超聲調控蛋白酶活性及對豌豆蛋白酶解的影響

陳 妍, 孫曉洋, 陳復生, 張麗芬

(河南工業大學糧油食品學院1,鄭州 450001)

(河南牧業經濟學院食品與生物工程學院2,鄭州 450046)

豌豆是世界上重要的豆科植物之一,富含淀粉和蛋白質。作為豌豆的副產品,豌豆蛋白具有良好的氨基酸平衡性和豐富的賴氨酸,是一種寶貴的蛋白質來源。近年來,由于食品行業和消費者對低致敏性、植物性食品和環境可持續性的認識不斷提高[1],豌豆蛋白的開發利用得到極大發展。豌豆蛋白在食品中的應用取決于其溶解性、乳化性和起泡性等功能特性[2],但由于其品種和生產方法的差異性以及加工過程中熱、機械和酸堿等因素均可降低豌豆蛋白功能特性和營養價值,導致其在食品工業中應用程度較低。因此,對豌豆蛋白進行改性處理可改善其利用性能[3]。

蛋白質改性是改善其功能特性和營養價值的有效途徑[4]。物理和酶法因條件溫和、操作簡單、環境友好、副反應少等優點,且酶法改性反應專一性強,成為了研究者們常用的蛋白質改性手段[5]。研究表明,豌豆蛋白是生產生物活性肽的良好來源,通過酶法改性可以從中得到具有促進健康的生物活性肽,例如抗高血壓肽、抗糖尿病肽以及抗氧化肽等,同時其水解產物還具備了與大豆蛋白相似的功能特性,如乳化性、起泡性等,具有極高的商用價值[6]。

堿性蛋白酶因在堿性pH下具有較強活性和穩定性而備受關注,研究表明通過堿性蛋白酶水解蛋白質可以得到具有高營養價值、血管緊張素轉換酶抑制活性和抗氧化性的水解產物[7,8]。但是,傳統酶解工藝存在反應緩慢、酶利用率低、底物轉化率低,以及攪拌不均勻等問題,從而導致底物與酶接觸時間短、酶活性降低、蛋白質聚集和結構不規則等[9]。針對這些問題,尋求能夠提高酶活性、穩定性以及酶解效率的方法成為了研究焦點。超聲波因具有效率高、操作簡單、經濟可行性等優點,作為一種非熱物理技術在食品工業中的應用也越來越受到重視。利用超聲波的空化效應可以將固體顆粒分散成較小尺寸顆粒,并且低強度的超聲作用可以使酶的活性增強,為提高酶解過程的整體效率提供了可能。例如研究者利用超聲波提高了堿性蛋白酶的α-螺旋結構和表面色氨酸含量,使得其結構發生有利改變繼而促使其酶活力增強[10]。同時有研究表明,短時間低頻超聲可提高纖維素酶活性,最大程度地提高了乙醇生產率[11]。超聲能夠在不改變酶結構完整性的情況下,使酶分子發生有利的構象變化,進而促進酶與底物之間的相互作用[12]。利用超聲調控酶制劑構象以及酶催化環境進而可以定向酶解蛋白質從而得到理想的目標產物。因此,物理和酶法進行聯合使用可以有效地提高傳質速度從而加快酶解反應的進行[13]。

研究將超聲和酶法聯合酶解豌豆蛋白制備其酶解產物以改善蛋白的功能特性。首先探討了超聲對堿性蛋白酶酶活的影響機制,在此基礎上,明確了超聲調控酶法對豌豆蛋白酶解產物的乳化特性和抗氧化活性的影響規律,結合綜合評價獲得超聲調控酶法制備豌豆蛋白酶解產物的最優工藝參數,并建立超聲調控酶法制備豌豆蛋白酶解產物技術。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豌豆蛋白;氫氧化鈉、鹽酸、十二水合磷酸二氫鈉、十二水合磷酸氫二鈉、十二烷基硫酸鈉(SDS)、無水乙醇、2,2-聯苯基-1-苦基肼基(DPPH)、水合茚三酮、氧化亞錫、三氯乙酸:分析純;堿性蛋白酶(200 000 U/g)、干酪素、甘氨酸:生物制劑;大豆油:食品級。

1.2 儀器及設備

K1100全自動凱式定氮儀,SCIENTZ-ⅡD超聲波細胞粉碎機,DC-2006節能型智能恒溫槽,TDL-5-A離心機,LGJ-25 C冷凍干燥機,GL-10 000 C低溫冷凍高速離心機,FM 200高剪切分散乳化機,722S可見光分光光度計,TU-1901紫外可見光分光光度計,MOS 450圓二色譜儀,MY17040001熒光分光光度計。

1.3 實驗方法

1.3.1 豌豆蛋白基本成分測定

水分含量測定:采用恒重法,按照國家標準GB 5009.3—2016;

脂肪含量測定:采用索氏抽提法,按照國家標準GB 5009.6—2016;

蛋白質含量測定:采用凱氏定氮法,按照國家標準GB 5009.5—2016;

灰分的測定:按照國家標準GB 5009.4—2016。

1.3.2 堿性蛋白酶的超聲處理

將堿性蛋白酶(10 mg)用磷酸鹽緩沖溶液(pH 8.0)溶解后過濾,使用探頭式超聲儀進行超聲處理,超聲脈沖時間設置為開2 s,關2 s。

采用單因素實驗設計,考察不同超聲參量對堿性蛋白酶的活性影響。單因素實驗設計如下:固定超聲時間15 min、超聲溫度45 ℃,設置超聲功率密度為1.36、2.04、2.71、3.39、4.07 W/cm3;固定超聲功率密度1.36 W/cm3、超聲溫度45 ℃,超聲時間設置為5、10、15、20、25、30 min;固定超聲功率密度1.36 W/cm3、超聲時間15 min,設置超聲溫度為30、35、40、45、50 ℃。

1.3.3 酶活測定

參照GB/T 23527—2009測定蛋白酶活力。將干酪素溶液作為堿性蛋白酶水解底物。用紫外可見分光光度計在275 nm處測量吸光度,用于計算反應所釋放的酪氨酸濃度。制作酪氨酸標準曲線,定義蛋白酶活力單位為對應每毫升酶液每分鐘水解酪蛋白產生1 μg酪氨酸。酪氨酸標準曲線見式(1):

y=0.007 6x,R2=0.999 8

(1)

1.3.4 動力學參數測定

將堿性蛋白酶于超聲功率密度1.36 W/cm3,超聲時間15 min,超聲溫度45 ℃下進行超聲處理用于后續動力學參數測定。干酪素溶液作為水解底物,酶活測定方法與1.3.3一致。將酶解反應溫度分別控制為30、35、40、45、50 ℃。

根據Kadkhodaee等[14]的方法研究超聲處理對堿性蛋白酶動力學參數的影響。酶促水解采用一級反應動力學模型描述,其一級化學反應力學模型見式(2):

ln(C/C0)=-Kt

(2)

反應t時間時酪蛋白的濃度C與酪氨酸的生成量成正比,即后續用酪氨酸生成量的變化來反映水解過程。酪氨酸的生成量為反應完全后酪氨酸的生成量(V∞)減去已經產生的酪氨酸(Vt),即式(3)為:

ln(V∞-Vt)=-Kt+lnV∞

(3)

式中:Vt為在時間t min時酪氨酸的質量濃度/μg/mL;V∞為酪蛋白徹底水解的酪氨酸的質量濃度/μg/mL。

1.3.5 圓二色譜測定

選擇在超聲功率密度1.36 W/cm3,超聲時間15 min,超聲溫度45 ℃條件下得到的堿性蛋白酶進行圓二色譜測定。參照Yu等[15]的方法,在室溫下進行堿性蛋白酶的圓二色譜(CD)掃描。在波長范圍(190～250 nm)內,以掃描速度50 nm/min進行掃描。并利用軟件分析α-螺旋、β-折疊、β-轉角、無規則卷曲含量。用于溶解堿性蛋白酶的磷酸鹽緩沖溶液作為樣品的空白溶液。

1.3.6 熒光光譜測定

選擇在超聲功率密度1.36 W/cm3,超聲時間15 min,超聲溫度45 ℃條件下得到的堿性蛋白酶進行熒光光譜測定。參照Yu等[15]的方法,在室溫下,于278 nm(激發波長,狹縫=5 nm),300～500 nm(發射波長,狹縫=5 nm)下測量未處理和超聲處理樣品的熒光發射光譜掃描。用于溶解堿性蛋白酶的磷酸鹽緩沖溶液作為樣品的空白溶液。

1.3.7 豌豆蛋白的酶解

1.3.7.1 超聲調控酶法制備豌豆蛋白酶解產物

將5.00 g豌豆蛋白溶于100 mL 35 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液中(pH 8.0),加入堿性蛋白酶10 mg后,迅速轉移在設定的超聲體系下進行水解,超聲設置開2 s、關2 s,水解結束后于90 ℃下進行高溫滅活15 min。滅酶后將溶液于4 ℃,10 000 r/min下離心30 min,冷凍干燥后于4 ℃儲存進行后續性質測定。

在超聲調控酶解過程中,采用單因素實驗設計,考察不同超聲參量對豌豆蛋白酶解產物的乳化特性和抗氧化活性影響。單因素實驗設計如下,固定超聲時間15 min、超聲溫度45 ℃,設置超聲功率密度為0.68、1.36、2.04、2.71、3.39、4.07 W/cm3;固定超聲功率密度2.71 W/cm3、超聲溫度45 ℃,超聲時間設置為5、10、15、20、25、30 min;固定超聲功率密度2.71W/cm3,超聲時間25 min,設置超聲溫度為30、35、40、45、50 ℃。

1.3.7.2 水解度的測定

采用茚三酮法進行水解度的測定,參照趙新淮等[16]的方法并進行修改。

配制質量濃度為0.02 g/mL茚三酮溶液備用,并制定甘氨酸標準曲線。甘氨酸標準曲線見式(4):

y=0.004 2x-0.238 9,R2=0.990 6

(4)

樣品水解度測定:取水解液1 mL、磷酸鹽緩沖液(pH 8.0)1 mL、茚三酮溶液1 mL加入到比色管中,沸水浴加熱15 min,冷卻后定容至25 mL,于570 nm下測吸光度,以蒸餾水作為空白對照。

水解度計算見式(5):

DH=ρPPH×VPPH×DPPH-ρPP×VPP×DPPm×N×106

(5)

式中:ρPPH和ρPP分別為豌豆蛋白酶解產物(PPH)和豌豆蛋白溶液中游離氨基質量濃度/μg/mL;VPPH和VPP分別為水解液和PP溶液體積/mL;DPPH和DPP分別為水解液和PP溶液稀釋倍數;m為原料質量/g;N為原料中氮的質量分數/%。

1.3.7.3 乳化特性測定

參照Dong等[17]的方法并進行修改。將質量濃度10 mg/mL PPH以水相∶油相=3∶1(體積比)比例溶液混合后在13 000 r/min轉速下均質2 min。均質結束立即從底部吸取50 μL乳液用10 mL質量濃度1 mg/mL的SDS溶液稀釋,混勻后于500 nm測量吸光度。乳液放置30 min后,再次從底部吸取50 μL乳液用10 mL質量濃度1 mg/mL的SDS溶液稀釋,混勻后于500 nm測量吸光度。乳化活性(EAI)和乳化穩定性(ESI)的計算如式(6)或式(7):

EAI=2×2.303×A0×NC×φ×10 000×L

(6)

ESI=A0ΔA×Δt

(7)

式中:A0是均質后立即稀釋的乳液的吸光度;N是稀釋倍數;C是蛋白質質量濃度/g/mL;φ是乳液的油體積分數/%;L為比色皿厚度/cm;ΔA是0 min和30 min的吸光度變化(A0-A30);Δt是時間間隔/min。

1.3.7.4 抗氧化性的測定

參照Evangelho等[18]的方法并進行修改。樣品質量濃度設置為5 mg/mL,配制濃度為0.1×10-3mol/L DPPH·溶液,將5 mL樣品與5 mL DPPH·溶液混合搖勻,室溫下避光反應15 min后于5 000r/min離心15 min。通過測量在517 nm處的吸光度來確定DPPH自由基的減少。

根據式(8)計算樣品清除DPPH自由基的能力:

DPPH·清除率=(1-AS8AC8)×100%

(8)

式中:AS是樣品的吸光度;AC是對照的吸光度。

1.3.8 數據處理

數據以平均值±標準偏差(SD)表示。利用SPSS26.0和Microsoft Excel 2016對實驗數據進行處理分析,并采用ANOVA方差分析進行顯著性檢驗(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 豌豆蛋白的主要成分分析

豌豆蛋白中的水分、蛋白質、脂肪、灰分的質量分數分別為(6.74±0.02)%、(81.23±0.04)%、(0.03±0.01)%、(6.59±0.07)%。

2.2 超聲對堿性蛋白酶的酶活影響研究

如圖1所示,堿性蛋白酶的酶活隨著超聲功率密度的增加先增大后減小,在超聲功率密度為1.36 W/cm3時,堿性蛋白酶的酶活力達到最高。超聲的空化現象是堿性蛋白酶活力隨強度變化的原因。超聲波可以破壞氫鍵或范德華力等弱相互作用,從而引起酶的構象變化[19]。低強度超聲使體系中存在穩定的空化效應,穩定空化氣泡的振蕩所產生的力改變了酶的空間構象,使得酶分子暴露更多的活性位點,增強了其與底物的接觸,從而提高了酶的活性[20]。

圖1 超聲對堿性蛋白酶酶活影響

由圖1可知,堿性蛋白酶的活性在超聲時間為15 min時達到最大,之后隨著時間的增加,活性出現減弱的趨勢。導致酶失活的機制可能是隨著超聲時間的增加加劇了空化作用,超聲分解水分子獲得的自由基以及超聲引起的剪切力均會引起酶分子構象的改變和破壞[21-23];此外,由于超聲空化作用引起的空化氣泡使蛋白質分子暴露在水-空氣界面上,擾亂了酶分子周圍的氫鍵、疏水相互作用等,從而使得酶分子構象發生改變[24]。

經過超聲處理后,堿性蛋白酶的活性顯示在45 ℃時為最適溫度。液體體系中的超聲波的影響機制主要分為空化和加熱2種形式[25]。本實驗采用了溫控循環水浴消除了超聲處理過程中帶來的加熱效應。可以看出,超聲處理能夠在合適的溫度范圍內刺激酶活力,且不影響酶的最佳反應溫度。溫度的進一步增加會干擾酶的活性以及穩定性,繼而出現了酶活力降低的現象。

2.3 超聲對堿性蛋白酶酶促速率常數的影響研究

速率常數是化學反應動力學的重要參數,由溫度、介質和催化劑決定。圖2a和圖2b分別表示未處理和超聲處理的堿性蛋白酶的ln(V∞-Vt)隨時間(t)的變化圖,在考察的溫度范圍內,經過不同處理方式的堿性蛋白酶催化蛋白水解均符合一級反應動力學,相關系數≥0.95。從表1中可以看出,隨著溫度的升高,堿性蛋白酶酶促反應速率常數逐漸增加,主要由于較高溫度下底物與酶之間碰撞的頻率增加。由圖2和表1可知,與對照組相比,超聲處理后堿性蛋白酶的速率常數增加,可能是由于超聲波產生的空化效應產生的壓力、剪切力以及溫度等改變了酶分子的結構,導致其更多的活性位點暴露,從而使得酶分子與底物更容易結合,表現出更高的反應能力[10]。

表1 超聲對堿性蛋白酶酶促反應速率常數(K)的影響

圖2 超聲對堿性蛋白酶酶促一級反應動力學影響

2.4 超聲對堿性蛋白酶結構的影響研究

超聲是一種周期性的壓力波動,可以動態干擾和控制酶的特性[26]。研究表明,超聲波能夠擾亂酶的分子結構,從而影響其活性[27]。堿性蛋白酶的活性區域主要在α和β結構域[28],因此,二級結構是影響其活性的關鍵因素。

超聲對堿性蛋白酶二級結構的影響如圖3a所示。CD光譜在190～200 nm呈現正帶,這是α-螺旋與β-折疊結構所形成的重合峰。堿性蛋白酶多數β-折疊結構的CD光譜在210～220 nm區域顯示負帶,在190～200 nm區域顯示正帶,222 nm和208 nm左右的波谷也顯示了α-螺旋結構的存在,以及β-折疊結構也在210～220 nm區域出現負峰譜帶,205～225 nm區間的譜圖是α-螺旋和β-折疊疊加的結果[29]。綜合表2中的β-折疊結構的含量百分比可得,超聲對堿性蛋白酶β-折疊結構無顯著影響。超聲后堿性蛋白酶β-轉角和α-螺旋結構的相對含量增加,表明經超聲處理后堿性蛋白酶的結構變得更加規律,更具有靈活性,酶活性增加且穩定性增強。

表2 超聲處理對堿性蛋白酶的二級結構質量分數影響

圖3 超聲對堿性蛋白酶的結構影響

酶的固有熒光與其芳香族氨基酸殘基有關,主要以色氨酸(Trp)為主[30]。超聲對堿性蛋白酶熒光光譜特性的影響如圖3b所示,超聲處理前后堿性蛋白酶的峰值位點沒有顯著變化,但是峰值強度顯著增加。熒光強度的增加,表明超聲可以誘導蛋白質的分子去折疊,破壞蛋白質分子的疏水相互作用,更多的Trp殘基暴露在外部,從而提高堿性蛋白酶的熒光強度[10]。

2.5 超聲調控酶法制備豌豆蛋白酶解產物的工藝研究

2.5.1 超聲對豌豆蛋白水解度的影響研究

圖4為超聲對豌豆蛋白水解度的影響。超聲可顯著提高PP的水解度。在超聲功率密度為1.36W/cm3時,水解度達到最高為16.78%。之后隨著超聲功率密度的增加,水解度趨于平衡。隨著超聲時間的增加,PP的水解度增加,持續穩定的空化效應不會對酶結構造成破壞,并且可以有效地改善傳質速度。此外隨著超聲時間的增加,PP固體顆粒的尺寸變小,結構更加松散,與酶結合的位點更多。超聲溫度為45 ℃時PP水解度達到最大,與超聲對酶的影響溫度一致。溫度的進一步增加并結合超聲產生的空化效應,使得局部產生高溫,削弱了酶的活力,從而使得水解度降低。

圖4 超聲對PP水解度的影響

超聲加快了酶促反應傳質速率。Suslick[31]報道超聲的化學效應不是來自與物質的直接相互作用,而是來自空化現象。在空化過程中產生的自由基會加速化學反應,且空化效應形成的局部湍流和液體微循環可增強非均質系統中的傳輸過程和消除傳質阻力[27]。超聲的空化效應使得PP在溶液中充分分散,并由于空化效應產生的機械效應將PP分散成更小的顆粒,破壞了蛋白的高級結構和亞單位組成,釋放出更多的親水基團使得蛋白質溶解度增加,并且較為松散的蛋白會暴露出更多的酶結合位點,與酶接觸面積增加從而使得水解度增大[32]。同時,超聲對酶的活性也有一定影響,低強度短時間的超聲處理使酶的二級和三級結構發生有利變化,酶的活性位點暴露更多,也可以增加PP的水解程度。

2.5.2 超聲對豌豆蛋白酶解產物乳化特性的影響研究

圖5為超聲對豌豆蛋白酶解產物的乳化特性的影響。隨著超聲功率密度、時間和溫度的增加,豌豆蛋白酶解產物的乳化活性逐漸增加后趨于穩定。乳化穩定性隨超聲時間和溫度的變化沒有顯著變化。超聲調控酶解制備的豌豆蛋白酶解產物的乳化活性隨著超聲功率密度的增加顯著提升,結合超聲對水解度的影響,可能是由于高強度超聲使可溶性的多肽團聚體增加,而可溶性團聚體可增強蛋白與水之間的相互作用,使蛋白在油-水界面能夠迅速擴散和吸收,蛋白在油水界面的吸附能力顯著增強,使豌豆蛋白酶解產物具有更高的乳化活性[33]。此外,超聲處理促進了PP分子結構形態從緊密的球形結構轉變為松散的球形結構。結合酶水解,超聲和酶共同作用打破了蛋白質聚合物中的共價鍵和肽鍵,使得蛋白質大分子解聚以及裂解,從而增加蛋白分子的流動性,更有利于它們在油-水界面的吸附和展開[34]。具有較高溶解度和較小分子量的水解產物可以在界面上迅速擴散和吸附,然而,小分子肽由于電荷排斥而不能在界面上展開和重新定向,因此,對乳液穩定性的影響并不顯著[35]。

圖5 超聲對豌豆蛋白酶解產物的乳化特性的影響

2.5.3 超聲對豌豆蛋白酶解產物抗氧化活性的影響研究

圖6為超聲對豌豆蛋白酶解產物的抗氧化活性的影響。圖6顯示經過超聲處理后豌豆蛋白酶解產物的抗氧化能力顯著增強,并在超聲功率密度為1.36 W/cm3時達到最大,與未經處理的豌豆蛋白酶解產物的抗氧化能力相比提高了32.81%。酶促反應的水解程度對產物抗氧化性能具有影響,較小分子量肽具有較好的抗氧化性,并且酶解和超聲共同作用使得蛋白中的疏水性基團暴露,與超聲輔助雙酶法從牛骨中提取抗氧化肽具有相同的結果[36]。超聲時間和溫度對豌豆蛋白酶解產物的抗氧化性無顯著影響(圖6)。酶解產物的抗氧化活性與其分子量分布、氨基酸組成以及疏水性有關。隨著超聲時間和溫度的增加,超聲提供了穩定的空化效應,酶解獲得的多肽結構可能沒有發生顯著變化。

圖6 超聲對豌豆蛋白酶解產物的抗氧化活性的影響

3 超聲調控酶解豌豆蛋白機制

超聲調控酶解體系中,超聲既可以作用于酶分子,同時也對底物產生一定的影響。超聲能夠使得酶分子的顆粒尺寸減小,增加催化劑表面積,降低傳質限制;并且在超聲作用下,堿性蛋白酶的構象發生改變導致更多的活性位點暴露,使其易于與豌豆蛋白結合從而更好地裂解多肽鏈。此外,在超聲酶解體系下,豌豆蛋白同時也受到超聲的空化作用所影響,超聲產生的機械效應破壞了蛋白質分子之間的相互作用力,使得蛋白質團聚體解聚,從而增加了酶與蛋白質分子的接觸面積[37]。同時蛋白質分子在空化作用下構象發生改變,從緊密的球型結構變得更加松散,結構展開,更多的官能團暴露[38],使其易于與酶分子結合,加快酶解速率。超聲誘導蛋白質的展開,增加了敏感肽鍵的暴露[9],不僅促進了蛋白質水解,同時也提高了酶解蛋白質產生生物活性肽的效率。超聲調控酶解可以有效地調控酶解的程度和酶的作用部位,同時可使酶解產物的疏水鏈段暴露,增強豌豆蛋白酶解產物的抗氧化活性以及界面性質。因此,探究超聲調控酶解反應可為超聲在未來食品行業中的應用提供參考。

4 結論

超聲能夠在合適的范圍內提高堿性蛋白酶的酶活力。與對照組相比,超聲功率密度1.36 W/cm3、時間15 min、溫度45 ℃時,堿性蛋白酶的酶活力提高了22.09%。根據酶促反應動力學結果可知,在30～50 ℃范圍內,超聲均能顯著提高堿性蛋白酶的酶促反應速率常數,提高堿性蛋白酶的酶促反應能力。圓二色譜和熒光光譜分析結果顯示,超聲使堿性蛋白酶的結構更加規律且更具有靈活性,同時暴露出更多的色氨酸基團。

在堿性蛋白酶的合適超聲參考范圍內進行超聲調控酶解豌豆蛋白,利用熵值法綜合評價超聲調控酶解豌豆蛋白產物的乳化特性和抗氧化活性,結果表明,超聲功率密度2.71 W/cm3、時間25 min和溫度45 ℃為最佳酶解條件;與對照組相比,超聲調控酶解豌豆蛋白產物具有較好的乳化活性和抗氧化活性;超聲對酶解過程具有積極作用。超聲可以增強酶活性并促進酶解反應,同時可提高酶解產物的功能特性,研究結果為超聲在食品行業中的應用提供了參考。