2 種青稞多糖對胰α-淀粉酶的抑制作用

李志鵬，周晨熠，潘書童，崔澤文，謝 凡，王光強，艾連中，張 匯

（上海理工大學健康科學與工程學院，上海食品微生物工程技術研究中心，上海 200093）

淀粉在體內的消化速率與人體健康息息相關。研究表明，淀粉的快速消化會引起餐后血糖的升高，從而誘發代謝性疾病的發生，如II型糖尿病和心血管疾病，而通過飲食管理調控淀粉消化速率可有效降低代謝性疾病發生的風險[1]。α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶是人體中重要的消化酶，直接參與淀粉的消化[2]。淀粉在進入人體消化道后，通過α-淀粉酶水解成低聚糖，這些低聚糖在α-葡萄糖苷酶的作用下轉化成葡萄糖，并經小腸吸收進入血液，導致餐后血糖升高[3]。因此，抑制胰α-淀粉酶活性可能是延緩淀粉消化，調控淀粉類食物餐后血糖水平的有效途徑，從而預防和緩解II型糖尿病等代謝性疾病[4]。

研究表明，膳食多糖與人體健康息息相關，增加膳食多糖的攝入可以降低肥胖、心血管疾病、II型糖尿病的患病風險[5-6]。谷物中含有豐富的膳食多糖，如阿拉伯木聚糖和β-葡聚糖。青稞是大麥的變種，主要種植在高海拔和寒冷地帶[7]。青稞中含有豐富的膳食多糖，其中青稞阿拉伯木聚糖（highland barley arabinoxylan，HBAX）和青稞β-葡聚糖（highland barleyβ-glucan，HBBG）分別是來源于青稞麩皮和胚乳中的主要膳食多糖[8]。研究表明，HBAX由6 個阿拉伯木聚糖重復單元通過β-1,4糖苷鍵連接而成，其阿拉伯糖和木糖的物質的量比為0.58，與其他谷物麩皮中的阿拉伯木聚糖結構類似[9-10]。HBBG則是以三糖和四糖組成的線性β-葡聚糖，其三糖和四糖比例為1∶1，與燕麥（三糖和四糖比例為1.5∶2.3）等谷物的β-葡聚糖差異顯著[11-12]。有研究表明，谷物多糖會與淀粉相互作用，改變淀粉凝膠的糊化和流變特性，從而減慢淀粉在體內的消化速率[13]。課題組前期研究發現，HBAX和HBBG對淀粉的糊化和流變特性有不同的影響，HBAX可以附著在淀粉顆粒表面，降低淀粉體系黏度，HBBG則與淀粉分子發生交聯，增加了淀粉體系黏度，這表明不同青稞多糖調控淀粉消化的作用機制可能不同[14]。此外，一些研究還表明谷物多糖還可通過抑制α-淀粉酶活性延緩淀粉的消化[15]。然而，谷物多糖通過抑制胰α-淀粉酶調控淀粉消化速率的作用機制尚不明確，解析不同谷物多糖延緩淀粉消化和降低淀粉類主食餐后血糖響應的作用機制對預防和控制相關代謝疾病的發生和發展將發揮重要作用。

本研究以2 種青稞多糖HBAX和HBBG為原料，通過酶活性抑制實驗比較兩者對胰α-淀粉酶活性的影響，通過酶促動力學分析2 種多糖對胰α-淀粉酶抑制方式和類型的差異，采用熒光光譜分析2 種多糖對胰α-淀粉酶的相互作用關系，以期闡明HBAX和HBBG抑制胰α-淀粉酶活性的異同。本研究將為不同青稞多糖在淀粉消化調控和低血糖生成指數食物中的應用提供一定理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青稞仁和青稞麩皮均來自青海省；豬胰α-淀粉酶和可溶性淀粉（來源于馬鈴薯）上海源葉生物科技有限公司；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、酒石酸鉀鈉、3,5-二硝基水楊酸、苯酚、氫氧化鈉 國藥集團化學試劑有限公司。所有化學試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

725型紫外-可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司；RF6000熒光分光光度計 日本島津公司；C-MAG MS10磁力攪拌器 德國IKA公司；DK-8AD型電熱恒溫水槽 上海一恒科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 2 種青稞多糖的制備

參考Zhang Hui等[11]的方法，從青稞仁中提取β-葡聚糖。青稞仁粉分散于70%乙醇溶液，攪拌12 h（料液比1∶10（g/mL）），去除油脂、低聚糖等成分。脫脂后的青稞仁粉按料液比1∶10（g/mL）加入去離子水和高溫α-淀粉酶（4 000 U/g），在95 ℃反應30 min，冷卻至室溫后，加入NaOH溶液使體系中NaOH濃度為0.5 mol/L，室溫下攪拌3 h，離心，上清液用鹽酸（2 mol/L）調節pH 5.0，靜置過夜后4 500 r/min離心，上清液透析，濃縮，冷凍干燥得到HBBG，得率為4.3%。通過AOAC 991.43的方法，測得β-葡聚糖含量為85.50%[11]。

根據徐中香等[16]的方法，從青稞麩皮中提取阿拉伯木聚糖。青稞麩皮粉采用95%乙醇溶液脫脂，脫脂的青稞麩皮粉按料液比1∶10（g/mL）加入去離子水和高溫α-淀粉酶（4 000 U/g），95 ℃反應30 min，冷卻至室溫后，離心，料渣干燥。脫脂、脫淀粉后的青稞麩皮粉按料液比1∶25（g/mL）加入0.375 mol/L的NaOH溶液，55 ℃攪拌萃取3 h，離心，上清液用鹽酸（2 mol/L）調節pH 4.5，靜置過夜后4 500 r/min離心，上清液透析，濃縮，冷凍干燥得到HBAX，得率為3.7%。根據苗露等[17]的方法，通過高效陰離子交換色譜測得阿拉伯木聚糖含量為75.57%。

1.3.2 2 種青稞多糖對胰α-淀粉酶的抑制作用測定

參考張永均等[18]的方法并進行適當修改。將可溶性淀粉（來源于馬鈴薯，10 mg/mL）溶于磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（0.02 mol/L，pH 6.8）溶液中，置于95 ℃條件下糊化20 min，冷卻至室溫后使用。將HBAX或HBBG溶解在相同濃度PBS中配制成不同濃度的多糖溶液。胰α-淀粉酶（1 mg/mL）溶解在相同濃度PBS中并在5 000 r/min離心10 min，取上清液于4 ℃保存。

移取適量的胰α-淀粉酶溶液與多糖溶液或PBS（空白）混合，使HBAX或HBBG終質量濃度為0～7 mg/mL或者0～15 mg/mL，胰α-淀粉酶終質量濃度為0.5 mg/mL。將混合溶液于37 ℃孵育10 min后加入糊化后的淀粉溶液0.5 mL（10 mg/mL），混勻后繼續孵育5 min。反應結束后加入1 mL 3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）溶液，混勻，沸水浴5 min，反應結束后冷卻至室溫，再加入10 mL去離子水稀釋，混合均勻后測定混合溶液在540 nm波長處的吸光度。

背景組是以滅活酶溶液與多糖溶液或者PBS（空白）混合，其余步驟一致。IC50值為抑制50%酶活力所需的抑制劑質量濃度，通過對抑制率曲線多變量非線性回歸計算獲得。不同青稞多糖對胰α-淀粉酶的抑制率通過式（1）計算：

式中：A1為樣品組與樣品背景組吸光度的差值；A2為對照組（以同等體積PBS代替多糖溶液）與對照背景組吸光度的差值。

1.3.3 2 種青稞多糖對胰α-淀粉酶的抑制方式分析

應注重學科最新成果和技術的運用 在介紹國內外最新理論或國家政策的同時，還應增加最新的技術成果的應用，加強教材的時代性和科學性。

按照1.3.2節方法，在1 mL反應體系中，移取不同質量濃度的HBAX（0～1.6 mg/mL）或HBBG（0～8 mg/mL）溶液0.25 mL，加入不同質量濃度酶（0.1～0.4 mg/mL）溶液0.25 mL，37 ℃孵育10 min后加入糊化后的可溶性淀粉（16 mg/mL）溶液0.5 mL，繼續孵育2 min，反應結束后加入1 mL DNS試劑，混勻，沸水浴5 min，冷卻至室溫，加入10 mL去離子水稀釋，混合均勻后測定混合溶液在540 nm波長處的吸光度。通過測定反應體系吸光度的變化，作出酶促反應速率（ΔA/min）與胰α-淀粉酶質量濃度的關系曲線圖。根據曲線圖特點判斷HBAX和HBBG對胰α-淀粉酶的抑制方式（可逆或不可逆）。

1.3.4 2 種青稞多糖對胰α-淀粉酶的抑制類型分析

按照1.3.2節方法，在1 mL反應體系中，移取不同質量濃度的HBAX（0～1.6 mg/mL）或HBBG（0～8 mg/mL）溶液0.25 mL，加入0.4 mg/mL酶溶液0.25 mL，37 ℃孵育10 min后加入不同質量濃度糊化后的可溶性淀粉溶液0.5 mL（1～9 mg/mL），繼續孵育2 min，反應結束后加入1 mL DNS試劑，混勻，沸水浴5 min，冷卻至室溫，加10 mL去離子水稀釋，混勻后測定混合溶液在540 nm處的吸光度。以可溶性淀粉溶液濃度的倒數1/S為橫坐標，酶促反應速率（ΔA/min）的倒數1/V為縱坐標，作出Lineweaver-Burk雙倒數曲線圖，根據曲線特點判斷HBAX和HBBG對胰α-淀粉酶的抑制類型。

競爭性抑制：

非競爭性抑制：

以直線的斜率和縱坐標截距分別對HBAX和HBBG質量濃度進行二次作圖，可求得抑制劑對酶的抑制常數KI和酶-底物復合物的抑制常數KIS，計算如式（4）、（5）所示：

式中：V為初始反應速率/（ΔA/min）；S為底物質量濃度/（m g/m L）；Vmax為最大初始反應速度/（ΔA/min）；I為抑制劑質量濃度/（mg/mL）；Km為米氏常數/（mg/mL）；KI和KIS分別為抑制劑與酶和酶-底物復合物結合的平衡常數/（mg/mL）。

1.3.5 2 種青稞多糖對胰α-淀粉酶熒光猝滅分析

1.3.6 2 種青稞多糖對胰α-淀粉酶熒光猝滅機制分析

熒光猝滅可分為動態猝滅和靜態猝滅，猝滅類型的判斷可由KSV或Ka值區分。為了驗證青稞多糖與胰α-淀粉酶之間的猝滅機理，采用Stern-Volmer方程分析猝滅數據，見式（6）：

式中：F0為不存在猝滅劑時相對穩定的熒光強度；F為存在猝滅劑時熒光強度；[Q]為猝滅劑質量濃度/（mg/mL）；τ0為沒有猝滅劑存在情況下熒光分子的平均壽命，約為10－8s；Ka為雙分子猝滅速率常數/（mL/（mg·s））；KSV為Stern-Volmer猝滅常數/（mL/mg）。

2 種青稞多糖的結合常數和結合位點數由式（7）確定：

式中：K為表觀結合常數/（mL/mg）；n為結合位點數。

1.4 數據分析

所有實驗一式三份，并使用Microsoft Excel計算各參數平均值和標準差，由Origin 2021軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 2 種青稞多糖對胰α-淀粉酶的抑制作用分析

淀粉需要通過α-淀粉酶的初步水解，才能被α-葡萄糖苷酶水解為可供人體吸收的葡萄糖。因此，抑制胰α-淀粉酶活性可有效地降低淀粉的消化速率。據報道，一些天然多糖能抑制胰α-淀粉酶活性[20]。為研究不同青稞多糖對胰α-淀粉酶的抑制作用，在相同質量濃度的胰α-淀粉酶溶液中加入不同濃質量度多糖溶液，分析HBAX和HBBG對胰α-淀粉酶活性的影響，結果如圖1所示。隨著HBAX和HBBG質量濃度的升高，兩者對胰α-淀粉酶的抑制率均增大，這表明HBAX和HBBG均能抑制胰α-淀粉酶活性。但兩者對胰α-淀粉酶抑制速率變化存在顯著差異：隨著HBAX質量濃度的增加，其對胰α-淀粉酶的抑制作用逐漸增大，最后達到最大抑制率74%左右；而HBBG在低質量濃度范圍（0～7 mg/mL）時，對胰α-淀粉酶的抑制率變化不大，從17%上升至27%，在高質量濃度范圍（7～15 mg/mL），對胰α-淀粉酶的抑制率從27%快速上升至56%。HBAX和HBBG對胰α-淀粉酶的IC50值分別為3.26 mg/mL和13.23 mg/mL，這表明在相同質量濃度下，HBAX對胰α-淀粉酶的抑制效果顯著優于HBBG。綜上所述，HBAX和HBBG對胰α-淀粉酶都具有抑制作用，但是HBAX的抑制活性強于HBBG。

2.2 不同青稞多糖對胰α-淀粉酶的抑制方式判斷

HBAX和HBBG對胰α-淀粉酶活性的抑制能力不同，這可能與其抑制機制不同有關。由圖2可知，在相同多糖質量濃度下，酶初始反應速率隨胰α-淀粉酶質量濃度的增加而增加。此外，不同質量濃度HBAX和HBBG酶初始反應速率與酶質量濃度的線性關系曲線都通過原點，表明HBAX和HBBG對胰α-淀粉酶的抑制均為可逆抑制[21]。可逆性抑制說明HBAX和HBBG均是通過非共價鍵（疏水相互作用、氫鍵等）與胰α-淀粉酶相互作用，導致酶活力降低[22]。結果表明，HBAX與HBBG對胰α-淀粉酶的抑制方式相同，但是這2 種多糖對胰α-淀粉酶的抑制類型還需要進一步研究。

圖2 不同質量濃度HBAX（A）和HBBG（B）對胰α-淀粉酶反應速率的影響Fig.2 Effects of HBAX (A) and HBBG (B) at various concentrations on the reaction rate of pancreatic α-amylase

2.3 2 種青稞多糖對胰α-淀粉酶的抑制類型判斷

HBAX和HBBG對胰α-淀粉酶的抑制均為可逆抑制，而可逆抑制又分為競爭性抑制、非競爭性抑制、反競爭性抑制和混合型抑制[23]。通過Lineweaver-Burk雙倒數圖可判斷2 種多糖對胰α-淀粉酶的抑制類型[24]。其中，擬合曲線在X軸上的截距代表－1/Km值，Y軸截距代表1/Vmax值。由圖3A所示，隨著HBAX質量濃度增加，Km值由1.89 mg/mL增大至2.04 mg/mL，Vmax值由0.17 ΔA/min減小至0.04 ΔA/min，這表明HBAX對胰α-淀粉酶的抑制為競爭性和非競爭性的混合型抑制。由圖3B可知，隨著HBBG質量濃度增加，Km值由5.26 mg/mL減小至3.57 mg/mL，Vmax值由0.28 ΔA/min減小至0.16 ΔA/min，這表明HBBG對胰α-淀粉酶的抑制為反競爭性和非競爭性的混合型抑制。競爭性和非競爭性混合抑制說明HBAX既能與淀粉競爭同一活性位點結合在酶的活性部位，阻礙酶和底物的結合，使酶促反應速率下降，又能通過非競爭性抑制與酶的非活性部位結合，形成酶-底物-抑制劑復合物，從而阻斷酶促反應的進行[25]。反競爭性和非競爭性混合抑制說明HBBG不僅能夠與酶的非活性部位結合，還能與酶-淀粉復合物結合，形成酶-底物-抑制劑復合物。

表1 HBAX和HBBG對胰α-淀粉酶的抑制常數Table 1 Inhibitory constants of HBAX and HBBG on the activity of pancreatic α-amylase

圖3 不同質量濃度HBAX（A）、HBBG（B）抑制胰α-淀粉酶的Lineweaver-Burk及HBAX（C）、HBBG（D）質量濃度與斜率的關系Fig.3 Lineweaver-Burk plots for inhibition of pancreatic α-amylase by HBAX (A) and HBBG (B) at different concentrations,and plots of the slope versus the concentration of HBAX (C) and HBBG (D)

HBAX和HBBG對胰α-淀粉酶的抑制類型不同，其在胰α-淀粉酶上的結合位點數也可能不同。通過斜率與HBAX（R2=0.994 1）或HBBG（R2=0.907 9）質量濃度作線性相關圖，如圖3C、D所示，表明HBAX和HBBG在胰α-淀粉酶上有一個或者一種結合位點[26]。綜上所述，HBAX和HBBG在胰α-淀粉酶上的結合位點數相同，但2 種多糖對胰α-淀粉酶的抑制類型不同，這可能導致2 種多糖對胰α-淀粉酶產生不同的抑制效果。

2.4 2 種青稞多糖對胰α-淀粉酶的抑制常數計算

KI和KIS分別是抑制劑與酶或者酶-底物復合物結合的平衡常數，其值可以反映抑制劑和酶或酶-底物復合物親和力的大小，親和力越大，代表抑制劑與酶或酶-底物復合物結合越緊密，其抑制效果越好[27]。HBAX和HBBG的KI和KIS值如表1所示，HBAX的KI和KIS值均小于HBBG，說明HBAX對胰α-淀粉酶的抑制能力遠大于HBBG，這與IC50值結果一致。HBAX的KI值小于KIS值，而HBBG的KI遠大于KIS值，這說明HBAX和HBBG與酶或者酶-底物復合物的親和力不同，HBAX對酶的親和力強于酶-底物，而HBBG對酶-底物復合物親和力更強[28]。綜上所述，雖然HBAX和HBBG都是混合型抑制，但是HBAX和HBBG對酶或酶-底物復合物親和力不同，這可能是其對胰α-淀粉酶抑制效果不同的原因之一。

2.5 2 種青稞多糖對胰α-淀粉酶熒光光譜分析

酶抑制動力學分析結果表明，HBAX和HBBG對胰α-淀粉酶的抑制類型不同，HBAX更傾向于與酶直接結合，而HBBG更容易形成酶-底物-抑制劑復合物。但是，這2 種多糖與酶的相互作用機制仍不明確。通過熒光光譜不僅能監測多糖與蛋白質的結合，還能得出多糖與蛋白質結合機制、結合常數以及猝滅常數等信息[29]。胰α-淀粉酶的內源熒光性主要來源于色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸，其中色氨酸和酪氨酸的激發波長為280 nm，最大熒光強度在340 nm左右[29]。此外，最大熒光強度的波長能反映這些芳香族氨基酸所處微環境的變化[30]。如圖4所示，隨著多糖質量濃度增大，胰α-淀粉酶在340 nm處的熒光強度逐漸降低，這說明HBAX或HBBG與胰α-淀粉酶皆存在相互作用[31]。胰α-淀粉酶發生熒光猝滅表明青稞多糖可能與胰α-淀粉酶的色氨酸和酪氨酸發生靜電相互作用或氫鍵作用，從而使酶的空間構象發生一定改變，導致酶活性下降。圖4還表明在相同質量濃度水平下，HBAX對胰α-淀粉酶的熒光猝滅作用強于HBBG，說明HBAX與胰α-淀粉酶的相互作用強于HBBG，這與酶抑制作用實驗結果一致。此外，隨著HBAX質量濃度增加，胰α-淀粉酶的最大熒光強度波長發生紅移現象，說明HBAX對胰α-淀粉酶的相互作用改變了胰α-淀粉酶中色氨酸和酪氨酸的微環境，胰α-淀粉酶的色氨酸和酪氨酸殘基的疏水結構發生改變，極性增加，疏水性降低[32]。HBBG最大熒光強度的波長并未發生紅移或者藍移現象，說明HBBG不改變胰α-淀粉酶中色氨酸和酪氨酸的微環境。因此，HBAX和HBBG都能與胰α-淀粉酶相互作用，但是HBAX對胰α-淀粉酶內部微環境影響更大。

圖4 不同質量濃度HBAX（A）和HBBG（B）對胰α-淀粉酶的熒光猝滅光譜Fig.4 Fluorescence quenching spectra of pancreatic α-amylase by HBAX (A) and HBBG (B) at various concentrations

2.6 2 種青稞多糖對胰α-淀粉酶結合位點和結合常數計算

熒光猝滅過程可分為動態猝滅和靜態猝滅[33]。對于動態猝滅來說，隨著溫度的升高，反應體系的擴散系數增加，分子運動加快，猝滅常數KSV增大；反之，靜態猝滅隨著溫度升高，相互作用產物遭到破壞，猝滅常數KSV減小[34]。通過Stern-Volmer方程，分析了3 個溫度下（298、304、310 K）HBAX和HBBG對胰α-淀粉酶的熒光猝滅規律，結果如圖5所示，熒光猝滅分析的KSV和Ka值的計算結果如表2所示。結果表明，當溫度從298 K上升至310 K時，HBAX的KSV值從1.50 mL/mg降低至0.92 mL/mg，HBBG的KSV值從0.20 mL/mg降低至0.16 mL/mg，這表明HBAX和HBBG與胰α-淀粉酶的猝滅類型皆為靜態猝滅[35]。根據文獻報道，靜態猝滅說明酶抑制劑與胰α-淀粉酶形成了非熒光復合物，從而引起熒光強度的降低[36]。此外，KSV值反映了多糖的擴散和與酶的碰撞對酶熒光壽命衰減速率的影響，HBAX的KSV值遠大于HBBG，這說明HBAX對胰α-淀粉酶內源熒光的影響更大。

表2 HBAX和HBBG在不同溫度下對胰α-淀粉酶的猝滅參數Table 2 Quenching parameters of HBAX and HBBG against pancreatic α-amylase at different temperatures

圖5 HBAX（A）、HBBG（B）不同溫度下對α-淀粉酶的Stern-Volmer曲線以及HBAX（C）、HBBG（D）對胰α-淀粉酶猝滅作用的對數曲線Fig.5 Stern-Volmer plots for the quenching of pancreatic α-amylase by HBAX (A) and HBBG (B) at different temperatures,and plots of lg[(F0-F)/F]versus lg[Q]for quenching effects of HBAX (C) and HBBG (D) on pancreatic α-amylase

HBAX和HBBG與胰α-淀粉酶的結合常數（K）和結合位點數（n）計算結果如表2所示。HBAX和HBBG在不同溫度（298、304、310 K）下結合位點n均近似于1，推測HBAX和HBBG與胰α-淀粉酶有一個或一種類型的結合位點，這與前面Lineweaver-Burk圖結果一致。同時，K值能反映抑制劑與酶的親和力，K值越大，抑制劑與酶的親和力越高。HBAX的K值遠大于HBBG，說明HBAX對酶活性抑制強于HBBG，這與前面IC50值結果一致。綜上所述，HBAX和HBBG在胰α-淀粉酶皆有一個或一種類型的結合位點，但是HBAX對胰α-淀粉酶的結構影響更大，這可能是其抑制作用更強的原因之一。

3 結論

通過酶促動力學和熒光猝滅分析比較了HBAX和HBBG對胰α-淀粉酶的抑制作用，證明了HBAX和HBBG通過與胰α-淀粉酶相互作用抑制酶促反應，但HBAX的抑制能力顯著優于HBBG。酶促動力學分析表明HBAX不僅能與酶活性位點結合，還能形成酶-淀粉-抑制劑復合物阻礙酶反應，而HBBG只能和酶的非活性位點結合形成酶-淀粉-抑制劑復合物，這可能是HBAX抑制作用強于HBBG的原因之一。此外，HBAX和HBBG均能通過靜態猝滅胰α-淀粉酶的內源熒光，但HBAX還能使胰α-淀粉酶內部疏水環境極性增加，這可能是HBAX抑制作用強于HBBG的另一重要原因。該研究表明，不同青稞多糖延緩淀粉消化和降低淀粉類主食餐后血糖響應的作用機制不同，后續將通過熱力學理論進一步研究不同青稞多糖與α-淀粉酶相互作用的分子機理。