海洋微藻多不飽和脂肪酸生物合成機制研究進展

許曉路, 張德勇

(浙江樹人學院生物與環境工程學院,杭州 310015)

多不飽和脂肪酸(PUFA)尤其是n-3 PUFAs在營養健康領域的市場需求一直很大。長期以來PUFAs主要依靠從海洋魚油中提取,但隨著漁業資源消耗、成本升高等問題,迫切需要開拓新的來源,因此來源豐富、可再生的海洋藻類成為備受矚目的替代性來源。其實海洋魚類體內的PUFAs很大程度上也是通過攝食各類海藻而獲得的,因此藻類也被視為PUFAs真正的初級制造者。大型海藻和微藻(也包括一些淡水藻類)均可作為PUFAs的來源,相關研究也屢見報道,但目前鮮見關于藻類中PUFAs的生物合成機制的介紹,故文章擬對微藻中PUFAs的合成途徑進行簡要綜述,兼及微藻產品的開發應用情況。

1 微藻產PUFAs的特征

海洋及淡水中均存在大量微藻,它們一般為浮游生物,有些被歸為細菌,有些則被歸為植物,既有原核生物也有真核生物。迄今已發現的微藻逾3 000種,主要包括藍綠藻、綠藻、硅藻和金藻四大類[1]。大部分微藻是能進行光合作用的自養生物,但也有些種類營異養方式(如隱甲藻),或混合營養方式(如某些甲藻),同一物種也可能因環境因素而改變生活方式,因此藻類的代謝途徑可能非常復雜多樣[2]。微藻中富含的脂類尤其是研究熱點,微藻中的脂質質量分數大致在1%～40%范圍,某些種類中甚至能高達74%。微藻中的脂肪酸其碳鏈長度范圍為12～24,包括n-3或n-6的PUFAs[3]。n-3 PUFAs主要指α-亞麻酸(ALA)、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)、二十二碳五烯酸(DPA),n-6 PUFAs則主要指亞油酸(LA)、花生四烯酸(ARA)等,對人體健康有重要促進作用,在食品、保健品、醫藥、飼料等領域有廣闊的應用前景。由于人們對微藻的認知和接受度有限,目前微藻在食品醫藥領域的應用尚不充分,僅有少數種類真正實現了商業化開發,還有巨大的開發潛力。

不同物種或不同生長環境的微藻,其必需多不飽和脂肪酸含量、20∶5n-3和22∶6n-3的比例等均可能差異懸殊。目前發現,善于合成DHA的主要有甲藻、鞭毛藻、某些隱藻、破囊壺菌及裸藻[4]。在某些甲藻中,22∶6n-3 PUFA在總脂肪酸中的質量分數高達40%,某些鞭毛藻中則可達30%[4]。破囊壺菌也是最重要的22∶6n-3生產者,例如某些破囊壺菌和裂殖壺菌中的DHA在總脂肪酸中的質量分數能高達60%[5]。善于合成EPA的則主要有三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)等硅藻、微綠球藻(Nannochloropsissp.)等黃綠藻、以及某些鞭毛藻[3,6-8]。硅藻能合成約20%(質量分數)的EPA,并能合成少量DHA[6]。黃綠藻中20∶5n-3中的質量分數通常也在15%～30%之間[7]。其他微藻如藍藻、綠藻等,很少產生長鏈n-3 PUFAs,僅發現ALA、硬脂酸(SDA-18:4n-3)等少數幾種[3]。除了物種差別,長鏈PUFAs的生成還受環境因素(溫度、光照、鹽度、和養分可用性)、藻類發育階段等影響,如溫度改變可致微藻膜流動性改變以調整其脂肪酸構成、營養缺乏會促使微藻增加中性脂質[9,10]。Taipale等[3]研究16種藻類的PUFAs合成對外界因素的敏感性,發現對于隱藻、金藻和甲藻,提高溫度或氮濃度均可導致SDA、EPA、DHA和DPA的含量升高;隱藻和金藻傾向于在平臺期合成PUFAs,而硅藻、甲藻則傾向于在指數期合成PUFAs。可見微藻的開發應用亟待進一步開拓,其復雜的代謝途徑也有待深入探索。

2 微藻中PUFAs的生物合成途徑

微藻中的脂肪酸合成途徑涉及3個過程:飽和脂肪酸的合成、碳鏈的進一步延伸、飽和鍵的脫飽和反應。但后2個過程是否需要進行及具體進行幾步,則因具體產物而異。

2.1 飽和脂肪酸的合成——FAS途徑

在動植物中,脂肪酸的合成均是以乙酰輔酶A為起始,由乙酰輔酶A羧化酶(ACCase)和脂肪酸合成酶(FAS)共同催化完成。而乙酰輔酶A則來自葡萄糖的分解,即葡萄糖酵解生成丙酮酸,丙酮酸再被丙酮酸脫氫酶脫羧和氧化生成乙酰輔酶A,因此也可以說合成脂肪酸的最初原料其實來自葡萄糖。

對于微藻,推測的微藻中飽和脂肪酸合成途徑(FAS途徑)如圖1所示[11]。與植物相似,微藻中飽和脂肪酸合成階段大致也是以乙酰輔酶A為前體原料,循著脂肪酸合成酶(FAS)途徑合成棕櫚酸(16∶0)及其他飽和脂肪酸。這一階段亦稱為脂肪酸的初始合成,發生于微藻的質體(一般是葉綠體)中,該反應應該還需要能量(ATP)和還原力(NADPH)的參與。但是不同種類的微藻其形態結構、生理特征及碳代謝有較大差異,因此其脂類的合成途徑及運輸方式可能也會存在差異[12]。關于微藻中乙酰輔酶A的生成過程目前了解尚比較有限,參照植物推測,其乙酰輔酶A可能有2個來源:一是由葉綠體中的丙酮酸脫氫酶/脫羧酶直接供給,二是通過線粒體中的丙酮酸脫氫酶間接供給,即線粒體中的乙酰輔酶A經水解后被運輸至葉綠體,再由ACCase進行再生[13]。

圖1 推測的微藻中飽和脂肪酸合成途徑(FAS途徑)[11]

合成脂肪酸的第一步反應是乙酰輔酶A和碳酸氫鹽之間反應,形成丙二酰輔酶A[12,13]。丙二酰輔酶A作為脂肪酸從頭合成途徑的初始前體在整個合成途徑中起著核心作用,而且后續還會參與在內質網(ER)中發生的碳鏈延伸反應。丙二酰輔酶A通過“縮合、還原、脫水和再次還原”4步反應的反復進行,不斷添加二碳單位從而形成脂鏈。該反應伴隨著CO2的釋放以及NADPH的消耗[12]。在微藻中負責催化脂肪酸生物合成的酶為基質脂肪酸合成酶(Ⅱ型),該酶為由4種單功能酶單元組合而成的復合酶,以確保能同時催化4種酶促反應。由于植物中的FAS酶的基因序列已經被破解,學者們基于藻類與植物具有相似性,也順利找到了微藻中的FAS酶的基因,并對其功能進行了表征[12]。第一步縮合反應由β-酮酰基ACP合成酶(KS)催化,目的是形成簡單的碳-碳鍵。每種KS負責不同的反應:KSIII負責丙二酰輔酶A和乙酰輔酶A之間的初始縮合,KSI負責6個連續步驟生成16∶0-ACP,KSII負責16∶0-ACP經最后一個延伸反應形成18∶0-ACP[13]。接下來第二步是還原反應,由β-酮酰基ACP還原酶(KR)催化,該酶具有NADPH依賴性。第三步是β-羥酰基ACP參與的脫水反應,用以合成烯酰基ACP。第四步是烯酰基ACP接下來被第2個還原酶β-烯酰基ACP還原酶(βER)還原形成飽和酰基ACP[13]。哺乳動物細胞質中所發現的Ⅰ型脂肪酸合成酶被證實是由7種催化組件連接在一起形成的多功能巨合酶。微藻的細胞質中是否也普遍存在同樣結構的復合酶尚不清楚,但已在微擬球藻(Nannochloropsisoceanica)和纖細裸藻(Euglenagracilis)中分離到推測的FAS I酶,說明微藻中確實可能存在類似的酶[14]。微藻的FAS途徑經過一系列反應可形成產物棕櫚酸(16∶0)或硬脂酸(18∶0)。

2.2 鏈延長反應與脫飽和反應——n-3途徑與n-6途徑

質體(葉綠體)中FAS途徑合成的16∶0,可以再經最后一輪“縮合、還原、脫水和再次還原”4步反應,可得到更長的飽和脂肪酸硬脂酸(18∶0),16∶0和18∶0均是微藻FAS途徑的主要產物。16∶0和18∶0均可以進入后續的反應進一步產生各種不同鏈長及不同不飽和度的脂肪酸[12]。

不飽和雙鍵的形成由酰基輔酶A脫飽和酶負責催化。該酶是一種特殊類型的加氧酶,能夠從烴鏈中去除2個氫,使其產生雙鍵。根據其區域選擇性,脫飽和酶通常被寫為Δx,其中x是指從脂肪酸的羧基端開始添加雙鍵的位置[15]。在FAS途徑后,D9脫飽和酶負責在羧基末端的第9個碳上添加第1個雙鍵,故該酶可使16∶0和18∶0分別產生第1個單不飽和脂肪酸,即棕櫚油酸(16∶1n-7-PAL)和油酸(18∶1n-9-ODE)。

經FAS途徑,形成了棕櫚酸、硬脂酸產物,如果它們經脫飽和則又可產生棕櫚油酸、油酸。如果是在植物中,這些比較初始的脂肪酸接下來通常有2種去向:一是留在質體中參與糖脂(主要是半乳糖脂)的合成;二是被釋放到細胞質中,并轉移到內質網,用于質體外脂質的合成[12]。學者們推測在微藻中存在與植物中相似的脂肪酸運輸途徑,利用C13放射性標記法在硅藻角毛藻(Chaetocerosmuelleri)中進行的初步研究支持這一推測[16]。目前認為微藻與植物類似,首先是在質體中合成飽和脂肪酸,然后運輸到細胞質中進行后續的鏈延伸和(或)脫飽和反應。但鮮見這方面的研究,僅在少數種類如某些硅藻上開展過一些研究,而對于其他更多的微藻中的合成途徑仍難以判斷。

據推測,微藻中后續的PUFAs合成途徑包括n-3途徑、n-6途徑及聚酮合成酶途徑(PKS途徑)[12]。n-3和n-6途徑的發生場所不再是質體,而是線粒體和內質網(ER),以棕櫚酸或其類似物起始,由特定酶的酰基輔酶A衍生物參與催化。在傳統的氧依賴途徑中,18∶1n-9先被D12脫飽和酶進行脫飽和,然后再被D15脫飽和酶進行脫飽和,分別形成亞油酸和α-亞麻酸,作為n-6和n-3脂肪酸家族的前體。但在硅藻中另有獨特的發現,16∶1n-7可以通過D6和D15的脫飽和作用轉化出更復雜的C16多不飽和脂肪酸(16∶2n-7、16∶2n-4、16∶3n-4或16∶4n-1),該途徑被稱為“C16多不飽和脂肪酸途徑”[17]。

推測的微藻中多不飽和脂肪酸合成途徑如圖2所示[11, 18]。從18∶2n-6和18∶3n-3起始,可以分別沿著n-6途徑或n-3途徑生成各種更復雜脂肪酸。在自然界中,已鑒定出多種參與該途徑的脫飽和酶復合物。其中前端脫飽和酶(以Δx命名)在碳鏈羧基端的x位置添加雙鍵,而甲基端脫飽和酶(以ωy命名)在碳鏈羧基端的y位置引入雙鍵甲基端[19]。不同生物中發現的脫飽和酶情況比較復雜,例如后生動物的細胞中普遍存在前端脫飽和酶如D5、D6,但沒有甲基端脫飽和酶如ω6(D12)或ω3(D15)。哺乳動物理論上也可以利用自身的D4、D5和D6脫飽和酶將食物中的18∶2n-6和18∶3n-3進行鏈延長并脫飽和,生成C20-C22系列的PUFA(20∶4n-6、20∶5n-3、22∶6n-3)。但這種18∶2n-6和18∶3n-3轉化為必需C20-C22PUFAs的效率通常是非常低,因此基本上仍須依賴通過攝食來獲取。相反,微藻則同時具有甲基端脫飽和酶與前端脫飽和酶,因此在提供必需脂肪酸等方面的有著不可替代的價值。

圖2 推測的微藻中多不飽和脂肪酸合成途徑[11, 18]

2.3 PUFAs的無氧合成——聚酮合成酶途徑(PKS)

部分微藻中還存在一種不依賴氧的PUFA合成途徑,稱為聚酮合成酶途徑(PKS途徑)。但它不像前述n-3途徑、n-6途徑那樣普遍,僅見于某些物種中,主要是細菌、破囊壺菌及甲藻[20]。PKS途徑最初是在深海細菌希瓦氏菌中最先發現的[21]。后來在破囊壺菌、甲藻、鞭毛藻和綠藻中先后均找到了編碼PKS酶的基因,顯示PKS途徑存在于多種原生生物中[22-24]。

與FAS途徑相似,PKS途徑也是包括4步基本反應:縮合、還原、脫水和再次還原。甚至負責催化這些反應的四種酶也與FAS途徑中的類似:β-酮酰基ACP合成酶(KS)、β-酮酰基ACP還原酶(KR)、β-羥酰基ACP脫氫酶(DH)和β-烯醇基ACP還原酶(ER)。不過FAS途徑以及隨后的鏈延伸和(或)脫飽和反應用到的酶很多,整個過程能耗很高,而PKS途徑在還原和脫水環節其反應步驟較少,能耗低,產PUFAs的效率更高[25]。實際上,參與合成脂肪酸的分子在進行延伸時仍維持著不飽和狀態。PKS途徑基本上都是無氧條件下進行的,但在有氧條件下也仍是可以發生的[26]。

據研究,聚酮合成酶分為3類:Ⅰ型PKS是一種大型多功能酶,在同一多肽上分布著多個催化結構域。每個模塊負責一組不同的、非迭代的反應,共同參與一個完整的聚酮鏈延伸循環。Ⅱ型PKS是由多個單功能酶組成的酶復合物,其中每個酶各有1個催化結構域并具有一組迭代活性作用。而Ⅲ型PKS實際上是負責參與縮合反應的一種同源二聚體酶。Ⅰ型和Ⅱ型PKS均需要酰基載體蛋白(ACP)來激活負責引導生成聚酮中間體的底物,而Ⅲ型PKS則是直接作用于乙酰輔酶A,不需要ACP參與[27]。Ⅰ型PKS是各類原生生物中的最主流的PKS,至今已先后在鞭毛藻、綠藻、甲藻及破囊壺菌中被發現[22,27-29]。不過,甲藻中的Ⅰ型PKS不一定總能觀察到多功能活性,因為某些種類如短卡氏藻(Kareniabrevis)、骨亞歷山大藻(Alexandriumostenfeldii)和三尖異頭藻(Heterocapsatriquetra)中發現了具有非典型結構的Ⅰ型PKS,它們僅具有一個催化模塊而不是多模塊[28]。Ⅱ型PKS存在于鞭毛藻中,如球石藻赫氏顆石藻(Emiliania huxleyi)、隱藻和甲藻[29]。Ⅲ型PKS通常僅限于高等植物、真菌及細菌[30]。

PKS途徑依賴與FAS途徑相同的4種酶來進行,可以使用2種異構酶(2,3 i或2,2 i)完成,推測的某些微藻中無氧合成PUFAs的PKS途徑如圖3所示[11, 31]。PKS途徑的前體物質也與FAS途徑的相同,即乙酰輔酶A和丙二酰輔酶A。酮酰基合成酶(KS)和酮酰基還原酶(KR)負責添加二碳單位,而脫氫酶(DH)(或與異構酶相關的脫氫酶)和烯酰還原酶(ER)負責插入雙鍵。PKS途徑與的延伸和(或)脫飽和途徑的差異在于雙鍵的插入方式并不一樣。具體而言,PKS途徑通過添加碳并直接將不飽和鍵放在新生的酰基鏈上來生成新的脂肪酸,而在n-3和n-6途徑中,雙鍵是被插入原本完好的酰基鏈上。因此,PKS途徑需要消耗的能量更少,因為不需要像常規途徑中脫飽和反應那樣消耗ATP。

注:KS為3-酮酰基合酶;KR為3-酮酰基還原酶;DH為異構酶相關脫氫酶;βER為烯醇還原酶。

長期以來,關于PKS途徑的研究大多關注的是n-3多不飽和脂肪酸的產生,尤其是22∶6n-3(DHA)和20∶5n-3(EPA)[32]。然而,近來有研究顯示,PKS途徑可能不僅限于n-3多不飽和脂肪酸的生成。例如,Zhang等[33]認為還存在用于合成n-6多不飽和脂肪酸DPA-6的PKS樣途徑。Remize等通過研究微小亞歷山大藻(Alexandriumminutum)的脂肪酸合成途徑,也進一步提出了可能存在用于生成22∶5n-6的n-6 PKS途徑[24]。

3 微藻PUFAs的開發應用現狀

微藻以富含各種營養成分、生理活性成分而知名,因此其最大的應用領域是食品保健品領域。市場上主流的微藻產品主要是以片劑、膠囊或粉末等形式作為膳食補充劑。一種較新穎的產品形式是微藻油,即利用微藻的n-3PUFAs開發成食用油,這種獨特的微藻油在成分和性質上均不同于常見的植物油或動物油。例如利用裂殖壺菌的脂肪酸開發的藻油Algae Omega 3已被批準用于人類食用[34],作為成人膳食補充劑添加于食品(奶酪、酸奶、醬和調味品等)及飲料中。

另外,還可以將微藻成分添加到傳統食品中,做成特殊的餅干、酸奶等。如眼微綠球藻(Nannochloropsisoculata)富含EPA和DHA,Babuskin等[35]利用其開發出了有益健康的功能性餅干和面食。巴夫藻(Pavlovalutheri)的n-3 PUFAs被證實具有抗炎作用,故有人將其添加到了酸奶中,開發了保健酸奶。雖然仍需進一步改進口味等問題,但往酸奶中添加富含n-3PUFA的海藻油的想法很新穎,對于開發面向素食主義者的特殊食品等頗有啟發意義。據研究,人類攝入這種增強型酸奶后可顯著提高血漿及紅細胞中的DHA濃度。因此,來自藻類的營養成分對素食主義者是不錯的選擇[36]。給素食主義者補充來自肯氏壺藻(Ulkeniasp.)的DHA,不僅提高了其紅細胞中有益健康康的n-3 PUFA的濃度,而且微藻油似乎還能改善他們的食欲和營養攝入狀況[37]。n-3 PUFAs(EPA、DHA、ALA)還可以添加到嬰兒牛奶、小球藻強化飲料等保健飲料中,或者添加到湯、粥、果汁、餅干、冰淇淋、奶昔或膳食補充劑中[38]。

微藻還有望應用于特定的醫藥用途。微藻脂質有抗氧化、抗癌和抗炎功能。例如,呋喃脂肪酸能清除自由基,在碳主鏈內形成富電子的呋喃環。在等鞭藻(Isochrysissp.)和三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)上的研究證實其脂質具有很強的抗炎功效。不過由于難以純化等原因,尚未完成臨床試驗,走向應用尚需時日[39]。藍藻產生的脂肽能結合真核細胞中的微管蛋白或肌動蛋白絲,在癌癥檢測等領域有應用前景。另外在預防心血管疾病、糖尿病和高血壓等領域微藻也有涉及[40]。

除了生理功能,微藻PUFAs獨特的結構特性還能應用于食品加工工藝。富含蛋白質的藻類,如小球藻、雨生紅球藻或四倍體藻,可用作食品表面活性劑。此前人們發現蛋白質可以用作乳液中重要的彈性層,不過經過實際使用發現其性能并不如傳統的小分子表面活性劑。因為小分子表面活性劑往往擴散率更好。因此微藻中的小分子物質如糖脂(單酰甘油MAG或二酰甘油DAG)、磷脂(磷脂酰膽堿PC,即卵磷脂)、脂肪酸等用作表面活性劑有望表現更好[41]。海洋生物的磷脂通常富含卵磷脂(磷脂酰膽堿),其具有兩親性,因此特別適用于乳液制備。當前這方面的研究大多集中將n-3三酰甘油用于食品強化劑,而關于磷脂的報道則很少。例如,富含n-3 PUFA磷脂的油被用于魚糜產品后,由于EPA和DHA的存在,使其具有更好的抗脂質氧化能力[42]。

微藻的脂質還可以用作食品增強劑和防腐劑。利用藻類開發的脂粉和面粉是一個新的研究熱點。例如將可食用的杜氏鹽藻添加到面食中,高含量的PUFA、植物分子和礦物質能改善面食制品的感官特性。它們作為雞蛋的替代品,效果也非常好,尤其是對素食者而言。脂粉尤其是富含14∶0、16∶0、18∶1n-9和微藻EPA的脂粉,其抗菌性能也很不錯,可以在食品儲藏方面發揮重要作用[43]。微藻還可以用于提高奶酪等乳制品的營養特征。如小球藻(Chlorella)和節旋藻(Arthrospira)已被用于奶酪中,據報道對乳酸菌的活力有促進作用,能提高乳酪的質量及感官特性。眼微綠球藻(Nannochloropsisoculata)和球等鞭金藻(Isochrysisgalbana)已被用于開發新型的曲奇、意大利面、松餅等中,顯著增加了n-3 PUFA的含量,獲得消費者的感官好評[35]。類原核小球藻(Auxenochlorellaprotothecoides)可開發富含PUFA的海藻粉,被用于加工各種食品[44]。添加富含脂質尤其是n-3 PUFA的微藻,另一個重要優勢是使食品更耐受熱處理,這樣食品的整體營養價值也可以保留得更好。

微藻的開發應用如火如荼,但人們對微藻內部的代謝機制仍了解有限。將來有必要進行更深入的研究,以期對不同種類或處于不同環境的微藻的營養健康價值有更全面的認知,或者更進一步對其代謝途徑進行人為干預,實現提高產量、改善成分組成等。