超聲對小麥麩皮蛋白結構和功能性質的影響

許英一, 張 微, 王 宇, 王麗坤, 高海娟,王德香, 錢春榮, 劉 迪, 吳紅艷, 謝吉蓮

(齊齊哈爾大學食品與生物工程學院1,齊齊哈爾 161006)

(黑龍江省農業科學院畜牧獸醫分院2,齊齊哈爾 161005)

(黑龍江省農業科學院耕作栽培研究所;農業農村部東北地區作物栽培科學觀測實驗站3,哈爾濱 150023)

小麥麩皮中含有質量分數13%～18%的蛋白質,包括醇溶蛋白、球蛋白、清蛋白和谷蛋白,是一種良好的蛋白質來源,蛋白中含有8種人體必需氨基酸,且含有較多的賴氨酸,其營養價值和生理價值都高于胚乳蛋白[1]。但由于其溶解性、乳化性等功能特性較差,限制了其在食品加工領域中的應用。通過對蛋白進行改性處理能夠改變其疏水基團分布、空間排列構象以及氨基酸的組成等,進而改善蛋白的功能性質或開發新的功能特性[2]。目前關于蛋白的改性方法主要有酶法、物理法和化學法[3]。李帥斐[4]以新鮮脫脂米糠為原料,以氮溶解指數(NSI)為指標,通過均勻設計優化了堿法提取聯合高溫和酶法改性的工藝條件,通過高溫和酶法改性得到的米糠蛋白NSI質量分數為96.08%,NSI提高非常顯著,較改性前(68.32%)提高了 40.63%,酶法改性后的持水性、持油性、乳化性、乳化穩定性和發泡性等功能性質都得到了不同程度改善和提高。許英一等[5]采用葡萄糖、乳糖、殼寡糖、海藻酸鈉對燕麥蛋白進行濕法糖基化改性,改性后4種燕麥蛋白的溶解性、乳化活性、乳化穩定性、持水性、吸油性等功能特性都顯著提高(P<0.05)。酶法改性條件溫和,但成本較高。化學改性可能會產生或引入有毒物質或影響食品風味的物質。相比較而言,超聲波作為一種安全、環保、高效和無毒的新興物理加工技術,可改變鷹嘴豆蛋白[6]、紅豆蛋白[7]、蕓豆蛋白[8]等功能特性,目前鮮見采用不同超聲處理時間改性小麥麩皮蛋白(wheat bran protein,WBP)結構及功能性質的報道。研究以小麥麩皮為原料,探討不同超聲時間對WBP結構和功能性質的影響,以期為小麥麩皮的開發及應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與設備

小麥麩皮;5,5′-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)(DTNB);1-苯氨基-8-萘磺酸(ANS);β-巰基乙醇、氫氧化鈉、鹽酸等為分析純;溴化鉀為光譜純。

JBT/C-YCL 400T/3P (D)超聲藥品處理機,SHA-C型恒溫水浴振蕩器,PC/PLCLD-53型真空冷凍干燥機,TDL-5A型臺式離心機,PB-10型pH計,FJ300-S數顯高速分散均質機,L-8900全自動氨基酸分析儀,Spectrum One型傅里葉變換紅外光譜儀,TU-1901型紫外可見分光光度計,EnSpire多功能酶標儀。

1.2 實驗方法

1.2.1 小麥麩皮蛋白的制備

采用堿法提取小麥麩皮蛋白。小麥麩皮磨粉過篩,正己烷脫脂。將脫脂后的小麥麩皮粉以料水比1∶12(g/mL)配制溶液,用1 mol/L NaOH 溶液調pH值為 10,在50 ℃水浴振蕩3.5 h,10 000 r/min離心10 min,將上清液用1 mol/L HCl調pH至4.6,靜置30 min,10 000 r/min離心10 min得沉淀,水洗沉淀2次,調pH至 7.0,冷凍干燥得到小麥麩皮蛋白(WBP),其蛋白質質量分數為(82.64±0.99)%。

1.2.2 超聲改性處理

稱取樣品,配制質量濃度為50 mg/mL的WBP溶液,將pH調至7.0后磁力攪拌2 h至充分溶解,將蛋白溶液進行冰浴超聲處理(溫度不高于20 ℃)。設定超聲藥品處理機處理條件為:工作 4 s、間歇 2 s,超聲頻率為 20 kHz,超聲功率為220 W,超聲時間分別為0、5、10、15、30 min,冷凍干燥得到超聲的小麥麩皮蛋白(UWBP),備用。

1.2.3 氨基酸含量的測定

采用氨基酸全自動分析儀酸水解法測定氨基酸含量,在適量樣品中加入6 mol/L鹽酸,封管,在110 ℃烘箱中水解24 h,待反應結束后,調節pH 2.2,用檸檬酸鹽緩沖液(pH 2.2)定容。然后用注射器通過0.22 μm的濾膜,裝入進樣瓶,測定蛋白中的氨基酸含量[9]。

1.2.4 巰基和二硫鍵含量的測定

巰基及二硫鍵含量的測定參考Zhang等[10]的方法,稍作修改。稱取120 mg樣品加入20 mL Tris-Gly緩沖溶液(0.086 mol/L Tris、0.09 mol/L甘氨酸、0.004 mol/L EDTA、8 mol/L 尿素,pH 8.0)溶解,磁力攪拌1 h,10 000 r/min離心10 min,取上清液備用。游離巰基(SHF):取1 mL上清液,加入4 mL Tris-Gly緩沖溶液、0.05 mL Ellman’s試劑(用Tris-Gly緩沖液配制質量濃度為4 mg/mL的DTNB溶液),立即混勻,于25 ℃保溫反應1h,以不加樣品只加Ellman’s試劑為空白,測定A412游。總巰基(SHT):取1 mL上清液,加入4 mL Tris-Gly緩沖溶液、0.05 mL β-巰基乙醇,加入10 mL的12% TCA,室溫反應1 h。10 000 r/min離心10 min后棄去上清液,沉淀用12% TCA洗滌2次,再次離心,收集沉淀,將其溶于10 mL Tris-Gly緩沖液中,取其中4 mL緩沖液,加入0.04 mL Ellman’s試劑,立即混勻,于25 ℃保溫反應1 h,以不加樣品只加Ellman’s試劑為空白,測定A412總。巰基和二硫鍵的計算如式(1)、式(2)所示。

游離巰基(SHF)或總巰基(SHT)/(μmol/g)=75.53×A412×DC

(1)

二硫鍵S-S(μmol/g)=SHT-SHF2

(2)

式中:A412分別為A412游和A412總;D為稀釋倍數;C為樣品質量濃度/mg/mL。

1.2.5 表面疏水性測定

表面疏水性測定參考許英一等[11]方法。配制一定質量濃度(0.012 5、0.025、0.05、0.1、0.2、0.4mg/mL)樣品的磷酸鹽緩沖溶液,加入20 μL 8 mmol/L ANS熒光探針,漩渦混合。室溫下避光反應15 min,在激發波長390 nm,發射波長470 nm,狹縫5 nm的條件下測定蛋白與ANS結合物的相對熒光強度,以麥麩蛋白濃度為橫坐標,相對熒光強度為縱坐標作圖,線性回歸曲線的初始斜率即為H0。

1.2.6 熒光光譜測定

內源熒光光譜測定參考李丹等[12]的方法,稍作修改。用0.01 mol/L、pH 7.0磷酸鹽緩沖溶液配制質量濃度為1 mg/mL的樣品溶液。儀器參數設定:激發波長為280 nm,掃描發射光譜范圍為300～400 nm,激發和發射狹縫寬度均為5 nm。

1.2.7 傅里葉變換紅外光譜(FTIR)測定

FTIR測定參考許英一等[11]的方法。稱取2 mg的樣品,加入0.2 g溴化鉀,研磨均勻,壓成均一透明的薄片。用FTIR儀測定波數為4 000～400 cm-1的紅外光譜,分辨率4 cm-1,波數精度0.01 cm-1,掃描次數32次,環境溫度25 ℃。

1.2.8 溶解性測定

采用氮溶解指數法,測定方法參照文獻[5]。

1.2.9 乳化性及乳化穩定性測定

采用濁度法,測定方法參照文獻[5]。

1.2.10 持水性、吸油性測定

參考Jamdar等[13]的方法,稍作修改。稱取0.5 g樣品記為m0,置于離心管中,記錄離心管和樣品的總質量為m1,分別加入5 g去離子水或5 g大豆油,渦旋振蕩5 min后于室溫條件下靜置20 min,10 000 r/min離心20 min,棄去上清液,稱質量離心后樣品與離心管的總質量記為m2。持水性(WHC)及吸油性(OAC)的計算如式(3)所示。

WHC或OAC=m2-m1m0

(3)

1.2.11 起泡性及泡沫穩定性的測定

參考Ma等[14]的方法,并稍作修改。稱取0.5 g樣品于燒杯中,加入50 mL去離子水,磁力攪拌30 min使其充分溶解。用高速剪切機以12 000 r/min均質2 min,迅速將燒杯內的液體與泡沫倒入量筒中,記錄體積V1,將其靜置30 min后,記錄體積V2。起泡性(FC)及泡沫穩定性(FS)的計算見式(4)和式(5)。

FC=V1-5050×100%

(4)

FS=V2-50V1-50×100%

(5)

1.2.12 數據分析

2 結果與分析

2.1 超聲改性對小麥麩皮蛋白氨基酸含量的影響

超聲改性前后小麥麩皮蛋白的氨基酸組成分析結果如表1所示。超聲改性后的小麥麩皮蛋白(UWBP)的必需氨基酸(EAA)含量、總氨基酸(TAA)含量和EAA/TAA較超聲改性前蛋白(WBP)均有所提高。WBP的EAA/TAA為0.359,而UWBP的EAA/TAA均高于FAO /WHO 標準規定的0.4[15],因此超聲改性后的小麥麩皮蛋白是氨基酸比例均衡的理想蛋白模式。由表1可以看出,超聲預處理明顯提高了蛋白質中Ala、Val、Ile、Leu、Phe、Pro等疏水氨基酸的含量,這也是超聲改性提高了小麥麩皮蛋白的乳化性等功能性質的原因。Jia等[16]研究表明超聲預處理可以改變蛋白的側鏈結構使蛋白結構變的松散,從而暴露更多的疏水性基團,從而使疏水氨基酸比例增加。

表1 WBP、UWBP的氨基酸的組成(g/100 g 樣品)

2.2 超聲改性對小麥麩皮蛋白巰基和二硫鍵含量的影響

游離巰基對于維持蛋白質三級結構有重要作用,可參與次級鍵的形成,其含量能夠反映蛋白質的變性程度,但是極容易被氧化成二硫鍵。由圖1可知,超聲后WBP的游離巰基含量下降,總巰基和二硫鍵含量均顯著上升(P<0.05)。超聲處理15 min的總巰基和二硫鍵含量最高,分別為(13.00±0.32)μmol/g和(4.94±0.12)μmol/g。游離巰基含量的下降是因為超聲處理會產生過氧化氫,而巰基在過氧化氫的存在下極易被氧化[17],這與孫英杰[18]的研究結果一致。還有推測游離巰基含量下降是由于超聲波作用產生大量具有高能量和高熱量的空穴氣泡,促進了體系中自由基的形成,誘發了蛋白的氧化,導致巰基轉化為二硫鍵[19]。總巰基含量和二硫鍵含量上升可能是由于超聲處理改變了蛋白質的構象,蛋白內部結構展開,內部巰基暴露,使總巰基含量上升,同時由于暴露出來的巰基被氧化或者巰基和二硫鍵相互轉化而使二硫鍵含量上升。

注:小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05),圖2、圖5～圖8同。

2.3 超聲改性對小麥麩皮蛋白表面疏水性的影響

蛋白質表面疏水性是表征與極性水環境接觸的蛋白質表面疏水基團數目的指標,并且與其乳化性質密切相關。由圖2可知,超聲處理增大了WBP的表面疏水性,且隨超聲處理時間的延長呈先增大后減小的趨勢,超聲處理10 min的表面疏水性最大,達到6 788.40±112.00。這是因為超聲的空化作用將埋在蛋白質內部的疏水基團和區域暴露于極性環境的數量增加,但隨著超聲處理時間增加,蛋白顆粒之間通過靜電等非共價作用發生聚集,導致部分暴露的疏水基團又被重新包埋。這與杜琛等[20]和望運滔等[6]的研究結果一致。

圖2 不同超聲處理時間對WBP表面疏水性的影響

2.4 超聲改性小麥麩皮蛋白的內源熒光光譜分析

超聲的空化效應使蛋白質構象變化,改變了色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸基團的局部分子環境,從而使熒光光譜發生變化。由圖3可知,樣品的熒光強度隨超聲處理時間的延長呈現先升高后降低的趨勢,在超聲10 min 時有最大熒光強度。熒光強度的升高可能是由于超聲處理使蛋白質發生伸展,內部的色氨酸殘基暴露于蛋白表面,從而表現出了更強的熒光強度。李海靜等[21]也認為超聲處理(20 kHz,200 W,15 min)可以使海參性腺蛋白酶解物結構展開,破壞蛋白質分子的疏水鍵,誘導蛋白質分子內更多疏水基團暴露,從而導致熒光強度增加。隨著超聲時間的繼續延長,熒光強度下降,這種由于熒光物質分子與溶劑分子或其他溶質分子的相互作用引起的熒光強度降低的現象稱為熒光猝滅。這種現象的原因可能是較長時間的超聲處理會使蛋白質分子發生交聯、聚集,已經暴露的色氨酸基團重新包埋于蛋白質內部,引起蛋白質空間位阻增加,導致蛋白發生熒光猝滅現象[22]。

圖3 不同超聲時間處理的WBP的內源熒光光譜

當激發波長為 280 nm 時,未超聲蛋白的最大熒光發射波長為 355 nm;超聲處理10 min蛋白的最大熒光發射波長達到 365 nm,最大吸收峰紅移10 nm,紅移的發生表明蛋白質舒展,導致掩埋在蛋白質內部的色氨酸殘基暴露于更加親水以及極性更大的環境中。這與王萌[23]報道的結果一致。

2.5 超聲改性小麥麩皮蛋白的FTIR分析

FTIR光譜是研究氫鍵類型的有力手段,而蛋白質的二級結構與蛋白分子間的氫鍵類型密切相關。由圖4可知,在紅外區的9個特征吸收帶中,研究蛋白質的二級結構最有價值且較為成熟的吸收帶為酰胺Ⅰ帶[24]。與WBP相比,超聲處理后蛋白的酰胺Ⅰ帶吸收峰值位置從1 658.17 cm-1分別偏移至1 657.69、1 656.69、1 657.24、1 657.13 cm-1,這說明了超聲處理使蛋白結構更加穩定,氫鍵作用增強,使得CO等化學鍵的鍵長增大,由于化學鍵的伸縮振動與鍵長的平方根成反比,因此鍵長增大使伸縮振動頻率減小,導致波數減小。酰胺Ⅱ帶(1 500～1 600 cm-1)的峰從1 535.04 cm-1偏移至1 537.09、1 536.09、1 536.03、1 533.40 cm-1,且峰強度減弱。造成峰強變化的原因之一是蛋白質的構象變化,這是氫鍵和誘導效應的共同影響造成的,結合2.4內源熒光光譜分析結果,超聲處理能夠影響小麥麩皮蛋白分子的構象變化,對分子間空間排布和相互作用也有一定改變[25]。

圖4 不同超聲時間處理的WBP的FTIR光譜

2.6 超聲改性對小麥麩皮蛋白溶解性的影響

蛋白質與水之間的作用力主要是蛋白質中的肽鍵或氨基酸的側鏈同水分子之間發生了相互作用,蛋白質變性的程度也可以通過蛋白質溶解度評價。如圖5可知,與未超聲處理蛋白相比,超聲能夠顯著提高WBP的溶解性(P<0.05),隨著超聲處理時間延長,蛋白溶解性均顯著增加(P<0.05)。當超聲時間為30 min時,蛋白的溶解性達到最大值(29.59±0.25)%,比未經超聲處理的原蛋白溶解度(9.59±0.18)%提高了208.55%。超聲的空化和機械效應可以將粒徑較大的蛋白質聚集體解聚成粒徑較小的蛋白質顆粒,從而降低蛋白質聚集體粒徑,使蛋白質與水接觸表面積增大,相互作用增強[6],隨著超聲時間的延長,空化和機械效應也隨之增強,所以蛋白的溶解性逐漸增大。這與Hu等[26]的研究結論一致。

圖5 不同超聲處理時間對WBP溶解性的影響

2.7 超聲改性對小麥麩皮蛋白乳化性和乳化穩定性的影響

超聲波處理通過影響蛋白的氨基酸側鏈活性基團和空間構象,進而調控其乳化性等功能特性。如圖6可知,超聲處理顯著提高了蛋白的乳化性(P<0.05),乳化活性指數(EAI)隨超聲時間的延長而增大。當超聲時間為30 min時,蛋白的EAI最高,達到(57.76±0.65)m2/g,比未超聲處理蛋白高66.41%。這與此超聲條件下蛋白具有最高的溶解性(圖5)有關。超聲處理對蛋白的乳化穩定性影響不顯著(P>0.05),乳化穩定性指數(ESI)隨超聲時間的延長呈先增大后減小的趨勢。當超聲時間為10 min時,蛋白的ESI最高,達到(18.99±0.28)%,比未超聲處理蛋白高14.54%。這與此超聲條件下蛋白具有最高的表面疏水性(圖2)有關。適當的超聲處理能夠使蛋白空間結構分散,蛋白質發生適度變性,內部疏水性基團暴露,增強其溶解性,蛋白分子更加柔韌,蛋白在油-水界面展開形成較穩定的網絡結構和界面膜,乳化性增強。乳化穩定性隨著超聲時間的延長先增大后減小,可能由于超聲處理時間變長,導致蛋白變性程度增大,分子聚集,不溶性蛋白含量增多,乳化穩定性減小[27]。Taha等[28]在超聲改性大豆蛋白中也發現蛋白質顆粒越小,更容易快速擴散到油滴表面,通過重新排列成膜降低了界面張力,避免了油滴聚集。

圖6 不同超聲處理時間對WBP乳化性和乳化穩定性的影響

2.8 超聲改性對小麥麩皮蛋白持水性和吸油性的影響

由圖7可知,與未超聲處理蛋白相比,超聲處理顯著提高了WBP的持水性(P<0.05),但不同超聲處理時間蛋白的持水性無顯著性差異(P>0.05)。當超聲時間為30 min時,蛋白的持水性最高,達到(9.07±0.24)g/g,比未超聲處理蛋白高140.58%。這與此超聲條件下蛋白具有最高的溶解性(圖5)和乳化性(圖6)有關。超聲處理會展開蛋白質分子的部分結構,親水性基團逐漸暴露出來,提高了蛋白的水結合能力,持水性增大。但隨著超聲處理時間的延長,蛋白的變性增強,使蛋白與水的結合能力增加緩慢,甚至有所下降,因此不同超聲處理時間蛋白的持水性無顯著性差異[29]。這與戚亭等[30]結論一致。與未超聲處理蛋白相比,超聲處理顯著提高了WBP的吸油性(P<0.05),但不同超聲處理時間蛋白的吸油性無顯著性差異(P>0.05)。隨超聲時間延長,蛋白吸油性呈先升高后降低的趨勢,當超聲時間為15 min時,蛋白吸油性最高,達到(23.96±0.36)g/g,比未超聲處理蛋白高223.78%。這可能是由于超聲過程中產生的空穴效應展開了蛋白結構,埋藏在內部的側鏈解離,暴露出更多的非極性基團,從而提高了蛋白的吸油性,但隨著超聲時間的延長,蛋白質變性程度增大,吸油性隨之降低。這與王忠合等[31]的研究結論一致。

圖7 不同超聲處理時間對WBP持水性和吸油性的影響

2.9 超聲改性對小麥麩皮蛋白起泡性和泡沫穩定性的影響

如圖8可知,與未超聲處理蛋白相比,超聲處理顯著提高了WBP的起泡性和泡沫穩定性(P<0.05),并隨超聲時間的延長呈現先增大后減小的趨勢。當超聲時間為15 min時,蛋白的起泡性最大,達到(130.00±4.71)%,比未超聲處理蛋白高225.00%。這與此超聲條件下蛋白具有最高的持油性(圖7)有關。當超聲時間為10 min時,蛋白的泡沫穩定性最大,達到47.06%,比未超聲處理蛋白高464.95%。這與此超聲條件下蛋白具有最高的乳化穩定性(圖6)有關。適當的超聲處理能夠提高蛋白起泡性和泡沫穩定性的原因是由于超聲使蛋白結構變得更加分散,折疊蛋白打開的更多,疏水基團暴露,界面張力降低。而超聲30 min時起泡性減小的原因可能是長時間超聲處理下的空穴效應過強,產生的機械效應和高壓破環了蛋白的發泡體系,使分散的蛋白質再次聚集,將疏水基團藏于蛋白質內部,同時減弱了蛋白質多肽鏈之間的相互作用,降低了起泡性[32],這與許琳[33]的研究結論一致。

圖8 不同超聲處理時間對WBP起泡性和泡沫穩定性的影響

3 結論

采用不同超聲處理時間對小麥麩皮蛋白分散液進行處理,與未超聲處理蛋白相比,超聲處理使蛋白的總巰基含量、二硫鍵含量、表面疏水性升高,蛋白內源熒光強度增大,但使蛋白游離巰基含量降低。通過內源熒光光譜和傅里葉變換紅外光譜分析表明超聲處理影響了WBP分子的構象變化,對分子間空間排布和相互作用也有一定改變。與未超聲處理相比,超聲處理顯著提高(P<0.05)了WBP的溶解性、乳化性、持水性、吸油性、起泡性和泡沫穩定性。說明適度的超聲處理使蛋白結構展開,內部疏水性基團暴露,增強了蛋白的溶解性、乳化性等功能特性。因此,適度超聲處理對擴大小麥麩皮蛋白作為一種重要功能成分在食品工業中的應用具有重要的價值。