雨生紅球藻新型抗氧化肽的制備純化、鑒定篩選及其對秀麗線蟲抗氧化能力的影響

何宛詩，鄭欽生，陳小艷，夏增慧，曹 庸，劉曉娟

（華南農業大學食品學院，廣東省功能食品活性物重點實驗室，廣東 廣州 510642）

人體長時間處于不良環境或隨著年齡增長，抗氧化抵御系統會衰弱，且因自由基形成過多或消除過慢，氧化還原穩態被打破，從而在機體內造成氧化應激，引起不可逆的細胞破壞。氧化應激可誘發心血管疾病、阿爾茨海默癥及癌癥等多種慢性疾病[1-3]。為降低這些疾病風險，人們越來越傾向于服用抗氧化劑，以輔助協調身體的氧化還原平衡。一些食源性生物活性肽具有結構簡單、易吸收、穩定性好、無免疫反應等優勢，在抗氧化劑領域備受青睞，利用自然資源篩選和獲得抗氧化效用的肽產品，正在成為食品和醫療行業研究的動力[4-5]。

作為新食品原料，雨生紅球藻（Haematococcus pluvialis）是一種營養價值極高的海洋微藻[6]。為提取藻中的“超級抗氧化劑”蝦青素，全球范圍內雨生紅球藻的年產量達545 t，我國是世界雨生紅球藻蝦青素市場的產能大國之一[7]。然而，大規模生產蝦青素的同時也留下了大量工業藻渣，應用局限于動物飼料或被直接丟棄。雨生紅球藻渣含有豐富的營養價值，其中蛋白質含量達20.8%～22.2%，仍存在值得探究的高附加值[8-9]。本團隊前期通過生物酶解法從雨生紅球藻渣蛋白中獲得抗氧化酶解物，并顯示較好的體外抗氧化能力[10]。微藻蛋白酶解物是生物活性肽的優質來源，可經過進一步的純化提高其利用價值。Hu Xiao等[11]利用超濾、凝膠層析色譜和反相液相色譜技術分離裂壺藻蛋白酶解物，并通過電噴霧電離質譜法鑒定多肽結構，獲得裂壺藻抗氧化肽PYK，相比純化前的蛋白酶解物，抗氧化肽PYK顯示出更強的羥自由基清除能力和還原力。因此，分離純化是強化微藻多肽功能活性的關鍵技術，可進一步加強對藻渣的綜合利用。截止目前，關于雨生紅球藻生物活性肽的研究還有待完善。

近幾年，為了克服傳統多肽分離法的耗資大、周期長等缺點，計算機輔助建模技術已被廣泛應用于多肽構效關系評估和活性篩選[12-13]。分子模擬對接技術常用于預測和篩選生物活性肽，其中融合多學科領域的專業知識，具有高效準確的特點[14]。基于幾何配體和能量配體原則，分子對接可以利用化學計量學方法，模擬蛋白質或多肽與配體之間的結合模式和結合自由能，實現對二者間作用方式、作用力類型、相互作用位置及其他結合信息的預測[15]。一般而言，分子對接的結合自由能與活性之間顯著相關，二者線性R2可達0.974 3，表示對接最小結合能與功能活性之間具有較強的線性關系[16-19]。Wen Chaoting等[20]采用分子對接對比5 條西瓜籽抗氧化肽P1～P5與1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、2,2′-聯氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）陽離子自由基的結合情況，結果顯示P1（RDPEER）與兩個自由基的最小結合自由能最低，預測P1與配體之間形成了較強的氫鍵和疏水性互作用，意味著其抗氧化活性最強。該預測結果在Wen Chaoting等[21]的其他實驗中得到證實，P1的自由基清除能力和抑制活性氧（reactive oxygen species，ROS）和丙二醛（malondialdehyde，MDA）的能力最強，與分子對接結果對應。

因此，本實驗在前期研究的基礎上，將雨生紅球藻蛋白酶解物作為原料，以ABTS陽離子自由基清除力為活性跟蹤指標，采用超濾、制備型和分析型液相色譜進行分離純化，制備抗氧化效果最佳的多肽組分；然后，經液相色譜-質譜串聯法鑒定多肽組分的氨基酸序列，并利用分子對接技術研究多肽清除ABTS陽離子自由基的能力，以揭示雨生紅球藻抗氧化肽的一級結構，闡明抗氧化肽的作用機理；基于秀麗隱桿線蟲模型研究藻多肽的體內抗氧化活性。為雨生紅球藻渣的高值化利用提供依據，并為食源性抗氧化劑的生產提供開發思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雨生紅球藻渣由荊州市天然蝦青素有限公司提供。野生型N2線蟲購買于Caenorhabditis Genetics Center。大腸桿菌（Escherichia coli）OP50由華南農業大學資源環境學院惠贈。

堿性蛋白酶（200 000 U/g）、ABTS（98%）、鏈霉素硫酸鹽（分析純，98%）上海源葉生物科技有限公司；技術瓊脂粉、胰蛋白胨 廣東環凱微生物科技有限公司；膽固醇、次氯酸鈉溶液（分析純）上海易恩化學技術有限公司；MDA試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒、過氧化氫酶（catalase，CAT）試劑盒、二奎啉甲酸（bicinchoninic acid，BAC）總蛋白定量試劑盒 南京建成生物工程研究所；純化鑒定中的試劑均為色譜純，其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

AL104天平 瑞士梅特勒-托利多公司；PB-10 pH計賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；HSJ-2A磁力水浴鍋 常州澳華儀器有限公司；超濾管（3、10 kDa）美國Millipore公司；PREP 150LC制備型液相色譜分析儀美國Waters公司；LC-10AT VP Plus分析型液相色譜儀日本Shimadzu公司；ALPHA 2-4 LDplus冷凍干燥機德國Marin Christ公司；JXFSTPR-32全自動樣品快速研磨儀 上海凈信實業發展有限公司；EnSpire多功能酶標儀 美國PerkinElmer公司；生化培養箱 寧波萊福科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 雨生紅球藻酶解物制備

參考前期研究的方法[10]，用堿溶酸沉法從雨生紅球藻渣中提取蛋白質，然后在底物質量濃度9 g/100 mL、加酶量質量分數0.7%、溫度40 ℃、pH 11.5和3 h的條件下，加入堿性蛋白酶進行酶解，酶解結束后以6 000 r/min轉速離心20 min，將上清液進行冷凍干燥，獲得雨生紅球藻酶解物。

1.3.2 分離純化

1.3.2.1 超濾[22]

利用分子質量為10 kDa和3 kDa的超濾膜依次對雨生紅球藻酶解物進行純化，得到3 個分子質量不同的組分，收集各組分并進行凍干，以評價各組的ABTS陽離子自由基清除活性，并選出最優組分進一步分離純化。

1.3.2.2 制備型液相色譜

參考Kim等[23]方法，利用SunFire Prep C18OBD色譜柱（19 mm×250 mm，5 μm），在制備型高效液相色譜系統上對超濾組分進行分離純化。色譜條件：流動相A為體積分數0.1%三氟乙酸溶液，流動相B為乙腈；線性梯度洗脫程序：0～18 min，90%～67.5% A、10%～32.5% B，流速5 mL/min，檢測波長214 nm，重復多次進樣收集各分離峰，冷凍干燥后測量各峰組分的ABTS陽離子自由基清除活性，選出活性最強的組分進行下一步分離。

1.3.2.3 分析型液相色譜

根據Agrawal等[24]方法，利用Diamonsil C18分析液相色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），在分析型高效液相色譜系統上對一次分離所得組分進行分離純化。色譜條件：流動相A為體積分數0.1%三氟乙酸溶液，流動相B為乙腈；線性梯度洗脫程序：0～10 min，90% A、10% B；10～20 min，90%～80% A、10%～20% B；20～22 min，80%～90% A、20%～10% B，流速0.5 mL/min，檢測波長214 nm，富集各分離峰，冷凍干燥后測量各峰組分的ABTS陽離子自由基清除活性，選出活性最強的多肽組分。

1.3.3 結構鑒定

參考Xia Zhen 等[25]方法，采用高效液相色譜-串聯質譜（high performance liquid chromatographytandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）法對多肽組分進行氨基酸序列測定。色譜條件：C18反相色譜柱（Acclaim PepMap RSLC，75 μm×25 cm，2 μm，100 ?）；流動相A為0.1%甲酸-水，流動相B為80%乙腈溶液（含0.1%甲酸）；梯度洗脫程序：0～60 min，95%～62% A、5%～38% B。質譜條件：采用ThermoFisher Q Exactive系統結合納升噴霧Nano Flex離子源，噴霧電壓為1.9 kV，離子傳輸管加熱溫度為275 ℃。采用PEAKS Studio 8.5（Bioinformatics Solutions Inc.Waterloo，加拿大）軟件對原始文件進行分析，并根據樣本種類對目標蛋白數據庫在Uniprot中進行檢索。

1.3.4 分子對接篩選

參考Agrawal等[24]方法，利用Chemdraw 19.0繪制多肽的三維結構，并從PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中下載ABTS陽離子自由基配體分子的結構（CID號：6301202）。對多肽結構進行優化后，在Autodock 4.2.6軟件進行多肽與ABTS陽離子自由基的分子對接，對接結果的二維與三維結構可在Ligplot 2.1和PyMOL軟件查看。

1.3.5 ABTS陽離子自由基清除活性的測定

參照賈曉燕等[26]方法測定ABTS陽離子自由基清除率，并稍作修改。配制ABTS陽離子自由基儲備液（終濃度為7 mmol/L ABTS和2.45 mmol/L過硫酸鉀），并在室溫黑暗環境中靜置過夜。測定前用0.01 mol/L磷酸緩沖液（pH 7.4）稀釋成ABTS陽離子自由基工作液，使溶液在734 nm波長處的吸光度為0.70±0.05。測定時，在96 孔板中加入100 μL ABTS陽離子自由基工作液和100 μL待測樣品，于室溫黑暗處放置10 min，測定波長734 nm處的吸光度；同時空白組數值由100 μL ABTS陽離子自由基工作液與100 μL三級水反應獲得，對照組由100 μL磷酸緩沖液混合100 μL待測樣品獲得。

式中：A0為空白的吸光度；A1為樣品的吸光度；A2為對照的吸光度。

1.3.6 利用秀麗線蟲測定抗氧化活性[27]

秀麗線蟲在含有線蟲生長培養基（nematode growth medium，NGM）瓊脂的培養皿上生長，并置于20 ℃的培養箱中培育。為保證樣品純度，通過固相合成法制得雨生紅球藻抗氧化肽（Haematococcus pluvialisantioxidant peptide，HPp，純度99.21%）。將多肽樣品溶解在蒸餾水中，并以體積比5∶95與大腸桿菌OP50混合，配制最終濃度分別為0、50、100 μmol/L和200 μmol/L的菌液，接種在NGM板中作為秀麗線蟲的食物。使用裂解法獲得同一時期的蟲卵，待秀麗線蟲的受精卵發育至L4期，完成同期化。

在秀麗線蟲完成同期化后喂食藥物，當處理4 d時，用M9緩沖液沖洗，低溫研磨，除去沉淀后得到線蟲研磨液，5 000 r/min離心10 min，取線蟲研磨物的上清液。用BCA試劑盒測定各組秀麗線蟲研磨液的蛋白含量，并使用相應試劑盒測定MDA含量和SOD、CAT活力。

1.4 數據處理

2 結果與分析

2.1 雨生紅球藻抗氧化肽的分離純化

2.1.1 抗氧化肽的超濾分離純化

通過堿性蛋白酶水解得到的產物需要進一步純化和富集，以獲得特定生物活性的多肽。以分子質量為純化標準，酶解物經超濾分離得到3 種分子質量不同的組分，分別為F1（＞10 kDa），F2（3～10 kDa）和F3（＜3 kDa），結果見圖1所示。結果表明，F3在3 個組分里的ABTS陽離子自由基清除能力最強，在0.25 mg/mL的清除率達（38.11±1.11）%（P＜0.05）。研究表明分子質量是影響多肽抗氧化活性的關鍵因素[2]。小分子肽因體積小更容易被人體吸收，或更易與目標自由基相互作用，能更好地發揮活性，從而具有更強的抗氧化效果[5]。據報道，抗氧化肽的分子質量通常在200～2 000 Da范圍內，超濾組分F3在該分子質量范圍[28]。因此，確定組分F3為進一步分離對象。

圖1 超濾組分F1、F2和F3的ABTS陽離子自由基清除能力Fig.1 ABTS radical cation scavenging capacity of ultrafiltration fractions F1,F2 and F3

2.1.2 抗氧化肽的制備型液相色譜分離純化

反相液相色譜技術通過連續相和流動相將物質從混合物中分離出來，現已被廣泛應用于多肽純化中[29]。使用制備型液相色譜儀對組分F3進一步純化，在不同保留時間下依次收集組分I～VI，如圖2A所示，分離得到6 個組分I、II、III、IV、V和VI。

圖2 組分I、II、III、IV、V和VI的HPLC圖（A）和ABTS陽離子自由基清除率（B）Fig.2 Chromatograms (A) and ABTS radical cation scavenging capacity (B) of six subfractions purified by preparative HPLC

由圖2B可知，組分VI在0.25 mg/mL的ABTS陽離子自由基清除率達（43.37±0.19）%，顯著高于其他組分（P＜0.05）。多肽的疏水性質與抗氧化活性密切相關，色氨酸、脯氨酸等疏水性氨基酸能夠促進肽在脂質-水界面處溶解，從而更高效地清除自由基[2]。根據C18色譜柱的分離原理，最后一個響應峰對應的極性最小，其疏水性很大概率比其他組分大，這也可能是VI抗氧化活性強于其他組分的原因。因此，選擇VI組分參與下一步純化。

2.1.3 抗氧化肽的分析型液相色譜分離純化

為達到精密度更高的純化效果，使用分析型液相色譜進一步對組分VI分離，得到3 個組分i、ii和iii。如圖3所示，組分i的ABTS陽離子自由基清除活性顯著高于組分ii和iii（P＜0.05），在0.25 mg/mL質量濃度下清除率達（96.97±2.00）%。

匯總后可知（表1），經過3 個分離步驟的純化，雨生紅球藻蛋白酶解物的ABTS陽離子自由基清除率逐步增強（P＜0.05），超濾組分F3、制備液相組分VI和分析液相組分i的清除活性分別是蛋白酶解物的1.16、1.33 倍和2.96 倍，這也充分說明分離純化可有效篩選活性組分。因此，富集組分i進行結構鑒定，以探明雨生紅球藻抗氧化肽的一級結構。

表1 雨生紅球藻源不同純化多肽組分的ABTS陽離子自由基清除活性Table 1 ABTS radical cation scavenging capacity of protein hydrolysate from H.pluvialis and its peptide fractions

2.2 雨生紅球藻抗氧化肽的結構鑒定

目前常用的多肽結構鑒定方法有蛋白質/肽序列分析儀法、質譜法和核磁共振等方法，其中質譜法具有高靈敏度和高效率等優點，適用于肽類物質的一級結構檢測[11]。因此，本研究采用HPLC-MS/MS法檢測雨生紅球藻抗氧化多肽組分i的組成及序列。檢測方法的掃描范圍為m/z100～1 500，通過PEAKS Studio軟件進行數據處理和De novo分析。經過Uniprot數據庫檢索，得到10 個多肽序列，命名為i-1～i-10，其肽段信息見表2所示，肽鏈質譜圖見圖4。

表2 雨生紅球藻多肽的結構鑒定Table 2 Structural characterization of H.pluvialis peptide fractions

圖4 雨生紅球藻多肽i-1～i-10的二級質譜圖Fig.4 Secondary mass spectra of H.pluvialis peptides i-1 to i-10

由表2可知，i-1～i-10的肽鏈長度均在5～10以內，分子質量在576.29～736.35 Da范圍內，這些肽鏈的尺寸符合大部分抗氧化肽的結構特征[28]。另外，所有多肽序列的疏水性氨基酸含量均在60%以上，其電離性質具有一定優勢，可能增強多肽的抗氧化能力[30]。結果表明部分肽鏈序列來自葉綠素，而葉綠素已被證明是生產生物活性肽的良好蛋白原料[31]。作為光合作用的位點，葉綠體是細胞中自由基的主要來源，因此需要強大的防御系統以保護自身的完整性[32]。面對氧化應激、強光脅迫等極端信號時，葉綠體會促進細胞器內蛋白酶的運作，以葉綠素結合蛋白等為底物，產生相應活性的多肽作出抗逆響應，進而促進防御基因表達和相應次級代謝物合成[33]。因此推斷來源于葉綠素的多肽具有強抗氧化能力的原因，可能與葉綠體應對氧化應激的機制有關。曾有學者發現在極大螺旋藻中，來源于葉綠素蛋白的多肽RALGFDFRR比來源于其他蛋白的多肽，具有更大發揮抗氧化活性的潛力[34]。綜上所述，本研究推測雨生紅球藻抗氧化肽具備分子質量小、疏水性氨基酸含量高、來源于葉綠素蛋白等特點。

2.3 利用分子對接技術篩選雨生紅球藻抗氧化肽

一般而言，分子模擬對接預測的結合能越低，意味著蛋白與配體的相互作用越強、結合越穩定。目前，分子對接技術主要用于抗高血壓肽、抗高血糖肽的機制研究，在抗氧化肽的篩選和機理研究方面具有極大潛力。因此，為了高效篩選及精準確定目標多肽，在結構鑒定的基礎上，結合利用分子對接技術對雨生紅球藻多肽與ABTS陽離子自由基的相互作用展開研究[31,35]。

在進行分子對接之前，采用PeptideRanker系統（http://distilldeep.ucd.ie/PeptideRanker/）對10 條多肽進行初步的生物活性預測[36]。表3顯示，i-1～i-10的活性預測得分均高于50 分，表示這些多肽均有大于50%的概率存在生理活性，達到初步篩選的標準。然后，設置ABTS陽離子自由基為配體，通過Autodock軟件模擬多肽和配體間的結合情況，比較各肽之間的最小結合自由能（表3）。結果顯示i-1～i-8與ABTS陽離子自由基的結合自由能小于0 kcal/mol，表示其能在一般情況下自發地與配體發生相互作用，其中i-1與ABTS陽離子自由基的最小結合能最低，為－5.01 kcal/mol，表示該肽最容易與ABTS陽離子自由基結合，并發揮清除作用，意味著i-1的抗氧化能力最強。

表3 雨生紅球藻抗氧化肽的計算機預測結果Table 3 In silico prediction of H.pluvialis antioxidant peptides

借助Ligplot和PyMOL工具，觀察i-1與ABTS陽離子自由基在二維與三維空間的具體結合情況，深入解析多肽發揮活性的機理。如圖5所示，i-1的氨基酸殘基Lys-1、Thr-3與ABTS陽離子自由基形成2 個氫鍵，長度分別為2.74 ?和3.08 ?；肽鏈上氨基酸殘基Phe-2、Pro-4和Ala-5與配體的苯環產生3 個的疏水作用，這2 種作用力對復合物的形成和穩定十分重要[38]。此外，從對接結合的三維圖像圖6可知，多肽i-1中Pro-4的五元環與ABTS陽離子自由基的苯環形成類似偏移堆積的結構，這種π-π共軛作用有利于體系的穩定，協助多肽更高效地清除自由基[35,38]。

圖5 KFTPAP與ABTS陽離子自由基之間的二維對接結果圖Fig.5 Two-dimensional model of KFTPAP binding with ABTS radical cation

圖6 KFTPAP與ABTS陽離子自由基之間的三維對接結果圖Fig.6 Three-dimensional model of KFTPAP binding with ABTS radical cation

上述結果表明，在10 條多肽中，i-1最有可能具備清除ABTS陽離子自由基的能力，具有最強的抗氧化活性。i-1更易清除自由基的原因，可能不只是高疏水氨基酸含量和低分子質量的單獨作用，還綜合了其他結構特點的作用，如上述提到的蛋白來源于強抗氧化的葉綠素蛋白，或序列上C端聚集較多疏水性氨基酸等[30-31]。據報道，序列中C端的氨基酸性質對活性物質的生理活性有較大影響[30]。研究表明，C端聚集較多疏水性氨基酸的結構特點有助于提高肽鏈的trolox等價抗氧化能力、氧化自由基吸收能力和超氧陰離子自由基清除能力，從而提高多肽對機體的抗氧化能力[39]。例如，金烏賊多肽DVEDLEAGLAK通過增強SOD-3的表達，改善秀麗線蟲的抗氧化性能，其中原因可能與其序列C端含有大量疏水性氨基酸有關[40]。通過數據庫全面檢索，目前未有文獻報道過此肽，故最終確定i-1為新型HPp，氨基酸序列為KFTPAP。

2.4 HPp的抗氧化能力測定

在執行分子對接程序后，為進一步驗證預測結果的準確性，通常會測定目標多肽的功能活性，并結合對接情況解釋其作用機理[13]。因此，本實驗采用固相合成方法制備HPp KFTPAP，進一步利用秀麗隱桿線蟲模型評價多肽的抗氧化能力。機體通過抗氧化酶系統使體內具有抗氧化能力，維持體內氧化還原穩態，如果氧化還原穩態被打破，機體可能會發生氧化損傷，MDA等標志物的含量會相應增加[41-42]。

抗氧化酶系統包括SOD和CAT等，其酶活是評價活性物抗氧化能力的重要指標[43]。對比攝入50、100、200 μmol/L濃度HPp線蟲與未攝入HPp線蟲的體內抗氧化酶活力，結果如圖7、8所示。使用3 個濃度的HPp處理后，線蟲的SOD、CAT活力均顯示出增強的趨勢。其中，100 μmol/L HPp處理組的線蟲SOD活力顯著高于對照組，酶活增加了8.04%（P＜0.05），100 μmol/L和200 μmol/L HPp處理組的線蟲體內CAT活力顯著高于對照組，酶活分別增加了1.56 倍和1.13 倍（P＜0.05）。結果表明HPp能有效改善秀麗線蟲的抗氧化酶系統，發揮抗氧化作用。

圖7 HPp濃度對秀麗線蟲SOD活力的影響Fig.7 Effect of HPp at various concentrations on SOD activity of C.elegans

圖8 HPp濃度對秀麗線蟲CAT活力的影響Fig.8 Effect of HPp at various concentrations on CAT activity of C.elegans

體內自由基含量過多會引發脂質過氧化，生成大量MDA，從而加劇機體的氧化損傷[42]。HPp對線蟲體內MDA含量的影響如圖9所示。低、中濃度HPp的攝入能有效降低線蟲的MDA水平。用100 μmol/L HPp培養線蟲后，其體內MDA含量顯著下降了38.8%（P＜0.05）。結果表明HPp能有效降低秀麗線蟲體內MDA含量。

圖9 HPp濃度對秀麗線蟲MDA含量的影響Fig.9 Effect of HPp at various concentrations on MDA content in C.elegans

與Wang Yali等[44]研究的牦牛骨膠原蛋白肽UU1（GASGPMGPR）相比，HPp能更大程度地提高秀麗線蟲的抗氧化性能，包括CAT活力和MDA含量。原因可能是多方面的，除了比UU1分子質量小，具有更易被機體吸收作用的優勢外，HPp的結構中還含有苯丙氨酸，其中的芳香環和酚羥基可通過電子共振或電子離域，將ROS轉化為更穩定的苯氧基，從而抑制自由基介導的過氧化鏈式反應。此外，芳香環還能與羥自由基發生反應，增強抗氧化功效[4]。研究發現，米糠肽KHNRGF和大豆多肽FDPAL在序列上同樣含有苯丙氨酸，這些多肽均有效地改善線蟲的抗氧化性能，包括增強SOD活力、減少ROS含量等，進一步驗證苯丙氨酸能提高HPp抗氧化能力[45-46]。由此可見，HPp可顯著改善秀麗線蟲體內的抗氧化能力，其濃度為100 μmol/L時效果最佳。

3 結論

本研究利用分離純化、結構鑒定和分子對接技術，從藻渣酶解物中制備獲得具有較強活性的HPp，并評價體內抗氧化活性。基于抗氧化活性的全程跟蹤，經超濾、制備型和分析型液相色譜三級分離后，純化多肽組分ABTS陽離子自由基清除能力比蛋白酶解物分別高1.16、1.33 倍和2.96 倍。分析液相組分i具有最強的抗氧化能力，0.25 mg/mL組分i的ABTS陽離子自由基清除率達（96.97±2.00）%。對組分i進行HPLC-MS/MS鑒定，獲得10 條多肽序列（i-1～i-10），這些多肽的肽鏈長度均在5～10以內，分子質量在576.29～736.35 Da范圍內，且疏水性氨基酸含量均在60%以上，符合抗氧化肽的結構特點。運用分子對接技術對10 條多肽進行篩選預測，結果顯示i-1與ABTS陽離子自由基之間最小結合能最低，氨基酸殘基跟配體產生2 個氫鍵、3 個疏水作用，并在三維空間形成π-π共軛作用。這意味著i-1的抗氧化能力最強，因此確定KFTPAP為HPp的序列。體內實驗進一步表明，HPp能有效提高秀麗線蟲的抗氧化能力，體現在SOD、CAT活力及MDA含量。HPp在100 μmol/L時抗氧化作用效果最優，增強SOD活力8.04%，提高CAT活力1.56 倍，并降低MDA水平38.8%。本團隊推測HPp的C端聚集疏水性氨基酸、含有苯丙氨酸和來源于葉綠素蛋白，可能是HPp具有較強抗氧化能力的原因。研究結果可為雨生紅球藻渣的高值化利用提供依據，并為食源性抗氧化劑的開發提供思路。