生物化學農藥S-烯蟲酯防治儲糧害蟲研究進展

李燕羽, 穆海亮, 胡鐵源,, 張洪清, 宋麗雯, 王明亮, 苑江浩

(國家糧食和物資儲備局科學研究院1,北京 100037)

(中保糧生物科技(海南)有限公司2,海口 570100)

(甘肅農業大學植物保護學院3,蘭州 730070)

為促進我國農業向新型的綠色環保低碳的現代農業的轉型升級。國家農藥獸藥使用減量和產地環境凈化行動已實施多年,農藥減量的主要措施是使用安全綠色環保的生物農藥,助力現代農業發展[1]。生物農藥中的生物化學農藥作為的一個重要分支,處于起步階段,發展潛力巨大。

WHO/FAO于1988年定義生物化學農藥,一是對靶標害蟲沒有直接毒殺作用;二是必須是(must be)天然化合物,若是人工合成的,其結構必須(must be)與天然化合物相同。在1988年的定義基礎上,2013年修改為應該是(should be)天然化合物;若是人工合成的,其結構應該(should be)與天然化合物相同[2],例如:合成化合物的主成分的分子結構與天然存在的類似物的分子結構相同。中華人民共和國農業部公告第2569號公布了《農藥登記資料要求》[3],2017年11月1日起施行。第一次給出我國生物化學農藥定義:“2.17生物化學農藥,是指同時滿足下列兩個條件的農藥:一是對防治對象沒有直接毒性,而只有調節生長、干擾交配或引誘等特殊作用;二是天然化合物,如果是人工合成的,其結構應與天然化合物相同(允許異構體比例的差異)。”主要包括的類別有:化學信息物質、天然植物生長調節劑、天然昆蟲生長調節劑和天然植物誘抗劑,以及其他滿足生物化學農藥定義的物質。

“昆蟲生長調節劑”(Insect Growth Regulators,IGR)被用來描述基于昆蟲保幼激素(Juvenile Hormone,JH)的殺蟲劑[4],后來被擴展到對昆蟲有選擇性的其他昆蟲激素或類似物[5,6]。IGR主要干擾3種生理過程:未成熟昆蟲的生長發育;誘導變態;或表皮幾丁質的合成[6]。對應3種作用模式的IGR分別為保幼激素類似(Juvenile Hormone Agonists,JHA)、蛻皮激素類似物(Ecdysteroid Agonists)和幾丁質合成抑制劑(Chitin Synthesis Inhibitors)[7]。JHA具有較低的脊椎動物毒性[8],因此,它們更具發展潛力。

1 昆蟲保幼激素的發現和種類

昆蟲的生長發育受JH(一種由靠近大腦的內分泌腺分泌的倍半萜類物質)[9]和蛻皮激素(一種由前胸腺分泌的類固醇,MH)控制[9]。JH能阻止不成熟階段昆蟲發育功能的現象是研究吸血半翅目昆蟲Rhodniusprolixus(St?l)時發現的[10]。JH主要有JH 0、JH Ⅰ、JH Ⅱ和JH Ⅲ4種形式(圖1),區別在主鏈上的脂肪族結構。一般情況下,JH0、JH I和JH II存在于鱗翅目昆蟲中,而JH III則存在于其他目昆蟲中[11]。

圖1 天然保幼激素及其類似物的分子結構

通過對JH進行化學修飾,開發了多種類似物—JHAs。JHA被認為具有與JH相似的作用模式,并具有與JH相似的細胞/核受體[12]。已經開發出的JHAs,與它們的天然對應物JH不同,這些化合物能夠抵抗昆蟲體內酶的降解[13]。烯蟲酯(methoprene)是第一個合成的保幼激素類似物,也是結構上最接近天然JH。隨后,科學家們還合成開發了用作殺蟲劑的烯蟲乙酯(hydroprene)[14]、苯氧威(fenoxycarb)和蚊蠅醚(pyriproxyfen)[6]。烯蟲酯、烯蟲乙酯和烯蟲炔酯(kinoprene)是脂類化合物,在昆蟲體內具有化學穩定性和抗降解性。苯氧威和蚊蠅醚是芳香族化合物[13](圖1)。

2 作用機理

JH在細胞和分子(基因組)水平發揮作用。在細胞水平,蛻皮過程中蛻皮激素濃度升高時,細胞內存在的JH可阻止幼蟲變成蛹。從基因上講,幼蟲蛻皮、化蛹和羽化變態都是通過暫時抑制介入基因組來調節的。在幼蟲最后一齡,JH濃度較低,通過增加蛻皮激素滴度來永久性抑制幼蟲特異性基因和改變細胞結合力,從而形成蛹。這一作用是不可逆轉的,確保不會因為后期JH濃度升高出現蛹態到幼蟲態的逆轉。但蟲體上所有細胞的變化并非同步,使得在外部JH的干擾作用下,產生具有半幼蟲和半蛹的昆蟲蟲態[13]。

另外,JH的主要功能是影響蛻皮激素作用,這些作用包括表皮細胞功能的改變,可影響蛻皮激素在特定階段已經形成的基因表達,也可調節自身的基因表達。JH和蛻皮甾體都是在細胞水平上起作用的,即在細胞核內同一異二聚體的不同組分結合,也就是說JH可調節蛻皮甾醇的功能。此外,在飛蝗LocustamigratoriaL.中,JH誘導轉錄因子(蛋白質)與稱為JH反應元件的DNA序列結合。JH還可干擾蛻皮激素誘導的基因,即當與一種由蛻皮激素誘導的細胞核受體E75A結合時,JH抑制由JH和蛻皮激素調節的某些基因的激活。在幼蟲蛻皮過程中有JH和20-羥基蛻皮激素(20-HE)參與,核受體E75A的合成也參與在這過程中。E75A激活負責幼蟲生長的JH誘導基因,但抑制另一組編碼負責蛹性狀表達的基因。蛻變過程中,JH濃度降低,蛻皮甾體濃度出現一個小峰值。另一組基因BR、E74和E75在沒有JH的情況下被20-HE激活,這些激活的基因可激活其他一些有利于蛹發育的基因[10]。在咽側體合成的JH通過血淋巴結被JH結合蛋白(JHBPs)運輸到靶組織[15],到達靶組織后,JH的作用可能通過誘導蛋白激酶C信號通路的細胞表面受體介導[16],或者通過細胞內受體調節基因表達[17,18]。

S-烯蟲酯作為一種昆蟲保幼激素類似物,對昆蟲不產生直接致死作用,而通過破壞或干擾昆蟲體內激素平衡,造成昆蟲內分泌紊亂,使幼蟲不能完成生長變態和性成熟而死亡,如幼蟲不能正常蛻皮和蛹不能正常羽化等問題,同時還可使成蟲產生不孕現象,進一步降低害蟲種群。藥劑具有靶標生物特異性和極高保幼激素活性,特別是在有限環境或區域內長期應用時,隨著時間的延長,1～2個月后害蟲種群數量受到明顯的抑制,3～6個月以后種群基本滅絕。因此,S-烯蟲酯可稱為害蟲種群“抑制劑或滅絕劑”,簡稱“抑滅劑”。普通果蠅D.melanogaster首次鑒定出耐烯蟲酯的結構域蛋白helixe-loope-helix(HLH)/Per-Arnt-Sim(PAS),這種被稱為烯蟲酯耐受蛋白(Met)的bHLH-PAS蛋白同源物,在赤擬谷盜[19]中發現了同源物,JH及其類似物通過其起作用。在赤擬谷盜中,Met與另一種bHLHPAS蛋白——Taiman可以與JH、烯蟲酯和其他JHAs結合,作為轉錄調節因子來驅動抑制變態的基因表達[20]。Met似乎通過調節多種基因發揮其抑制作用,與一種充當JH信號的介體早期JH反應基因的Krüppel同源物(Kr-h1)一起,控制許多昆蟲蟲種的變態[21]。受Met及其同類影響的基因仍有待確定,但證據表明,Met是調控昆蟲發育和蛻皮復雜過程的重要組成部分。

3 生物學效應

自20世紀70年代以來,關于烯蟲酯對未成熟昆蟲的直接毒性已有大量的實驗室研究[22-27],最近研究更多地集中在亞致死效應上,因為這些結果更能說明實際防治效果[28-32]。JHAs最常見的影響是蛻皮期間維持幼蟲狀態,被認為是“現狀”激素[33],產生多齡幼蟲,形成生命階段之間的形態中間體[23],延遲化蛹,最終使幼蟲和蛹死亡[26,34]。亞致死效應包括對雄雌蟲生殖的影響[35-40]、卵黃形成[39]、胚胎發育[41]、滯育[42]、信息素合成[43]、取食[44]和交配[45]行為。

昆蟲發育過程中有一個關鍵階段對JH特別敏感,可通過對其調節進行防治[40]。如幼蟲蛻皮過程中需要JH的存在[46],JH和蛻皮甾體(MH)的相對濃度決定了蛻皮的類型,如幼蟲至幼蟲蛻皮或幼蟲至蛹蛻皮[9]。通常在全變態昆蟲中,在幼蟲最后蟲齡期間,也就是幼蟲化蛹期間,JH量會降低[47],而MH濃度增加[9]。這些模式存在于昆蟲變態的內分泌調節過程中,但不同蟲種之間有差異[48]。

4 害蟲抗性研究

首次使用JHAs時,鑒于昆蟲在其多個發育階段都嚴重依賴激素調節,所以認為昆蟲不會對這些化合物產生抗藥性[4]。但研究對其他殺蟲劑產生抗藥性的昆蟲種群時發現,對JH或其類似物也具有抗藥性[49,50]。在雙翅目[51,52]和鞘翅目昆蟲[53,54]中都檢測到對烯蟲酯的抗性。澳大利亞報告了谷蠹對烯蟲酯的抗性,抗性群體主要表現在死亡率和子代種群的應用劑量上,完全抑制子代需要的質量分數為40 mg/kg[55]。不同地理種群的谷蠹對S-烯蟲酯的抗性水平不同[55]。此外,蚊蠅醚(pyriproxyfen)的抗藥性也有報道[41]。

早期有一些研究關于昆蟲種群如何對JHAs產生抗性的觀點。研究認為,局部應用JH I時,在角質層部分,藥劑從角質層滲透到組織的有延遲[56]。蛻皮過程中雖然角質層脫落,但殘留的烯蟲酯還會傳遞到隨后的齡期[57],并且能降解其他殺蟲劑的酶也可以降解JH[57],因此通過提高多功能氧化酶水平對殺蟲劑產生抗藥性的昆蟲應該也會表現出對JHA產生抗性[58]。然而,目前昆蟲對烯蟲酯產生抗性的機制尚未得到充分闡明[59]。通過模式昆蟲D.melanogaster研究證明,由于JH受體與JHA的親和力發生了改變,靶標位點變得不敏感[60]。乙酰甲烷磺酸鹽誘導突變產生大量突變的Met等位基因,發育出現輕度或極端缺陷,并產生不同程度的JHA抗性。雖然并不是所有的Met突變等位基因都能在自然種群中存活,但從果蠅出現多個耐受Met突變等位基因結果表明,其他物種可能也會出現基因突變,使昆蟲對JHA產生抗性。

5 毒理實驗

S-烯蟲酯對人畜的毒性極低或沒有毒性。采用14C示蹤S-烯蟲酯在環境土壤中和動物體內的完整降解途徑,最后的代謝產物為CO2[61]。

5.1 急性毒性

由圖2可見,S-烯蟲酯對大鼠的經口、經皮、吸入均為LD50>5 000 mg/kg,LD50=34 000 mg/kg劑量是化合物的毒理測試劑量上限,說明S-烯蟲酯基本無急性毒性,歸類為最低級別,微毒[62]。初期兔子的眼睛刺激和皮膚刺激研究表明,S-烯蟲酯局部接觸,不會引起眼睛刺激和皮膚刺激。同樣,對豚鼠的實驗數據顯示,皮膚不會對S-烯蟲酯產生致敏。

圖2 S-烯蟲酯與其他殺蟲劑和氯化鈉的毒性數據比較

5.2 亞急性和慢性毒性

為了更好地評估短期接觸的健康風險,對大鼠和狗飼喂實驗90 d。每天喂大鼠的劑量分別是0、250、500、1 000 mg/kg或5 000 mg/kg以及每天喂狗的劑量分別是0、250、500 mg/kg或5 000 mg/kg。500 mg/kg劑量下大鼠和狗都無可觀察影響水平(No Observed Adverse Effect Level,NOAEL)。另外分別對大鼠和小鼠進行了長期飼喂實驗。每天用0、250、1 000 mg/kg或5 000 mg/kg的食物濃度飼養大鼠了2年并沒有顯示任何不利健康影響,甚至在上限最高劑量與對照組比較也沒有差別,無腫瘤發生率被觀察到。在最高劑量5 000 mg/kg,系統顯示無可觀察影響。另一組用每天0、250、1 000 mg/kg或2 500 mg/kg烯蟲酯濃度飼喂小鼠18個月,無潛在腫瘤發生率增加被觀察到,飼喂組沒有發現顯著的健康影響。由于有些小鼠在高劑量的喂養中,肝臟有些棕色素存在,因此系統無可觀察影響水平對小鼠的實驗定在每日250 mg/kg。基于毒理數據,美國環境保護總署(EPA)認為烯蟲酯不是一個致癌物質[62]。

5.3 致突變和致畸形

美國環境保護總署(EPA)有烯蟲酯對動物發育和生殖影響的完整數據。烯蟲酯對兔子和小鼠發育無毒。兔子的NOAEL是2 000 mg/kg,小鼠是600 mg/kg。大鼠三代生殖研究結果表明對生殖影響NOAEL是2 500 mg/kg。如此高的NOAEL,均為最高劑量測試上限,因此可認為無論是孕期或幼兒接觸烯蟲酯不會有成長發育的不利影響。致突變性檢測(Ames)和誘變性實驗的結果為陰性,說明S-烯蟲酯不是誘變性化合物[62]。

5.4 人體接觸途徑

5.4.1 取食

從食物接觸S-烯蟲酯的可能性很小,一般從其處理過的菌類、谷物、或者飼喂后含有微量殘留的牛肉、脂肪或者乳品。S-烯蟲酯已經使用了近三十年(之前使用消旋烯蟲酯),至今鮮有S-烯蟲酯引起的食物風險報道[62]。

5.4.2 飲用水

從飲用水接觸到S-烯蟲酯的可能性很小。水溶液或土壤中,在日照的條件下S-烯蟲酯迅速分解/光解,產物是二氧化碳降解物(圖3、圖4)[61]。因此,可以認為飲用水不是人們接觸S-烯蟲酯的附加因子。

圖3 S-烯蟲酯在土壤中的降解途徑[61]

圖4 S-烯蟲酯在哺乳動物中的代謝途徑(C=奶牛,H=母雞, S=肉用公牛)[61]

5.5 使用過程中

鑒于S-烯蟲酯的經皮和吸入毒性歸類是微毒級,因此使用混合器、裝載機械和播撒器械施藥時,經皮和吸入接觸可以忽略,即非食物性攝入接觸可能性很小。施藥者健康風險評估報告表明職業性接觸S-烯蟲酯的人群風險可接受[63]。

6 殘留限量標準

美國聯邦法規40CFR180.1033中規定,烯蟲酯用于防治食品中害蟲幼蟲時,殘留無限量要求。該法規自2003年起實施,一直處于有效狀態[62]。S-烯蟲酯2018年在中國首次取得登記,2019年中國首次在食品中規定了烯蟲酯的最大殘留限量,即烯蟲酯在稻谷中殘留限量10 mg/kg[64]。

7 烯蟲酯的應用

7.1 烯蟲酯在國外的應用

烯蟲酯自20世紀70年代起開始在美國登記使用,含有R-和S-異構體[65]。2002年,Central Life Sciences重新引入為Diacon?Ⅱ,僅含有S-異構體的烯蟲酯,質量濃度為288 mg活性成分[AI]/mL[66]。2011年,該配方被Diacon?IGR取代,其活性成分含量相同[67]。目前應用市場主要為北美、歐洲、大洋洲等區域,用于控制西尼羅瘧疾、登革熱、乙腦等蚊媒傳播流行病,以及抑制儲藏物害蟲、紅火蟻、菇蠅、牛蠅、跳蚤和蟑螂等。在美國,烯蟲酯是不具有旋光性的烯蟲酯和具有旋光性的S-烯蟲酯的統稱,它可直接用于谷物,作為谷物保護劑。還可用于工廠、倉庫和食品加工廠儲存設施等空間防蟲殺蟲應用。也可以作為寵物食品包裝處理[68]。在澳大利亞,烯蟲酯被注冊為谷物保護劑[69]。烯蟲酯于1977年在加拿大注冊用于蚊蟲控制[70],但尚未在儲藏物上注冊。在畜牧飼料中添加S-烯蟲酯,有效阻止牲畜糞便中吸血角蠅的產生,達到增重、提升牛奶質量和數量,以及牛皮質量(ALTOSID?IGR商品資料)。聯合國世界衛生組織(WHO)認定S-烯蟲酯是可以在飲用水中投放的消殺劑,以控制登革熱、瘧疾等媒介傳播致死傳染疾病的暴發[71]。日本用于環境、公共衛生、畜牧保健、桑蠶增絲等方面。新西蘭有十多年的應用經驗,從而根治了外來生物南方鹽沼蚊。歐盟認為S-烯蟲酯是低風險生物滅殺制品,用于萊茵河流域滅蚊。2004年FAO推薦S-烯蟲酯為綠色儲糧首選防護劑。

當赤擬谷盜成蟲預先暴露于烯蟲酯時,其耐熱性降低。然而,在赤擬谷盜幼蟲期尚未檢測到這種影響[30]。由于熱處理廣泛應用于食品工業以及商品的結構處理,將熱處理與烯蟲酯的效果相結合,可以降低此類處理的總成本。基于烯蟲酯的作用機理和生物學效應,早期主要是將烯蟲酯與其他殺蟲劑聯合使用,目的是防治害蟲全蟲態。當烯蟲酯與其他殺蟲劑聯合使用時,如與硅藻土殺蟲劑、甲基毒死蜱[72]、多殺菌素[54]、以及除蟲菊酯[29]一起使用時,通常會產生增效作用[65],如烯蟲酯與硅藻土聯合使用可以提高糙米中谷蠹的死亡率[8,73]。與其他昆蟲生長調節劑聯合使用時,如與除蟲脲結合,可以減少米象和谷蠹的后代數量[74]。在谷物中,烯蟲酯對于赤擬谷盜[75]和谷蠹有24個月的防治效果,而對于防治麥蛾[76]、象甲科[77]等隱蔽性害蟲還需要添加別的藥劑,因為烯蟲酯無法穿透糧粒。

7.2 烯蟲酯在國內的應用

合成S-烯蟲酯所用核心工藝是手性雙鍵轉移工藝生產,屬生物化學工藝,該工藝所用起始原料約30種,經過八步生物化學合成反應,直接生成光活性物質。而消旋烯蟲酯是在合成生產技術水平較低時的產物,S-烯蟲酯很難被分離出來。科學家們經過幾個世紀的努力和探索,終于在20世紀80年代在不對稱合成上有了重大突破。工藝不單是一個簡單的提純工作,而是用生物化學新技術直接生產光活性產品,不涉及任何除去副產物或雜質的提純,工藝路線溫和巧妙。市場上其他的烯蟲酯[CAS∶40596-69-8]是R∶S=50∶50的消旋體,無旋光度,活性成分<50%,R為無效體,國際上已淘汰或停止使用。國內已有公司突破了美國對中國的長期技術封鎖,合成的構型S的活性物質,具有+5.6°旋光度,活性成分接近100%,是國際上目前廣泛應用的殺蟲防蟲產品。全國農藥標準化技術委員會秘書處根據命名原則,及征求專家的意見的基礎上,下函同意將(2E,4E,7S)-11-甲氧基-3,7,11-三甲基-2,4-十二碳二烯酸異丙酯的化合物命名為S-烯蟲酯,作為其通用名。具有旋光性的光學異構體S-異構體的烯蟲酯,稱為S-烯蟲酯(R∶S=2∶98),與天然昆蟲保幼激素JH結構類似(圖1),功能相同,活性更高,比烯蟲酯的活性高10倍以上,是天然保幼激素的千倍以上。2018年以來,我國先后在江蘇、安徽、浙江等9個省中儲糧糧庫、地方儲備糧糧庫等開展了實倉試點研究,包括稻谷、玉米、小麥和大豆四大儲糧品種,通過對整個儲藏周期害蟲種群變化監測,發現結合入倉初期的害蟲消殺處理,S-烯蟲酯能很好控制糧堆害蟲種群的作用,整個儲藏期處于無蟲糧的狀態,長期防治效果好,持效期長。同時,為了保證藥劑均勻噴施在糧粒上,開發了一系列入倉噴施設備。

7.3 烯蟲酯的殘效期

烯蟲酯穩定性比較好,在20～35 ℃之間持續24周或在65 ℃條件中持續48 h[78]。應用于表面處理時,烯蟲酯防治效果隨著時間延長而降低,不同材料成分降低速度不同。混凝土是一種典型的糧倉地面,也常用于磨坊、倉庫和食品加工廠。許多研究報告表明,與其他表面相比,殺蟲劑在混凝土表面上應用效果會降低[78-80]。混凝土表面效果降低的可能原因是其高孔隙率增加了殺蟲劑表面滲透,高pH(約10.5)增加了殺蟲劑的水解[79]。混凝土表面的粉塵也會進一步稀釋烯蟲酯的藥效[78],其他觸殺劑也有類似的情況發現。相比之下,粉末的存在不會降低烯蟲酯對上漆木上的應用效果[78]。

8 結論

烯蟲酯藥效與蟲種、蟲態、糧食品種、處理表面結構、環境條件等因素有關。最初的實驗主要探討烯蟲酯對未成熟昆蟲的直接影響,而最近的研究主要集中在亞致死效應影響。與傳統神經毒性殺蟲劑相比,烯蟲酯對脊椎動物無毒是一個明顯的優勢,它的主要局限性表現在對成蟲無殺滅作用,但可以產生降低其繁殖力、生活力、耐熱性、產卵效應等亞致死效應。烯蟲酯對昆蟲許多生理功能的影響,與其他殺蟲劑、生物/非生物因子的協同增效效應說明JHAs在控制儲糧害蟲方面的潛力。而且隨著合成生物學以工程化設計理念對生物體系進行改造和優化,建立天然產物生產新模式,可提高合成效率,大大降低成本。因此,研究烯蟲酯如何干擾儲藏物昆蟲的耐熱性和種群數量,如何干擾不同的感受系統(器官),以及開發新的害蟲防治途徑,從而為應用S-烯蟲酯等綠色安全的生物和物理技術,防治有害生物危害,減少它們造成的糧食損失,對于國家糧食安全、食品安全、保護環境、綠色高質量發展、建設生態文明和大健康中國等方面有重要意義。