玉米皮纖維發(fā)酵培養(yǎng)黑曲霉和肉原毛平革菌的產(chǎn)酶分析

劉玉春，郭 超，王 超

（國(guó)家糧食和物資儲(chǔ)備局科學(xué)研究院，北京 100037）

玉米皮是玉米深加工的主要副產(chǎn)物之一，通常用作飼料原料[1]，而玉米皮中纖維含量約為70%。與軟木、硬木等其他來源纖維相比，玉米皮纖維（corn bran fiber，CBF）具有獨(dú)特的單糖組成和結(jié)構(gòu)特征，即半纖維素質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到68%[2]，且支鏈化程度高，木質(zhì)素含量低[3]。目前，已有將玉米皮作為固態(tài)發(fā)酵原料用于固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶等的研究報(bào)道[4]。

黑曲霉（Aspergillus niger）是國(guó)際公認(rèn)的GRAS（generally regarded as safe）菌株[5-6]，被廣泛用于傳統(tǒng)發(fā)酵食品和釀造。A.niger具有強(qiáng)大的蛋白質(zhì)折疊、修飾及胞外蛋白分泌能力[7]，已成為發(fā)酵工業(yè)的重要出發(fā)宿主和細(xì)胞工廠。A.niger在酶制劑生產(chǎn)方面應(yīng)用廣泛，如超過30 種以上的食品酶是由A.niger發(fā)酵生產(chǎn)，包括纖維素酶、木聚糖酶、淀粉酶、糖化酶、果膠酶等[8-10]。A.niger能夠以糧油加工副產(chǎn)物等生物質(zhì)為原料發(fā)酵產(chǎn)酶[11]，而這些生物質(zhì)原料的成分和結(jié)構(gòu)也會(huì)影響A.niger的胞外酶分泌表達(dá)。許堯興等[12]報(bào)道培養(yǎng)基組成對(duì)A.niger產(chǎn)α-半乳糖苷酶的影響。Afangide等[13]報(bào)道玉米皮成分對(duì)A.niger發(fā)酵產(chǎn)木聚糖酶的影響。目前，隨著基因工程、分子生物學(xué)等技術(shù)應(yīng)用于A.niger改造，使A.niger成為微生物研究領(lǐng)域的主要課題之一[14-17]。

肉原毛平革菌（Phanerochaete carnosa）是一種白腐真菌，屬于Phanerochaete sensu stricto，最早從香脂冷杉（Abies balsamea）中分離獲得[18]。P.carnosa具有典型的白腐真菌底物偏好性[19]，其糖苷水解酶表達(dá)活性與黃孢原毛平革菌（P.chrysosporium）相似。但與大多數(shù)白腐菌不同，P.carnosa幾乎完全從軟木中分離獲得[20]。P.carnosa除具有完整的木質(zhì)纖維素降解酶系編碼基因外，其還具有獨(dú)特軟木降解酶基因，如錳過氧化物酶、半纖維素酶和糖蛋白降解酶基因[20]。Jurak等[21]研究P.carnosa利用云杉及白楊木培養(yǎng)基生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄組差異，發(fā)現(xiàn)錳過氧化物酶基因（MnP）為該菌株轉(zhuǎn)錄豐度最高的基因。Mahajan等[22]對(duì)P.carnosa在纖維素和云杉底物上生長(zhǎng)的胞外蛋白質(zhì)組進(jìn)行研究。

發(fā)酵底物的成分和結(jié)構(gòu)能夠影響微生物的生長(zhǎng)、胞外酶的分泌表達(dá)[23]。國(guó)內(nèi)外針對(duì)P.carnosa的研究報(bào)道很少，且主要集中在P.carnosa對(duì)軟木的降解。目前，鮮見以CBF為碳源發(fā)酵培養(yǎng)A.niger和P.carnosa，以及對(duì)兩種真菌的蛋白質(zhì)組進(jìn)行分析的相關(guān)報(bào)道。本研究以CBF為碳源，應(yīng)用前期篩選獲得的A.niger和P.carnosa進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，分析發(fā)酵液中還原糖含量、蛋白質(zhì)量濃度、木聚糖酶和α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性變化規(guī)律，并應(yīng)用無標(biāo)記蛋白質(zhì)組技術(shù)分析與CBF降解相關(guān)胞外酶系的分泌表達(dá)情況，旨在為以CBF作原料制備具有半纖維素降解優(yōu)勢(shì)的復(fù)合酶制劑、酶法水解CBF制備功能性低聚阿拉伯木聚糖提供基礎(chǔ)，促進(jìn)玉米皮的增值利用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米皮由河北廣玉淀粉糖業(yè)有限公司提供；A.niger和P.carnosa為本實(shí)驗(yàn)室篩選保存的菌株。

木糖、樺木木聚糖 愛爾蘭Megazyme公司；乙酸乙酯 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；3,5-二硝基水楊酸、酒石酸鉀鈉 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒 北京索萊寶科技有限公司；對(duì)硝基苯基-α-L-阿拉伯呋喃糖苷（4-nitrophenylα-L-arabinofuranoside，pNPAf）、對(duì)硝基苯酚（p-nitrophenol，pNP）美國(guó)Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設(shè)備

MQD-SIR單層小容量振蕩培養(yǎng)箱 上海旻泉儀器有限公司；SynergvHT酶標(biāo)儀 美國(guó)BioTek公司；電泳儀、凝膠成像儀 美國(guó)Bio-Rad公司；1200高效液相色譜儀（配紫外檢測(cè)器）美國(guó)Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 CBF提取和培養(yǎng)基制備

CBF提取參照Lee等[2]方法，玉米皮干燥粉碎后過60 目篩，粉碎后玉米皮與正己烷混合攪拌30 min，攪拌結(jié)束后倒掉上層正己烷，重新添加正己烷攪拌，共重復(fù)3 次。取100 g脫脂玉米皮，按1∶15（g/mL）加入蒸餾水，再加入耐高溫α-淀粉酶，95 ℃水浴處理1 h；隨后水浴溫度降至55 ℃，加入糖化酶處理2 h，充分脫除淀粉。再加入中性蛋白酶，55 ℃反應(yīng)1 h，隨后加熱至100 ℃滅酶5 min；紗布過濾，濾渣用蒸餾水洗滌2 次后干燥。

CBF培養(yǎng)基[24]：蛋白胨1.0 g/L、尿素0.2 g/L、CaCl20.3 g/L、MgSO4·H2O 0.3 g/L、(NH4)2SO44.2 g/L、KH2PO42.0 g/L、0.2%（V/V）微量元素（CoCl20.2 g/L、MnSO4·4H2O 1.6 g/L、ZnSO4·7H2O 1.4 g/L、FeSO4·7H2O 5.0 g/L）、10 g/L玉米皮纖維；121 ℃滅菌20 min后備用。

1.3.2A.niger和P.carnosa培養(yǎng)及發(fā)酵上清液蛋白分析

A.niger和P.carnosa經(jīng)PDA平板活化后，接種于200 mL CBF培養(yǎng)基，30 ℃、200 r/min誘導(dǎo)培養(yǎng)。每隔12 h取發(fā)酵液樣品，12 000 r/min離心10 min，取上清液，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析。

1.3.3 理化指標(biāo)的測(cè)定

1.3.3.1 還原糖含量和蛋白質(zhì)濃度測(cè)定

將不同培養(yǎng)時(shí)間的發(fā)酵上清液適當(dāng)稀釋，取200 μL樣品，加入300 μL DNS試劑，沸水浴10 min后冷卻，在540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。按照試劑盒說明書采用BCA法測(cè)定發(fā)酵液蛋白質(zhì)量濃度。

1.3.3.2 木聚糖酶活性測(cè)定

將20 μL 適當(dāng)稀釋發(fā)酵上清液加入180 μL 0.5 g/100 mL預(yù)熱的樺木木聚糖底物，水浴5 min；再加入300 μL DNS試劑，沸水煮10 min，冷卻至室溫；在540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。每分鐘分解底物生成1 μmol還原糖所需的酶量定義為1 個(gè)酶活單位（U）[25]。

1.3.3.3α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性測(cè)定

將20 μL發(fā)酵液加入180 μL 2 mmol/L pNPAf底物中，40 ℃反應(yīng)10 min；加入300 μL 1 mol/L Na2CO3溶液終止反應(yīng)，在405 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以不同濃度pNP溶液與1 mol/L Na2CO3溶液混合，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算酶水解底物后pNP的生成量，每分鐘分解底物生成1 μmol的pNP產(chǎn)物所需的酶量定義為1 個(gè)酶活力單位（U）[24]。

1.3.4 CBF單糖和酚酸組成測(cè)定

1.3.4.1 單糖組成測(cè)定

參照1-苯基-3-甲基-5-吡唑酮（1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone，PMP）（甲醇溶解）柱前衍生-高效液相色譜法[26]。稱取20 mg CBF樣品，加入30 mL水，緩慢加入亞鐵氰化鉀溶液和乙酸鋅溶液各5.0 mL，再加水至80 mL，室溫振蕩1 h后離心，濾紙過濾，定容至100 mL。取200 μL樣品加入0.5 mL 4 mol/L三氟乙酸溶液，在120 ℃水解2 h，氮?dú)獯蹈桑辉俜謩e加入0.3 mol/L NaOH溶液和0.5 mol/L PMP各0.5 mL，70 ℃水浴60 min，冷卻至室溫；再加入0.5 mL 0.3 mol/L HCl溶液，隨后加入0.5 mL氯仿，振蕩搖勻后靜置20 min，棄去下層氯仿層，萃取3 次除去多余的PMP衍生劑，上層水相過膜，進(jìn)行高效液相色譜分析。混合標(biāo)準(zhǔn)品由葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、半乳糖、巖藻糖和核糖10 種單糖和乳糖內(nèi)標(biāo)（均為20 mmol/L）組成。

高效液相色譜參數(shù)：色譜柱：SHISEIDO C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（pH 6.9）-乙腈，體積比為82∶18；檢測(cè)波長(zhǎng)245 nm；柱溫25 ℃，流速1.0 mL/s。進(jìn)樣量10 μL。

1.3.4.2 酚酸含量測(cè)定

參考Sani 等[27]方法并進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。稱取200 mg CBF，加入10 mL體積分?jǐn)?shù)80%乙醇溶液渦旋混勻，超聲處理30 min，8 000 r/min離心10 min；取上清液，35 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除乙醇，殘?jiān)?0 mL純水溶解，轉(zhuǎn)移至50 mL容器中，用氫氧化鉀溶液調(diào)節(jié)pH值至7.0，再加入20 mL乙酸乙酯振蕩10 min后取上層酯層，水相再用20 mL乙酸乙酯重新萃取2 次，合并乙酸乙酯相為中性酚；調(diào)節(jié)水相pH值至2.0，再用20 mL乙酸乙酯萃取3 次，合并乙酸乙酯層為酸性酚，將中性酚和酸性酚合并后35 ℃濃縮至干，殘?jiān)皿w積分?jǐn)?shù)60%甲醇溶液定容至10 mL，過0.22 μm濾膜后待測(cè)。

高效液相色譜參數(shù)：色譜柱：Agilent C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動(dòng)相A：體積分?jǐn)?shù)1%乙酸溶液；流動(dòng)相B：乙腈；柱溫35 ℃，流速為1.0 mL/s；檢測(cè)波長(zhǎng)270 nm；進(jìn)樣量10 μL。梯度洗脫條件：0～5 min，94%～86% A、6%～14% B；5～8 min，86%～82% A、14%～18% B；8～15 min，82%～80% A、18%～20% B；15～20 min，80%～76% A、20%～24% B；20～30 min，保持96% A、4% B。

1.3.5 無標(biāo)記蛋白質(zhì)組學(xué)分析

取培養(yǎng)60 h的發(fā)酵液，12 000 r/min離心10 min，分離上清液，發(fā)酵液蛋白樣品進(jìn)行酶解處理[28]。蛋白質(zhì)譜鑒定實(shí)驗(yàn)委托北京諾禾致源科技股份有限公司進(jìn)行。蛋白質(zhì)生物信息學(xué)使用InterProScan軟件進(jìn)行基因本體論（Gene Ontology，GO）和結(jié)構(gòu)域IPR功能注釋（包括Pfam、PRINTS、ProDom、ProSite數(shù)據(jù)庫）。使用ExPASy中的Compute pI/Mw工具評(píng)估蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量（mw）和理論等電點(diǎn)（pI）。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用GraphPad Prism 5進(jìn)行處理數(shù)據(jù)；采用Adobe Illustrator軟件處理圖片。

2 結(jié)果與分析

2.1 CBF的單糖和酚酸組成

由表1可知，CBF樣品中含有10 種單糖，木糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、巖藻糖、甘露糖、鼠李糖、核糖的物質(zhì)的量比為720.4∶402.5∶130.4∶76.5∶24.6∶20.2∶15.7∶10.8∶10.2∶1。其中木糖（50.97%）和阿拉伯糖（28.47%）的含量最高，阿拉伯糖/木糖為0.56（表1），該結(jié)果與已報(bào)道研究結(jié)果一致，即CBF單糖主要包括阿拉伯糖（29%～36%），半乳糖（4%～6%），葡萄糖（0%～2%），木糖（55%～59%）和葡萄糖醛酸（3%～5%）[29-30]。CBF阿魏酸含量為0.09%，與已報(bào)道相比含量較低[31]，香豆酸和咖啡酸含量低于檢測(cè)限。研究顯示，木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的主要成分為纖維素（40%～45%）、半纖維素（25%～30%）和木質(zhì)素（15%～20%）[31]，CBF成分結(jié)構(gòu)與一般木質(zhì)素纖維明顯不同，可作為底物用于發(fā)酵制備具有半纖維素降解優(yōu)勢(shì)的復(fù)合酶制劑。

表1 CBF的單糖和酚酸組分構(gòu)成Table 1 Compositions of monosaccharides and phenolic acids in CBF

2.2 A.niger和P.carnosa在CBF培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)及發(fā)酵上清液蛋白分析結(jié)果

A.niger和P.carnosa在CBF培養(yǎng)基中均能夠良好生長(zhǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)192 h后，能夠觀察到球狀菌體，發(fā)酵液狀態(tài)變?yōu)槌吻澹▓D1）。

圖1 發(fā)酵培養(yǎng)192 h后的CBF培養(yǎng)基Fig.1 CBF-containing medium after 192 h fermentation

圖2為A.niger和P.carnosa發(fā)酵過程中不同時(shí)間發(fā)酵液SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果。發(fā)酵液中蛋白條帶隨發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)呈現(xiàn)明顯變化，其中A.niger在第48～60小時(shí)變化最為明顯，而P.carnosa在第36～48小時(shí)變化最為明顯。

圖2 不同培養(yǎng)時(shí)間A.niger（A）和P.carnosa（B）發(fā)酵上清液SDS-PAGE圖譜Fig.2 SDS-PAGE patterns of total extracellular proteins in the fermentation supernatants of A.niger (A) and P.carnosa (B)

2.3 A.niger和P.carnosa發(fā)酵液還原糖和蛋白含量

由圖3A可知，A.niger和P.carnosa發(fā)酵液中蛋白質(zhì)量濃度最高分別為1.21 mg/mL（192 h）和1.23 mg/mL（192 h）。發(fā)酵培養(yǎng)過程中，A.niger和P.carnosa發(fā)酵液中蛋白含量逐步上升，A.niger發(fā)酵液蛋白質(zhì)量濃度由12 h的0.70 mg/mL升高至192 h的1.21 mg/mL；其中在48～60 h出現(xiàn)第1個(gè)較快升高的階段，該結(jié)果與SDSPAGE檢測(cè)結(jié)果（圖2A）一致。P.carnosa發(fā)酵液蛋白質(zhì)量濃度由12 h的0.72 mg/mL升高至192 h的1.23 mg/mL，而在36～48 h出現(xiàn)一個(gè)迅速升高的階段，即由0.82 mg/mL升高至1.05 mg/mL，該結(jié)果與SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果（圖2B）一致，推測(cè)該階段P.carnosa可能快速分泌表達(dá)胞外酶以降解CBF。

圖3 A.niger和P.carnosa發(fā)酵液中蛋白質(zhì)量濃度（A）和還原糖濃度（B）變化Fig.3 Changes in extracellular protein (A) and reducing sugar concentration (B) in the fermentation broths of A.niger and P.carnosa

由圖3B可知，A.niger和P.carnosa發(fā)酵液中還原糖濃度最高為40.52 μmol/L和51.37 μmol/mL，均出現(xiàn)在36 h。A.niger和P.carnosa發(fā)酵過程中還原糖濃度變化趨勢(shì)相似。A.niger在12～36 h迅速升高，在36 h達(dá)到最高為40.52 μmol/mL，在36～60 h又迅速降低至8.18 μmol/mL，60～192 h在5.55～9.61 μmol/mL之間呈較低水平波動(dòng)。P.carnosa在36 h達(dá)到最高（51.37 μmol/mL），之后在36～72 h迅速降低至11.91 μmol/mL，72～192 h在11.91～15.23 μmol/mL之間波動(dòng)。

2.4 A.niger和P.carnosa發(fā)酵液中木聚糖酶和α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性

由圖4A可知，A.niger和P.carnosa發(fā)酵液中木聚糖酶活力最高分別為246.58 U/mL（72 h）和367.21 U/mL（60 h）。A.niger發(fā)酵過程中木聚糖酶活力在36～72 h迅速升高，72 h達(dá)到最高，72～120 h緩慢下降至163.09 U/mL，而120～156 h又緩慢上升至208.22 U/mL。P.carnosa發(fā)酵過程中木聚糖酶活力在24～60 h迅速升高，60～84 h緩慢下降至317.86 U/mL，而84～192 h在312.15～350.16 U/mL間波動(dòng)。P.carnosa與A.niger發(fā)酵液中木聚糖酶活性波動(dòng)相似，但P.carnosa在各階段木聚糖酶活性均高于A.niger，是其酶活力的1.38～4.76 倍。A.niger發(fā)酵液木聚糖酶活性在48～60 h升高最快，而P.carnosa發(fā)酵液木聚糖酶活性在36～48 h升高最快，均與發(fā)酵液蛋白質(zhì)量濃度變化呈正相關(guān)（圖3），推測(cè)兩株菌在此階段開始大量分泌表達(dá)木聚糖酶。

圖4 A.niger和P.carnosa發(fā)酵液中木聚糖酶（A）和α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶（B）活力變化Fig.4 Changes in xylanase (A) and arabifurosidase (B) activities in the fermentation broths of A.niger and P.carnos

由圖4B可知，A.niger和P.carnosa發(fā)酵過程中α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性變化趨勢(shì)差異很大。A.niger和P.carnosa發(fā)酵液中α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活力最高分別為57.90 U/mL（144 h）和8.26 U/mL（192 h）。A.niger發(fā)酵液α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性變化很大，在36～84 h迅速升高至42.99 U/mL，84～120 h迅速下降（42.99～22.39 U/mL），形成第1個(gè)峰；隨后由120～144 h迅速升高（22.39～57.90 U/mL），144～180 h迅速下降（57.90～36.49 U/mL），形成第2個(gè)峰；最后在180～192 h又迅速升高至55.13 U/mL。P.carnosa發(fā)酵液α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性同樣呈波動(dòng)變化，但其酶活力相對(duì)于A.niger發(fā)酵液較低，最高僅為8.26 U/mL。發(fā)酵過程中發(fā)酵液中α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性波動(dòng)性變化趨勢(shì)可能有兩個(gè)原因：首先，阿拉伯糖殘基作為CBF支鏈，其與主鏈存在多種連接方式，而不同α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶具有不同催化模式[32-33]，因此，推測(cè)A.niger可能在不同發(fā)酵階段表達(dá)具有不同催化模式的α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶；其次，CBF的降解過程是α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶與木聚糖酶協(xié)同作用的過程，因此，兩種真菌可能在生長(zhǎng)過程中調(diào)控相關(guān)α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶與木聚糖酶基因的協(xié)同表達(dá)，結(jié)果則表現(xiàn)為發(fā)酵液中酶活力的波動(dòng)現(xiàn)象。

綜合發(fā)酵液中還原糖含量和蛋白質(zhì)量濃度變化，以及木聚糖酶和α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性變化規(guī)律，兩種菌在發(fā)酵過程中均存在“分泌胞外酶-酶解CBF-產(chǎn)生低聚糖底物-吸收利用-生長(zhǎng)-再分泌胞外酶”的波動(dòng)現(xiàn)象，而這種通常出現(xiàn)在非連續(xù)補(bǔ)料發(fā)酵培養(yǎng)過程。

2.5 蛋白質(zhì)的鑒定及統(tǒng)計(jì)分析

無標(biāo)記蛋白質(zhì)組分析P.carnosa發(fā)酵液共鑒定出109 種蛋白質(zhì)，包括糖苷水解酶（53/48.62%）、蛋白酶/肽酶（9/8.26%）、脂肪酶/酯酶（14/12.84%）、氧化酶/還原酶（6/5.50%）和假設(shè)蛋白（27/24.77%）（圖5、表2）。CBF發(fā)酵培養(yǎng)P.carnosa分泌表達(dá)的糖苷水解酶比列高于結(jié)晶纖維素（46%）和云杉木（29%）培養(yǎng)，而氧化酶/還原酶分泌表達(dá)比例（5%）低于結(jié)晶纖維素（15%）和云杉木（15%）[22]誘導(dǎo)表達(dá)比例（表2），該結(jié)果表明CBF與結(jié)晶纖維素、云杉木的組成成分和分子結(jié)構(gòu)的差異導(dǎo)致同種菌株會(huì)分泌表達(dá)具有不同組成的復(fù)合酶系。

圖5 CBF發(fā)酵培養(yǎng)A.niger（A）和P.carnosa（B）分泌表達(dá)蛋白質(zhì)的功能分類Fig.5 Functional classification of proteins identified in the secretomes of A.niger (A) and P.carnosa (B) grown in CBF-containing medium

表2 不同底物發(fā)酵培養(yǎng)A.niger和P.carnosa分泌表達(dá)蛋白質(zhì)的功能分類比較Table 2 Functional classification of proteins identified in the secretomes of A.niger and P.carnosa grown in different media %

A.niger發(fā)酵液蛋白質(zhì)組分析共鑒定出105 種蛋白質(zhì)，包括糖苷水解酶（82/78.10%）、蛋白酶/肽酶（9/8.57%）、脂肪酶/酯酶（9/8.57%）、氧化酶/還原酶（2/1.9%）和植酸酶（3/2.86%）（圖5、表2）。CBF發(fā)酵培養(yǎng)A.niger分泌表達(dá)的糖苷水解酶比列高于甘蔗渣（72.28%）和木薯渣（69.57%），氧化酶/還原酶（1.90%）低于甘蔗渣（3.96%）和木薯渣（3.26%）[35]誘導(dǎo)表達(dá)比例（表2）。該結(jié)果與P.carnosa蛋白質(zhì)組分析結(jié)果一致，表明A.niger分泌表達(dá)胞外酶系與發(fā)酵底物組成成分和結(jié)構(gòu)相關(guān)。

蛋白組分析結(jié)果顯示，P.carnosa分泌表達(dá)了完整的纖維素降解酶系（表3）：10 個(gè)內(nèi)切葡萄糖苷酶（GH5、GH12、GH16、GH45和GH74家族）、4 個(gè)纖維二糖酶（GH6和GH7家族）、1 個(gè)β-1,3-葡聚糖酶（GH17家族）和5 個(gè)β-葡萄糖苷酶（GH3、GH31和GH55家族）。研究顯示，白腐菌降解纖維素需要內(nèi)切葡聚糖酶、纖維二糖酶和β-葡萄糖苷酶3 種酶協(xié)同作用[34]，而CBF發(fā)酵培養(yǎng)P.carnosa的蛋白質(zhì)組中能夠檢測(cè)到3 類纖維素降解酶。

表3 CBF發(fā)酵培養(yǎng)P.carnosa分泌表達(dá)的纖維素降解酶類Table 3 Cellulose-degrading proteins identified in the secretome of P.carnosa cultured on CBF

P.carnosa能夠分泌表達(dá)完整的半纖維素降解酶系（表4，圖6），包括4 個(gè)木聚糖酶（GH10和GH11家族）、1 個(gè)β-木糖苷酶（GH3家族）、4 個(gè)α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶（GH43和GH127家族）、3 個(gè)乙酰木聚糖酯酶（CE1家族）和1 個(gè)葡萄糖醛酸酶（GH115家族）、6 個(gè)半乳糖苷酶（GH27、GH35和GH43家族）、2 個(gè)甘露聚糖酶（GH5家族）和3 個(gè)甘露糖苷酶（GH5、GH47和GH92家族）。

圖6 A.niger和P.carnosa分泌表達(dá)糖苷水解酶家族蛋白分布Fig.6 Distribution of glycosyl hydrolase family identified in the secretome of A.niger and P.carnosa grown in CBF-containing medium

表4 CBF發(fā)酵培養(yǎng)P.carnosa分泌表達(dá)的半纖維素降解酶類Table 4 Hemicellulose-degrading enzymes identified in the secretome of P.carnosa cultured on CBF

P.carnosa蛋白質(zhì)組鑒定到6 個(gè)氧化/還原酶，包括過氧化物酶、銅基氧化酶、乙二醛氧化酶、纖維二糖脫氫酶（表4），但未檢測(cè)到錳過氧化物酶和細(xì)胞色素P450單加氧酶。有報(bào)道顯示，P.carnosa基因組含有266 個(gè)預(yù)測(cè)為細(xì)胞色素P450單加氧酶的編碼基因[20]。在已測(cè)序和注釋的木腐擔(dān)子菌中，P.carnosa的P450單加氧酶基因數(shù)量最多，幾乎是P.chrysosporium的2 倍[20]，但本研究顯示，P.carnosa未分泌表達(dá)細(xì)胞色素P450單加氧酶。該結(jié)果與P.carnosa利用云杉及白楊木培養(yǎng)基生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組分析結(jié)果[21-22]不同，可能由于CBF與云杉及白楊木的木質(zhì)素含量和結(jié)構(gòu)存在巨大差異，CBF的木質(zhì)素含量約為7.8%[36]。纖維素和云杉發(fā)酵培養(yǎng)P.carnosa的胞外蛋白質(zhì)組中能夠檢測(cè)到錳過氧化物酶，但不能檢測(cè)到纖維二糖脫氫酶的表達(dá)[22]。此外，云杉發(fā)酵培養(yǎng)P.carnosa還能夠檢測(cè)到過氧化物酶和銅基氧化酶[22]。

P.carnosa分泌表達(dá)了14 個(gè)脂肪酶/酯酶（CE1、CE8、CE15和CE16家族），包括果膠酯酶、糖脂酶、乙酰木聚糖脂酶、羧酸酯酶、葡萄糖醛酸酯酶和脂肪酶（表4），但沒有檢測(cè)到阿魏酸酯酶的表達(dá)。脂肪酶和酯酶底物特異性廣泛，能夠參與水解半纖維素、纖維素的糖酯類支鏈結(jié)構(gòu)酯鍵，如葡萄糖醛酸酯酶可以水解木質(zhì)素和木聚糖葡萄糖醛酸支鏈之間的酯鍵[37]。P.carnosa分泌表達(dá)了9 個(gè)蛋白酶/肽酶，這些蛋白酶可能參與纖維素結(jié)合的蛋白水解。

P.carnosa發(fā)酵液蛋白質(zhì)組中檢測(cè)到27 個(gè)功能未知的假設(shè)蛋白（圖5），該結(jié)果與前期報(bào)道相似[22]。P.carnosa表達(dá)較多假設(shè)蛋白可能是由于國(guó)內(nèi)外對(duì)于該菌種研究報(bào)道很少，對(duì)該菌株分泌表達(dá)蛋白質(zhì)功能研究不足，但這些蛋白可能在木質(zhì)纖維素降解中發(fā)揮重要作用[38]。因此，蛋白質(zhì)組分析也是尋找真菌在特定培養(yǎng)條件下表達(dá)相關(guān)的未知功能蛋白質(zhì)的重要途徑。

蛋白組分析顯示，A.niger分泌表達(dá)完整的纖維素降解酶系（表5），包括12 個(gè)內(nèi)切葡聚糖酶（GH5、GH12、GH16、GH61和GH71家族）、4 個(gè)纖維二糖酶（GH6和GH7家族）和8 個(gè)β-葡萄糖苷酶（GH1、GH3、GH17和GH31家族）。

A.niger也分泌表達(dá)了完整的半纖維素降解酶系（表6），包括2 個(gè)木聚糖酶（GH10家族）、2 個(gè)木糖苷酶（GH3和GH31家族）、9 個(gè)α-阿拉伯呋喃糖苷酶（GH43、GH51、GH54和GH62家族）、1 個(gè)乙酰木聚糖酯酶（CE1家族）、1 個(gè)阿魏酸酯酶和2 個(gè)α-葡萄糖醛酸苷酶（GH67家族）、4 個(gè)半乳糖苷酶（GH3和GH27家族）、1 個(gè)甘露聚糖酶（GH5家族）、3 個(gè)甘露糖苷酶（GH2、GH5和GH47家族）。

表6 CBF發(fā)酵培養(yǎng)A.niger分泌表達(dá)的半纖維素降解酶類Table 6 Hemicellulose-degrading enzymes identified in the secretome of A.niger cultured on CBF

A.niger蛋白質(zhì)組鑒定到2 個(gè)氧化酶/還原酶，分別為單加氧酶和纖維二糖脫氫酶。A.niger分泌表達(dá)了9 個(gè)脂肪酶/酯酶（CE1和CE8家族），包括乙酰木聚糖脂酶、阿魏酸酯酶和果膠酯酶，均為半纖維素主要支鏈降解酶。A.niger分泌表達(dá)了9 個(gè)蛋白酶/肽酶和3 個(gè)植酸酶。與P.carnosa蛋白質(zhì)組分析結(jié)果不同，A.niger發(fā)酵液蛋白質(zhì)組中未檢測(cè)到假設(shè)蛋白。

如圖6所示，A.niger分泌表達(dá)糖苷水解酶的數(shù)量遠(yuǎn)高于P.carnosa，且糖苷水解酶家族分布也存在很大差異。該結(jié)果與已有研究一致，即A.niger具有強(qiáng)大的淀粉糖和非淀粉多糖降解酶系，在分泌表達(dá)糖苷水解方面具有優(yōu)勢(shì)[9]。P.carnosa分泌表達(dá)氧化酶/還原酶數(shù)量高于A.niger（圖5），其在水解利用木質(zhì)素方面有優(yōu)勢(shì)。盡管兩種真菌具有不同的胞外酶系表達(dá)特點(diǎn)，但兩種真菌都能夠利用CBF作為碳源生長(zhǎng)。綜上所述，兩種真菌在降解CBF時(shí)采取不同協(xié)同策略，即分泌表達(dá)具有不同組成的胞外酶系，但又具有相似催化功能和效率。

Label-free技術(shù)分析揭示了兩種真菌發(fā)酵降解CBF所分泌表達(dá)的降解酶系，其中也包括功能未知的假設(shè)蛋白，這為新的糖苷水解酶的鑒定和發(fā)掘提供了方向。此外，蛋白質(zhì)組分析也揭示了發(fā)酵底物組成、結(jié)構(gòu)與微生物分泌表達(dá)胞外酶的相關(guān)性，該結(jié)果可以為設(shè)計(jì)制備最適合降解CBF的復(fù)合酶制劑提供基礎(chǔ)。

3 結(jié)論

CBF中木糖（50.97%）和阿拉伯糖（28.47%）的含量最高，阿拉伯糖/木糖為0.56。以CBF為碳源發(fā)酵培養(yǎng)A.niger和P.carnosa，并測(cè)定發(fā)酵液中還原糖濃度、蛋白質(zhì)量濃度、木聚糖酶和α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶活性變化規(guī)律。結(jié)果顯示，A.niger和P.carnosa發(fā)酵過程中均存在“分泌胞外酶-酶解CBF-產(chǎn)生低聚糖底物-吸收利用-生長(zhǎng)-再分泌胞外酶”的波動(dòng)現(xiàn)象。Label-free技術(shù)分析顯示，A.niger分泌表達(dá)糖苷水解酶的數(shù)量遠(yuǎn)高于P.carnosa，且糖苷水解酶的家族分布也存在很大差異；P.carnosa分泌表達(dá)氧化酶/還原酶數(shù)量高于A.niger。兩種真菌都能夠利用CBF作為碳源生長(zhǎng)，但分泌表達(dá)的不同復(fù)合酶又具有相似催化功能和效率，顯示兩種真菌在降解CBF時(shí)采取不同的多酶協(xié)同策略。Label-free蛋白質(zhì)組分析揭示了兩種真菌發(fā)酵降解CBF所分泌表達(dá)的降解酶系，以及發(fā)酵底物組成、結(jié)構(gòu)與微生物發(fā)酵分泌酶蛋白系的相關(guān)性，該結(jié)果可為設(shè)計(jì)制備最適合降解CBF的復(fù)合酶制劑提供一定基礎(chǔ)。