不同真菌固態發酵對谷物多酚含量和抗氧化性的影響

徐莉娜，郭 尚，李艷婷，郭偉偉

（山西農業大學 山西功能食品研究院，山西 太原 030031）

谷物食品是全球膳食的主要來源。在許多發展中國家，兒童食用的大多數食品都屬于谷物食品。谷物食品中含有大量的植酸，對絕大多數金屬離子有極強的絡合能力[1]。除此之外，谷類還能為人類提供膳食纖維、碳水化合物、維生素、蛋白質和多種礦物質[2]。但是，傳統烹飪方式會降低谷物微量營養素如鐵、鋅、賴氨酸和蛋氨酸的生物可利用性[3]。其次，盡管全谷物食品富含營養，但許多成人和兒童基于谷物的口感不太好，并不會直接作為主食。這在很大程度上限制了谷物產品的發展。

我國傳統發酵食品主要是由大麥、小麥和豌豆發酵而來，距今已有超過3 000 a的歷史[4]。高等真菌在發酵食品中應用已久，研究它們的生物學特性對于篩選發酵劑、強化基質營養必不可少[5]。BEI等[6]研究發現，發酵可以激活基質的內源性酶，從而產生具有減少抗營養因子的產物，而這些酶的活化程度取決于所使用的原料[7]。趙丹等[8]和POSTEMSK等[9]研究發現，谷物固態發酵不僅在一定程度上改善了基質的營養成分，還促進了機體腸道微生物對營養的吸收。除此之外，谷物發酵過程中，還可能形成新的生物活性化合物，如益生菌低聚糖或其他代謝物[10-12]。

雖然目前對于真菌固態發酵產物的營養成分已有研究報道，但其主要從蛋白質、碳水化合物、脂肪和維生素等方面進行[8-9]，對多酚含量與抗氧化性的相關性研究相對較少。因此，了解清楚不同發酵谷物之間多酚積累特性及其對抗氧化性的影響，對開發新型功能食品原料具有重要意義。

山西功能食品研究院食用菌資源研發團隊常年進行真菌固態發酵的研究，發現在實驗室現有條件下，采用雙孢蘑菇AS2796 和嗜藍孢孔菌G1 固態發酵谷物，其發酵產物的營養價值和抗氧化性有很大提升。因此，本研究以棱柄馬鞍菌X1 菌株、雙孢蘑菇AS2796 菌株和嗜藍孢孔菌F.G1 為發酵菌株，以山西常見的10 種谷物（小麥、大米、燕麥、玉米、小米、藜麥、蕎麥、大豆、豌豆和高粱）為發酵基質，對比研究3 株真菌菌株通過固態發酵對發酵基質總酚含量和抗氧化性能的影響，旨在為進一步開發口感佳、營養豐富的功能食品提供科學指導和理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 雙孢蘑菇（Agaricus blazei）AS-2796 購自上海農業科學院食用菌研究所。棱柄馬鞍菌（Helvella lacunosa）X1（GenBank 登錄號KY 865326）和嗜藍孢孔菌（Fomitiporia yanbeiensis）F.G1（GenBank 登錄號為KT 861405）保存于山西農業大學山西功能食品研究院。供試谷物（小麥、大米、燕麥、玉米、小米、藜麥、蕎麥、大豆、豌豆和高粱）由山西功能食品研究院提供。

1.1.2 培養基制備 在發酵前，選取完整谷物籽粒，去殼，洗凈，用水浸泡6 h。固態發酵底物由谷物（200 g）、葡萄糖（1.6 g）、酵母膏（0.4 g）、KH2PO4（1.0 g）、MgSO4·7H2O（0.5 g）、FeCl3（0.05 g）和CaCl2·2H2O（0.1 g）組成，含水量65%，初始pH 值為6.5。

1.2 方法

1.2.1 固態發酵 發酵底物121 ℃高壓滅菌30 min，挑取帶PDA 培養基的菌塊（直徑8.0 mm）室溫下接種，25 ℃避光培養。發酵過程中，每隔7 d 取一次樣，共取6 次，即未發酵谷物（CK）、發酵7 d（7FM）、發酵14 d（14FM）、發酵21 d（21FM）、發酵128 d（28FM）、發酵35 d（35FM）。樣品在60 °C 條件下過夜干燥，研磨并過0.4 mm 篩，備用。

1.2.2 谷物乙醇提取物 發酵完成以后，稱取8.0 g樣品置于三角瓶中，加入50 mL 乙醇（80%），25 ℃下浸提24 h，抽濾，去濾液，濾渣用200 mL 的乙醇（75%）復提，2 次濾液合并，45 ℃旋轉蒸發得濃縮液，置于4 ℃保存，備用。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 總酚含量的測定 發酵物的總酚含量采用Folin-Cioncalteu 比色法測定[13]。

1.3.2 抗氧化活性分析

1.3.2.1 DPPH 自由基清除活性測定 將1 mL 醇提物和4 mL DPPH（0.004%）溶液混合，劇烈搖動，搖勻后置于黑暗處反應30 min，以2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT）作對照，然后采用紫外分光光度計在517 nm 處測定溶液的吸光度[14]。

式中，A1為樣品吸光度；A0為空白對照組吸光度。

1.3.2.2 還原力的測定 不同濃度的乙醇提取物（1.0 mL）與2.5 mL 磷酸鹽緩沖液（50 mmol/L，pH值7.0）和2.5 mL1%鐵氰化鉀混合，混合物在50 ℃下保溫20 min。為了避免鐵氰化鉀對試驗結果的干擾，在混合物中加入2.5 mL 的三氯乙酸（10%），3 000 r/min 離心10 min 后除去沉淀。最后，將1.25 mL 上清液與1.25 mL 蒸餾水和0.25 mL FeCl3溶液（0.1%，w/v）混合，靜置10 min，700 nm 處測定吸光度值[14]。

1.3.2.3 超氧陰離子自由基清除活性測定 取0.2 mL 醇提物于試管中，加入3 mL Tris-HCl 緩沖液（pH 值8.2，0.05 mol/L），25 ℃條件下水浴10 min，加入預熱的鄰苯三酚12 μL，混勻后精確反應4 min，然后用0.5 mL 鹽酸（10 mol/L）終止反應，以抗壞血酸為對照，于560 nm 處測定吸光度[14]。

式中，A1為樣品吸光度；A0為空白對照組吸光度。

1.3.2.4 鐵離子螯合能力測定 取0.4 mL 乙醇提物，分別加入200 μL FeCl2溶液（0.5 mmol/L）和1.8 mL 甲醇溶液，室溫靜置5 min 后，再加入0.8 mL鄰菲咯琳亞鐵離子鐵試劑（5 mmol/L），室溫反應10 min，以EDTA 為陽性對照，在550 nm 處測定吸光度[14]。較低的吸光度表明較高的螯合能力。

式中，A1為樣品吸光度；A0為空白對照組吸光度。

1.4 數據分析

采用SPSS 16.0 進行數據差異顯著性分析，采用Ducan's 進行多重檢驗（P＜0.05）進行顯著性分析；采用ORIGIN 7.5 繪制圖表，每個樣品混合重復測樣3 次，測量結果取平均值。采用EC50計算軟件計算EC50值（EC50為半最大效應濃度，指自由基清除率達到50%時所需要的樣品含量）。EC50越小表示樣品的抗氧化性越強。

2 結果與分析

2.1 發酵產物總酚含量

如圖1～3 所示，10 種谷物經過3 株菌種（AS 2796、X1 菌株和F.G1）固態發酵后，發酵產物中總酚含量隨發酵菌株和發酵時間的變化而變化。由圖1 可知，經AS2796 固態發酵后，小麥、大米、小米、藜麥、燕麥和大豆的總酚含量與發酵時間呈顯著正相關，相關系數（r）分別為0.938、0.655、0.940、0.935、0.766 和0.676。發酵35 d 后，6 種谷物的總酚含量達到最大值，小麥、大米、小米、藜麥、燕麥和大豆總酚含量分別為3.40、0.76、0.74、1.38、3.16、0.63 mg/g，分別是對照組的1.58 倍、1.21 倍、2.51 倍、1.97 倍、2.09 倍、1.24 倍。玉米、蕎麥和豌豆的總酚含量與發酵時間呈正相關（r分別為0.183、0.447 和0.240），發酵28 d 后，玉米的總酚含量最大值為3.28 mg/g，是對照的0.98 倍。高粱的總酚含量與發酵時間呈負相關（r=-0.704），發酵7 d 后，高粱的總酚含量最大值為2.72 mg/g，比對照低10.82%。

圖1 AS2796 固態發酵對不同谷物總酚含量的影響Fig.1 Effects of solid-state fermentation by AS2796 on total phenol content of different grains

從圖2 可以看出，經X1 菌株發酵后，小米、燕麥、藜麥、小麥和大豆的總酚含量與發酵時間呈顯著正相關，相關系數（r）分別為0.930、0.898、0.911、0.764 和0.770。發酵35 d 后，小米、燕麥、藜麥、小麥和大豆5 種發酵谷類作物的總酚含量達到最大值，分別為3.38、3.30、1.30、3.06、0.57 mg/g，分別是對照組的1.57 倍、2.21 倍、1.86 倍、2.03 倍和1.10倍。大米、蕎麥和豌豆的總酚含量與發酵時間呈正相關（r分別為0.435、0.398 和0.132）；玉米和高粱的總酚含量與發酵時間呈負相關（r分別為-0.399和-0.723），發酵7 d 后，玉米的總酚含量最大值為3.18 mg/g，比對照低0.30%；高粱的總酚含量最高值為2.68 mg/g，比對照低12.00%。

圖2 X1 菌株固態發酵對不同谷物總酚含量的影響Fig.2 Effects of solid-state fermentation by X1 on total phenol content of different grains

從圖3 可以看出，F.G1 固態發酵后，小米、燕麥、藜麥、小麥、蕎麥和大米的總酚含量與發酵時間呈顯著正相關，相關系數（r）分別為0.918、0.520、0.927、0.927、0.763 和0.557。發酵35 d 后，小米、燕麥、藜麥、小麥、蕎麥和大米6 種發酵谷類作物的總酚含量達到最大值，分別為3.43、0.68、3.69、1.33、3.00、5.80 mg/g，分別是對照組的1.60 倍、1.08 倍、2.48 倍、1.90 倍、1.99 倍和1.38 倍。大豆和豌豆的總酚含量與發酵時間呈正相關（r分別為0.215 和0.374）。大豆和豌豆的最大值分別為對照的0.96 倍和1.09 倍。玉米和高粱的發酵時間與總酚含量之間呈負相關（r分別為-0.194 和-0.680），其中，玉米總酚含量最大值為3.09 mg/g（發酵35 d），比對照低4.08%；高粱的總酚含量最大值為2.71 mg/g（發酵7 d 后），比對照低11.15%。

圖3 F. G1 固態發酵對不同谷物總酚含量的影響Fig.3 Effects of solid-state fermentation by F. G1 on total phenol content of different grains.

試驗結果表明，菌株AS2796 發酵的8 種谷物（玉米、大米、小米、燕麥、高粱、藜麥、大豆和豌豆）的最大多酚含量顯著高于X1 菌株和F.G1 菌株發酵的谷物（P＜0.05）；F.G1 菌株對小麥和蕎麥總酚含量的改善程度顯著高于X1 菌株和AS2796 菌株（P＜0.05）。

2.2 發酵產物的抗氧化性能分析

2.2.1 發酵產物對DPPH 自由基的清除能力 表1結果表明，AS2796 發酵的小麥、玉米、大米、小米、藜麥、燕麥、高粱、蕎麥、大豆和豌豆對DPPH 自由基的清除能力與發酵時間的相關系數分別為-0.827、-0.710、-0.939、-0.857、-0.797、-0.626、-0.750、-0.762、-0.745 和-0.846；10 種發酵谷物的最小EC50值分別為0.07、1.29、9.35、0.16、0.17、1.94、0.01、0.46、0.07、0.08 mg/mL，比對照分別低0.12%、13.33%、33.32%、0.89%、0.38%、45.63%、0.32%、8.2%、0.24%和0.61%。發酵35 d 后，EC50值均為最低。

表1 AS2796 發酵產物的抗氧化性能的EC50值Tab.1 EC50 values of fermentation products by AS2796 in antioxidant propertiesmg/mL

表2 結果表明，X1 菌株發酵的10 種谷物（小麥、玉米、大米、小米、藜麥、燕麥、高粱、蕎麥、大豆和豌豆）對DPPH 自由基的清除能力與發酵時間的相關系數分別為-0.830、-0.711、-0.938、-0.859、-0.797、-0.612、-0.752、-0.766、-0.748 和-0.854；其最低EC50值分別為0.16、1.38、9.44、0.23、0.24、2.01、0.17、0.55、0.16、0.17 mg/mL。發酵35 d 后，EC50值均為最低。

表2 X1 菌株發酵產物抗氧化性能的EC50值Tab.2 EC50 values of fermentation products by X1 in antioxidant propertiesmg/mL

表3 結果表明，F.G1 發酵的10 種谷物（小麥、玉米、大米、小米、藜麥、燕麥、高粱、蕎麥、大豆和豌豆）對DPPH 自由基的清除能力與發酵時間的相關系數分別為-0.814、-0.690、-0.938、-0.849、-0.792、-0.626、-0.734、-0.731、-0.705 和-0.805；10 種發酵谷物的最小EC50值分別為0.07、1.29、9.35、0.16、0.17、1.94、0.08、0.46、0.07、0.08 mg/mL，比對照分別低0.82%、14.08%、33.54%、1.42%、0.59%、47.09%、1.28%、0.94%、1.67%和2.43%。發酵35 d后，EC50值均為最低。

表3 F.G1 發酵產物抗氧化性能的EC50值Tab.3 EC50 values of fermentation products by F. G1 in antioxidant propertiesmg/mL

上述結果表明，3 株真菌中，AS2796 菌株發酵的谷物對DPPH 自由基的清除能力更強。

2.2.2 發酵產物的還原力分析 表1 結果表明，AS2796 發酵后的10 種谷物其還原力與發酵時間的相關系數分別為-0.994、-0.927、-0.864、-0.929、-0.898、-0.975、-0.965、-0.940、-0.907 和-0.963；其EC50值最低分別為4.03、14.07、12.11、7.98、8.19、4.45、5.25、7.31、0.42、0.33 mg/mL。發酵35 d 后，除大豆（21 d）外，EC50值均為最低。

表2 結果表明，X1 菌株發酵后的10 種谷物的還原力與發酵時間的相關系數分別為-0.984、-0.925、-0.884、-0.921、-0.888、-0.915、-0.925、-0.932、-0.901 和-0.923；其最低EC50值分別為4.18、14.22、12.26、8.11、8.32、4.58、5.4、7.46、0.43、0.17 mg/mL，分別比對照低0.96%、41.59%、14.92%、13.09%、17.77%、21.46%、12.97%和56.56%。發酵35 d 后，除大豆（21 d）外，EC50值均為最低。

表3 結果表明，F.G1 發酵后的10 種谷物的還原力與發酵時間的相關系數分別為-0.991、-0.928、-0.832、-0.928、-0.894、-0.976、-0.935、-0.943、-0.909和-0.959；其最低EC50值分別為4.07、14.11、12.15、8.02、8.23、4.49、5.29、7.35、0.06、0.37 mg/mL。發酵35 d 后，除大豆（21 d）外，EC50值均為最低。

表1～3 結果表明，菌株AS 2796 發酵谷物的還原力要顯著高于X1 菌株和F.G1 菌株（P＜0.05）。

2.2.3 發酵產物的鐵離子螯合能力 表1 結果表明，用AS2796 發酵的10 種谷物，其鐵離子螯合能力與發酵時間的相關系數分別為-0.942、-0.995、-0.960、-0.629、-0.656、-0.939、-0.983、-0.975、-0.901 和-0.878；其最低EC50值分別為5.26、6.04、7.73、16.51、13.79、2.28、0.44、0.33、3.28 、2.96 mg/mL。發酵35 d 后，EC50值均為最低。

表2 結果表明，用X1 菌株發酵的10 種谷物，其鐵離子螯合能力與發酵時間的相關系數分別為-0.941、-0.983、-0.964、-0.613、-0.679、-0.929、-0.976、-0.975、-0.897 和-0.848；其EC50最低值分別為5.41、6.19、7.88、16.64、13.92、2.41、0.59、0.48、3.43、3.11 mg/mL，分別比對照低40.59%、23.97%、22.3%、81.61%、71.49%、13.6%、2.78%、2.65%、57.45% 和53.99%。發酵35 d 后，EC50值均為最低。

表3 結果表明，用F.G1 發酵的10 種谷物，其鐵離子螯合能力與發酵時間的相關系數分別為-0.935、-0.981、-0.953、-0.629、-0.701、-0.933、-0.965、-0.965、-0.908 和-0.880；其最低EC50值分別為5.17、6.08、7.47、16.4、13.56、2.22、1.00、0.27、3.21、3.01 mg/mL。發酵35 d 后，EC50值均為最低。

以上結果表明，菌株AS 2796 發酵的玉米、高粱和小麥的最低EC50值顯著高于X1 菌株和F.G1 菌株的最低EC50值（P＜0.05），F.G1 發酵后的小麥、大米、小米、藜麥、燕麥、蕎麥和大豆的最低EC50值顯著高于AS2796 和X1 菌株的最低EC50（P＜0.05）。

2.2.4 發酵產物對超氧陰離子自由基的清除能力 表1 結果表明，AS 2796 發酵的10 種谷物的超氧陰離子自由基清除能力與發酵時間的相關系數分別為-0.924、-0.945、-0.960、-0.947、-0.980、-0.976、-0.383、-0.956、-0.963 和-0.920；10 種發酵谷物的EC50最低值分別是2.88、9.59、8.35、5.46、9.15、3.12、12.26、7.39、3.21、3.06 mg/mL，分別比對照低11.25%、15.65%、39.17%、29.82%、44.14%、16.68%、53.82%、40.49%、42.29%和46.29%。發酵35 d 后，EC50值均為最低。

表2 結果表明，X1 菌株發酵的10 種谷物的超氧陰離子自由基清除能力與發酵時間的相關系數分別為-0.913、-0.932、-0.956、-0.941、-0.976、-0.976、-0.329、-0.944、-0.954 和-0.918；10 種發酵谷物的EC50值分別為3.03、9.74、8.50、5.59、9.28、3.25、12.41、7.54、3.36、3.21 mg/mL。發酵35 d 后，EC50值均為最低。

表3 結果表明，F.G1 發酵的10 種谷類的超氧陰離子自由基清除能力與發酵時間的相關系數分別為-0.921、-0.946、-0.961、-0.948、-0.981、-0.974、-0.371、-0.954、-0.950 和-0.929；10 種發酵谷物的EC50最低值分別為2.91、9.62、8.38、5.49、9.18、3.15、12.29、7.42、3.24 3.09 mg/mL。發酵35 d 后，EC50值均為最低。

表1～3 結果表明，菌株F.G1 發酵的小麥、大米、小米、藜麥、燕麥、蕎麥和大豆的EC50值均顯著高于AS 2796和X1菌株發酵的谷物EC50（P＜0.05）。

3 結論與討論

本研究結果表明，采用不同的菌種在同一谷物上進行固態發酵，或者同一菌種在不同谷物上進行固態發酵，其發酵效果不相同。ZHAI 等[14]和KANG[15]等研究結果表明，發酵產物的營養成分變化與發酵菌株和發酵基質的生物特性及代謝機制有關，這與本研究結果一致。此外，X1 菌株與雙孢蘑菇AS2796 都屬于土生菌，但就本研究的結果來看，這2 株菌在同一種谷物上進行固態發酵時，發酵效果存在明顯差異。

酚類化合物是大型真菌次生代謝產物之一，具有很好的抗氧化性，其抗氧化性與其酚羥基的氧化還原特性有關[14,16-17]。本研究結果表明，真菌固態發酵后的谷物，其多酚含量要高于未接種的谷物。可見，真菌固態發酵能夠改善發酵基質的營養價值[18]。LEE 等[5]研究發現，總酚含量與抗氧化性有一定的相關性。從理論上講，樣品的抗氧化性應與其苯酚總含量一致。在本研究中，發酵后的高粱其多酚含量與抗氧化性并不存在正相關，這可能是因為在固態發酵的過程中，有新的抗氧化物產生[5,14-15,19-20]。

綜上所述，發酵谷物的總多酚含量和抗氧化性能隨著發酵時間和發酵菌株的變化而變化，在實際應用中要根據需要選擇合適的發酵菌株，同時要根據所選基質的生物特性確定最佳發酵時間，以期得到營養價值更高的發酵產物。