢獻率為62.3%，PC2貢獻率為26.1%，總貢獻率為88.4%，超過80%，說明這2 個PC可以有效表征原始數(shù)據(jù)的整體信息特征[37-38]。純羊乳組干酪處于第1象限，純牛乳組和摻入50%牛乳組干酪處于第2象限，而摻入25%牛乳和75%牛乳組干酪處于第3象限，說明純羊乳組干酪可以和純牛乳組、摻入50%牛乳組干酪被PCA很好地表征，說明5 組干酪的味道存在顯著差異（P＜0.05）。

2.6.3 感官評價

由表3 可知，5 組干酪的外觀得分無顯著差異（P＞0.05），干酪的感官評價差別主要在質(zhì)地和風(fēng)味兩方面。在干酪外觀評價中，純羊乳組得分最高，這與純羊乳組干酪白度值高相關(guān)，摻入牛乳比例越高，干酪的顏色由白色向淡黃色轉(zhuǎn)變。干酪質(zhì)地方面，結(jié)合2.3節(jié)中干酪質(zhì)構(gòu)分析可以看出，純羊乳組干酪的硬度和咀嚼性最高，但是在感官分析質(zhì)地中得分不高，摻入50%牛乳組干酪的質(zhì)地得分更高，說明摻入50%牛乳組干酪的嚼勁、彈性、顆粒感等更符合感官評價小組人員的口感。在風(fēng)味方面，純羊乳組干酪得分顯著低于其他4 組（P＜0.05），摻入牛乳比例越高，風(fēng)味得分越高，這與羊乳獨特的羊膻味有關(guān)，膻味低更容易被感官小組人員接受，這與Kaminarides等[39]研究結(jié)果一致，干酪中羊乳比例越高，風(fēng)味得分越低。摻入50%牛乳干酪的總分最高。

表3 Malatya干酪成熟90 d感官評價分析Table 3 Sensory evaluation of Malatya cheese ripened for 90 days

2.7 摻入不同比例牛乳對Malatya干酪蛋白水解的影響

2.7.1 干酪總游離氨基酸的測定

總游離氨基酸含量可以在一定程度上衡量干酪中蛋白水解程度，是通過干酪中蛋白水解的終產(chǎn)物反映干酪中整體蛋白降解情況。干酪中蛋白的水解性能受到乳蛋白類別、凝乳酶、益生菌等因素的影響[40]。由于牛乳和羊乳酪蛋白組成的差異，不同比例牛羊乳的干酪中總游離氨基酸含量具有顯著差異（P＜0.05），如圖5所示，隨著羊乳比例的增加，干酪的總游離氨基酸含量增加。這與Sheehan等[41]報道的羊乳比例對干酪總游離氨基酸的影響一致。此外，隨著成熟期的延長，各組干酪總游離氨基酸水平迅速增加（P＜0.05）。

圖5 不同比例牛羊乳Malatya干酪在成熟期總游離氨基酸含量的變化Fig.5 Changes in total free amino acid content during the ripening of Malatya cheese with different cow to goat milk ratios

2.7.2 成熟期干酪pH 4.6-SN的變化

干酪pH 4.6-SN含量代表的是干酪成熟過程中蛋白質(zhì)水解的廣度。相比于以總游離氨基酸反映干酪水解程度的方法而言，pH 4.6-SN含量反映干酪蛋白水解的廣度包含了中等和小分子質(zhì)量的肽段[42]，pH 4.6-SN是由蛋白水解引起的，主要是由凝乳酶作用產(chǎn)生[43]。

如圖6A所示，不同比例牛羊乳的干酪在成熟期間pH 4.6-SN含量具有顯著差異（P＜0.05），且所有干酪的pH 4.6-SN含量隨著成熟期的延長而逐漸升高。這主要因為在干酪成熟過程中，乳酸菌發(fā)酵劑和凝乳酶的蛋白水解協(xié)同作用，使得干酪中的酪蛋白水解更容易[44]。成熟90 d時，純牛乳組和摻入75%牛乳組干酪的pH 4.6-SN含量顯著低于其他3 組干酪（P＜0.05），且摻入50%牛乳組干酪的pH 4.6-SN含量和純羊乳組Malatya干酪無顯著差異（P＞0.05）。這表明羊乳比例更高的干酪中初級蛋白水解水平更高，且在摻入牛乳比例達到一半時，變化不再明顯。這可能是羊乳中的β-酪蛋白水平高于牛乳，導(dǎo)致纖溶酶活性增加引起的[41]。

圖6 不同比例牛羊乳Malatya干酪在成熟期可溶性氮含量的變化Fig.6 Changes in soluble nitrogen content of Malatia cheese with different ratios of cow to sheep milk during ripening

2.7.3 成熟期間干酪12% TCA-SN變化

12% TCA-SN含量代表干酪中蛋白水解的深度，即通過干酪的進一步水解獲得的小分子肽（具有2～20 個氨基酸殘基）和少量的氨基酸含量反映蛋白水解情況。如圖6B所示，5 組干酪在制備初期的12% TCA-SN含量無顯著差異（P＞0.05），在成熟期前60 d快速增長，并在60 d后增長變緩。這表明在干酪成熟前期蛋白水解更快。而60 d后，部分短肽進一步分解，使12% TCA-SN含量增長變緩。這也說明成熟期干酪抗氧化活性在后期略微降低并保持平衡的原因。

對于最后一個成熟時期而言，純羊乳干酪組、摻入25%、50%牛乳干酪組的12% TCA-SN含量顯著高于其余2 組干酪（P＜0.05），且純牛乳組干酪的12% TCA-SN含量最低。此外，摻入50%牛乳組干酪和純羊乳組無顯著差異（P＞0.05）。Imm等[45]證實這些結(jié)果，他們發(fā)現(xiàn)羊乳干酪成熟期間的蛋白質(zhì)水解程度更高。

2.8 摻入不同比例牛乳對Malatya干酪抗氧化性能影響

如圖7所示，隨著成熟期的延長，DPPH自由基清除活性、還原力、超氧陰離子自由基清除能力、總抗氧化能力都表現(xiàn)出先增大后減小的趨勢，并且都在成熟60 d時達到最高。眾多研究表明干酪抗氧化活性來源于成熟期大量抗氧化肽的產(chǎn)生[6,46]。Yang Wanshuang等[47]研究發(fā)現(xiàn)添加益生菌的切達干酪的抗氧化活性，隨著成熟度的增加呈現(xiàn)先增加后降低趨勢。這是因為成熟前期，乳蛋白在凝乳酶的作用下進行初步水解得到較大的肽段，這些肽段部分具有抗氧化活性[48]。隨著成熟期增加，作為發(fā)酵劑的乳酸菌及干酪中的蛋白酶逐漸增多，進而將較大肽段深度水解為小肽或游離氨基酸[49]。然而在成熟后期，各組干酪的抗氧化指標均略微降低。因為此時干酪中具有抗氧化活性的小肽進一步分解為沒有抗氧化活性的氨基酸。

圖7 牛羊乳比例對Malatya干酪抗氧化性的影響Fig.7 Effect of cow to goat milk ratio on antioxidant properties of Malatya cheese

在0 d時，各組干酪的DPPH自由基清除率差異不顯著（圖7A），成熟60 d時，摻入50%牛乳、25%牛乳以及純羊乳組干酪分別達到（47.29±0.85）%、（48.29±0.41）%、（48.7±0.93）%，組間差異不顯著（P＞0.05）。這說明摻入50%牛乳干酪可達到羊乳干酪的DPPH自由基清除水平。

在成熟60 d時，純羊乳組Malatya干酪還原力最大，為0.46±0.05（圖7B）。總的來說，在成熟期前60 d，摻入牛乳的比例可以顯著影響干酪還原力的產(chǎn)生。而在成熟期結(jié)束，所有干酪的還原力有所下降，并達到一致水平。

如圖7C所示，在干酪制備初期，純羊乳組Malatya干酪具有最高的超氧陰離子自由基清除率，顯著高于其他組（P＜0.05）。在成熟期結(jié)束時，所有干酪的超氧陰離子自由基清除率降到最高水平的74.70%～78.56%，且各組之間無顯著差異（P＞0.05）。這與Revilla等[50]的研究結(jié)果相似，不同的牛羊乳比例對干酪的ABTS陽離子自由基清除活性影響不顯著。

新制備的5 組干酪的總抗氧化能力無顯著差異（圖7D）（P＞0.05），在干酪成熟至第30天，各組干酪的總抗氧化能力存在顯著差異，成熟60 d時，摻入25%牛乳組干酪、50%牛乳組干酪與純羊乳組Malatya干酪總抗氧化能力無顯著差異（P＞0.05），3 組干酪總抗氧化能力分別為5.93±0.45、5.63±0.32、6.10±0.46，但它們顯著高于其他兩組（P＜0.05）。干酪成熟結(jié)束時，5 組干酪總抗氧化能力無顯著差異（P＞0.05）。

將5 組干酪不同時期抗氧化能力的變化以層次聚類分析展示（圖7E），藍色表示樣本中該指標數(shù)值低，黃色則表示樣本中該指標數(shù)值高。在起始時，各組樣品的抗氧化活性（DPPH自由基清除能力、還原力、超氧陰離子自由基清除能力、總抗氧化能力）均較低，隨著成熟時間的延長，樣品的抗氧化活性均顯著增加。在成熟期第60天達到最大值，隨后呈現(xiàn)微弱的降低趨勢。此外，在各個時期中，樣品隨著羊乳比例的增加，抗氧化活性增加。此外，A3樣品（成熟0 d摻入50%牛乳干酪）抗氧化活性顯著高于A1（成熟0 d純牛乳干酪）和A2（成熟0 d摻入75%牛乳干酪）樣品，并與A5（純羊乳干酪）樣品呈現(xiàn)相似的抗氧化活性。這些結(jié)果在成熟的各個時期都觀察到，尤其是在第60和90天時。總之，這些結(jié)果表明摻入50%牛乳組是一個可制備Malatya干酪的原料比例，能夠滿足對產(chǎn)品抗氧化性能的要求。

3 結(jié)論

對摻入不同比例牛乳的Malatya干酪在成熟過程中得率、理化特性、質(zhì)構(gòu)、色差、熔融溫度、感官品質(zhì)的分析可知，干酪中摻入牛乳比例越高，Malatya干酪蛋白含量、硬度和咀嚼性、亮度和白度值以及熔融溫度都有不同程度的降低。此外，摻入50%牛乳干酪的得率與純羊乳組無顯著差異，在感官評價中摻入50%牛乳干酪總分最高。對干酪成熟期的蛋白水解能力和抗氧化能力進行分析，隨著成熟期延長，蛋白水解能力增強，干酪抗氧化能力先增加后降低，在成熟期第60天，5 組干酪的抗氧化性最強，并在成熟末期有所降低。同時，摻入50%牛乳干酪的蛋白水解程度、抗氧化能力與純羊乳組無顯著差異。總之，綜合干酪感官品質(zhì)、抗氧化功效及成本多方面考慮，以摻入50%牛乳制備干酪是最佳傳統(tǒng)Malatya干酪的替代形式。本實驗對開發(fā)適當(dāng)?shù)募夹g(shù)，使用牛乳和羊乳混合生產(chǎn)具有適當(dāng)特性的創(chuàng)新產(chǎn)品提供一定參考。