混菌固態發酵復合植物蛋白源工藝優化

孫珊珊, 楊 霞, 陳倪慧, 雷西汀, 葉金云, 付石軍, 沈志強

(湖州師范學院生命科學學院1, 湖州 313000)

(山東省濱州畜牧獸醫研究院2,濱州 256600)

(水生動物繁育與營養國家地方聯合工程實驗室3,湖州 313000)

(浙江省水生生物資源養護與開發技術研究重點實驗室4,湖州 313000)

棉粕、菜粕和豆粕是動物飼料中廣泛應用的植物蛋白源。由于近幾年豆粕價格波動較大,資源緊張,更多傾向使用棉粕和菜粕。但由于其中存在抗營養因子以及氨基酸組成不平衡,嚴重影響在飼料中的消化利用率。游離棉酚是影響棉粕在動物飼料中使用的最重要的抗營養因子[1, 2],含有棉酚的飼料會對動物機體造成負面影響,如阻礙其生長、導致腸道消化系統異常等[3]。硫苷和單寧是菜粕中主要的抗營養因子。菜粕中的芥子酶遇到本身無毒的硫苷(硫代葡萄糖苷)時,使其產生對動物健康造成傷害的異硫氰酸酯和噁唑烷硫酮兩種物質[4]。單寧導致胃腸蠕動緩慢,降低植物蛋白消化率[5]。

研究發現,有些抗營養因子,如游離棉酚(棉粕)、硫苷(菜粕)通過加熱可以降低,但降解率不高。在微生物發酵過程中,產生多種酶類,不但可以降低棉粕和菜粕中纖維素等物質,提高棉粕和菜粕中蛋白質,使蛋白分解成小分子易吸收的小肽,還能有效改善消化酶活性、腸道菌群和免疫系統[6-8]。微生物發酵被認為是一種高效、經濟、環保的降解抗營養因子、改善動物飼料營養品質的有效途徑[9, 10]。Dossou等[11]研究表明,當發酵菜粕替代56.25%質量分數魚粉,不會對紅鯛的生長、營養利用、免疫能力和應激反應產生不利影響。申佳佳等[12]研究表明馬岡鵝飼料中替代高于20%質量分數約的發酵飼料,對日齡28～70馬岡鵝的腸道形態和免疫功能會造成傷害。Zhu等[13]研究發現喂食替代0%、5%、10%和15%質量分數發酵豆粕的斷奶豬,平均日增重和平均日采食量顯著增加。

目前用于發酵植物蛋白源的微生物有細菌、酵母和真菌,枯草芽孢桿菌具有抑菌力強等優點,可有效提高發酵粕類的營養價值[14];酵母菌能提高植物蛋白源中的粗蛋白和礦物質含量[15]。Shi等[16]研究表明,以玉米和豆粕為原料,選擇枯草芽孢桿菌和糞腸球菌進行兩階段發酵,發酵后不但降解了抗營養因子,還提高了混合飼料的營養品質和消化率。吳正可[17]以菜粕為原料,采用酵母菌、枯草芽孢桿菌以及乳桿菌混合固態發酵,硫苷含量降解48.79%。嵇樂樂[18]以菜籽粕為原料,利用酵母菌和枯草芽孢桿菌先進行混菌發酵2 d后,再將解淀粉芽孢桿菌接入再發酵48 h,硫苷降解率可高達99.07%。石鴻輝等[19]研究表明混菌發酵要優于單菌發酵,采用枯草芽孢桿菌、酵母菌以及黑曲霉混菌發酵辣木莖葉粉,混菌發酵后的辣木莖葉粉粗蛋白提高率明顯高于單一菌種發酵。研究通過探討不同發酵工藝對發酵后復合植物蛋白源的營養成分及抗營養因子的影響,篩選出最佳發酵工藝參數,為生產實踐提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗菌種

杰丁塞柏林德納氏酵母BNCC194629及枯草芽孢桿菌BNCC353544均購自北京北納創聯生物技術研究院,實驗室4 ℃保存。

1.1.2 主要原料

棉粕、菜粕及玉米蛋白粉,粉碎過60目篩備用,棉粕的粗蛋白質量分數57.58%,棉粕的游離棉酚質量分數703 mg/kg,菜粕的粗蛋白質量分數36.81%,菜粕的硫苷含量41.87 μmol/g,菜粕的單寧質量分數5.00 g/kg。

1.1.3 培養基

YM營養肉湯培養基及NB營養肉湯培養基。

發酵培養基:參考孫林等[20]、涂瑞等[21]及王婷[22]的方法,以質量分數計,棉粕80%,菜粕10%,玉米蛋白粉10%,料水比1.0∶0.8,發酵pH 6.5。

1.2 方法

1.2.1 菌種發酵培養液的制備

將杰丁塞柏林德納氏酵母和枯草芽孢桿菌的菌種進行活化,平板培養24 h后,接種環刮取2環,接入裝有150 mL液體培養基中,分別在30 ℃、140r/min和37 ℃、140 r/min條件下培養24 h,按2%接種比例各擴培一代,各獲得500 mL發酵培養液,其中活菌數分別為2×108CFU/mL和2×1010CFU/mL。

1.2.2 混菌接種比例

研究表明影響發酵的因素主要有:發酵溫度、發酵時間、料水比以及接種量。參考王婷[22]方法,將發酵條件設置為:復合植物蛋白源(以質量分數計,棉粕80%,菜粕10%,玉米10%),溫度32 ℃,料水比1.0∶0.8,接種質量分數10%,發酵時間3 d,pH 6.5。設定杰丁塞柏林德納氏酵母和枯草芽孢桿菌5個不同比例,分別為:1∶1、1∶2、1∶3、2∶1和3∶1,進行單因素實驗,以游離棉酚降解率為評價指標,確定最佳混菌發酵比例。

1.2.3 固態發酵

按照棉粕:菜粕∶玉米=8∶1∶1比例混合,稱取100 g底物,放入規格為500 mL三角瓶中,設置3個平行,加入30 mL蒸餾水,攪拌均勻后,121 ℃高壓滅菌25 min。室溫冷卻待用。根據料水比,在三角瓶中加入相應蒸餾水同時注意調節pH,用玻璃棒攪拌均勻,杰丁塞柏林德納氏酵母與枯草芽孢桿菌按照比例進行添加,帶透氣閥封口膜封口,同一時間將樣品放進搖床120 r/min、32 ℃培養。發酵完成后60 ℃烘干冷卻,粉碎過60目篩,自封袋密封并標記,保存于4 ℃冰箱待測。

1.2.4 正交實驗

參考陳雅湘[23]研究,以發酵溫度、發酵時間、料水比以及接種量為四因素正交實驗,正交表見表1。采用加權法[24],以總變化率(S=0.6×X+0.2×Y+0.1×Z+0.1×W)為評價指標,設置3個平行。式中:S為總變化率;X為游離棉酚降解率;Y為硫苷降解率;Z為蛋白質增加率;W為粗灰分增加率。

表1 正交實驗設計表(44)

1.2.5 中試發酵復合植物蛋白源

參考2.2所得最優條件,恒溫發酵復合植物蛋白源45 kg,發酵結束后60 ℃低溫烘干,粉碎過60目篩,測定發酵后復合植物蛋白源中游離棉酚、硫苷、單寧、粗蛋白、粗灰分、鈣、磷及氨基酸含量。

1.3 測定指標及方法

采用氯化鈀比色法測定硫苷的含量;采用間苯三酚法測定游離棉酚的含量[25];采用全自動定氮儀測定粗蛋白含量;采用試劑盒測定酶活;采用氨基酸自動分析儀測定氨基酸含量;采用國標法測定粗灰分、鈣、磷的含量。

1.4 數據處理

數據以“平均值±標準誤”表示,通過統計軟件SPSS 25.0進行one-way ANOVA方差分析,Duncan多重比較,P<0.05表示差異性顯著。

2 結果與分析

2.1 不同接種比例對游離棉酚的影響

復合植物蛋白源中,棉粕質量分數80%,以游離棉酚降解率為評價指標,結果如圖1,當杰丁塞柏林德納氏酵母和枯草芽孢桿菌的接種比例為1∶3時,游離棉酚降解率達最大值,為61.67%,且顯著高于1∶1、1∶2、2∶1和3∶1組(P<0.05)。由此分析,將后期混菌發酵的接種比例設為1∶3。

注:誤差線表示標準誤差,柱上相同字母代表差異不顯著(P>0.05),字母不同代表差異顯著(P<0.05)。

2.2 混菌固態發酵復合植物蛋白源工藝優化

通過杰丁塞柏林德納氏酵母和枯草芽孢桿菌混菌固態發酵復合植物蛋白源工藝優化正交實驗,由表2可知,游離棉酚降解率76.45%(P<0.05),硫苷降解率63.45%(P<0.05),粗蛋白增加率11.31%(P<0.05),粗灰分提高了6.25%(P>0.05),總變化率平均值在溫度32 ℃、料水比1∶0.6、時間24 h、接種量8%時最高(P<0.05)。由極差分析可知,對總變化率影響最主要的因素依次是:時間、溫度、接種量和料水比(P<0.05)。

表2 混菌發酵植物蛋白源后總變化率

2.2.1 不同因素和水平對總變化率的影響

由表2極差分析可知,溫度、料水比和接種量對總變化率的影響不顯著(P>0.05),而接種時間是24 h時總變化率顯著高于其他水平(P<0.05),說明時間是影響總變化率的主要因素。因此,影響總變化率的主要效應因素排序依次是:時間、溫度、接種量、料水比。

2.2.2 不同因素和水平對游離棉酚降解率的影響

由表3極差分析可知,溫度、接種量和料水比對游離棉酚降解率的影響不顯著(P>0.05)而時間是24 h時游離棉酚降解率顯著高于其他水平,差異顯著(P<0.05)。說明時間影響游離棉酚降解率的主要因素。因此,影響游離棉酚降解率的主要效應因素排序依次是:時間、溫度、接種量、料水比。

表3 不同因素和水平游離棉酚降解率的影響

2.2.3 不同因素和水平對硫苷降解率的影響

由表4極差分析可知,時間、溫度和料水比對硫苷降解率的影響不顯著(P>0.05)而接種量是4%時硫苷降解率顯著高于其他水平,差異顯著(P<0.05)。說明接種量影響硫苷降解率的主要因素。因此,影響硫苷降解率的主要效應因素排序依次是:接種量、時間、溫度、料水比。

表4 不同因素和水平對硫苷降解率的影響

2.2.4 不同因素和水平對粗蛋白增加率的影響

由表5極差分析可知,時間、料水比和接種量對粗蛋白增加率的影響不顯著(P>0.05)而溫度是34 ℃時粗蛋白增加率顯著高于其他水平,差異顯著(P<0.05)。說明溫度影響粗蛋白增加率的主要因素。因此,影響粗蛋白增加率的主要效應因素排序依次是:溫度、時間、料水比、接種量。

表5 不同因素和水平對粗蛋白增加率的影響

2.2.5 不同因素和水平對粗灰分增加率的影響

由表6極差分析可知,接種量、溫度、時間和料水比對粗灰分增加率的影響不顯著(P>0.05),而接種量是8%時粗灰分增加率顯著高于其他水平,但差異不顯著(P>0.05)。說明接種量影響粗灰分增加率的主要因素。因此,影響粗灰分增加率的主要效應因素排序依次是:接種量、溫度、時間、料水比。

表6 不同因素和水平對粗灰分增加率的影響

確定杰丁塞柏林德納氏酵母和枯草芽孢桿菌混菌固態發酵復合植物蛋白源最佳工藝為:溫度32 ℃、料水比1.0∶0.6、時間24 h、接種量8%。

2.3 中試驗證實驗

2.3.1 混菌發酵對復合植物蛋白源各項指標的影響

參考L16(44)正交實驗所得最佳工藝,按1.2.3所示方法,中試發酵45 kg復合植物蛋白源。由表7可見,中試后游離棉酚降解率和硫苷降解率分別由原來的77.45%、63.45%增加到77.38%、66.98%(P<0.05),粗蛋白質量分數由11.31%增加到12.98%(P>0.05),粗灰分質量分數由6.25%減少到4.87%(P>0.05),總變化率中試前后無顯著變化(P>0.05)。

表7 混菌發酵中試前后各個指標的變化/%

2.3.2 混菌發酵對復合植物蛋白源抗營養因子的影響

由表8分析可知,最佳工藝條件下復合植物蛋白源發酵前后單寧質量分數由原來的5.00 g/kg降到4.49 g/kg(P<0.05),硫苷含量由原來的41.87 μmol/g降到15.22 μmol/g(P<0.05),游離棉酚質量分數由原來的703.00 mg/kg降到164.49 mg/kg(P<0.05)。

表8 混菌發酵前后抗營養因子的變化

2.3.3 混菌發酵對復合植物蛋白源營養物質的影響

由表9分析可知,最佳工藝條件下復合植物蛋白源發酵前后蛋白質質量分數由原來的58.97%增加到65.63%(P<0.05),鈣、總磷質量分數分別由原來的0.61%、1.52%提高到0.67%(P>0.05)、1.54%(P<0.05),水質量分數由原來的7.36%降到4.36%(P<0.05)。

表9 混菌發酵前后營養物質的變化/%

2.3.4 混菌發酵對復合植物蛋白源酶活的影響

最佳工藝條件下,混菌發酵前后復合植物蛋白源的酶活變化見圖2,胃蛋白酶和脂肪酶活性具有顯著提高(P<0.05),分別提高了125.72%和43.67%(P<0.05),α淀粉酶活性發酵前后變化不顯著(P>0.05)。

注:肩標*代表發酵前后差異顯著(P<0.05),**代表差異極顯著(P<0.01)。

2.3.5 混菌發酵對復合植物蛋白源氨基酸含量的影響

由表10可知,氨基酸質量分數提高了8.22%,其中甲硫氨酸、苯丙氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、賴氨酸和亮氨酸分別提高了12.66%、8.77%、9.56%、7.64%、6.70%、10.37%和7.10%(P<0.05)。

表10 發酵復合植物蛋白源前后氨基酸質量分數變化

3 討論

3.1 混菌發酵復合植物蛋白源最佳工藝的確定

對于不同的評價指標,發酵工藝影響因素的主次順序會發生變化。以游離棉酚降解率為評價標準時,發酵時間是最重要的影響因素;以硫苷降解率為評價標準時,接種量是最重要的影響因素;以粗蛋白增加率為評價標準時,發酵溫度是最重要的影響因素;以粗灰分增加率為評價標準時,接種量是最重要的影響因素。因此,影響復合植物蛋白源發酵的主要因素有發酵時間、發酵溫度、接種量。與已有的相關研究存在不同之處,Li等[26]和吝常華等[27]的研究表明影響發酵的主要因素有發酵溫度、時間、料水比以及接種量。張佳斌等[28]研究表明影響發酵主要因素有發酵溫度、料水比以及接種量,王曉凡等[29]研究表明影響發酵主要因素有初始pH、料水比以及發酵溫度,產生不同結果的原因可能與發酵底物、菌種的數量以及性質等因素有關。

3.2 混菌發酵復合植物蛋白源對抗營養因子的影響

混菌發酵效果要優于單菌,王曉凡等[29]采用3種不同菌種,分別單菌發酵菜粕,枯草芽孢桿菌降解效果最好,硫苷含量由33.33 μmol/g降解到14.53 μmol/g,三菌混合發酵菜粕中硫苷含量由33.33 μmol/g降解到2.79 μmol/g。方潔等[30]研究混菌發酵后硫苷和植酸的降解效果優于單一菌株發酵,原因可能是混菌發酵時會產生更多酶,利于降解抗營養因子。本研究優選杰丁塞柏林德納氏酵母以及枯草芽孢桿菌,通過不同接種比例試驗,結果顯示當以1∶3比例接種時,游離棉酚降解率最大為61.67%。植物蛋白源中常見的抗營養因子有游離棉酚、單寧、硫苷及其產物異硫氰酸酯和噁唑烷硫酮等,對動物本身造成傷害。目前有相關研究表明混菌發酵后抗營養因子有所改善,孫林等[20]研究表明混菌發酵在發酵溫度34 ℃、發酵時間48 h和料水比1.7∶1條件下,采用三菌混合發酵菜粕,硫苷可降解77.58%。帖余等[31]研究表明以菜粕和麩皮為原料,先采用黑曲霉發酵菜粕48 h后,再加上乳桿菌進行兩步法混菌發酵,硫苷最初含量23.09 μmol/g,發酵后硫苷降解率為45.21%。周曉容等[32]研究表明以棉籽粕為原料,采用短乳桿菌和短小芽孢桿菌混菌固態發酵,研究表明混菌發酵后,異硫氰酸酯、單寧和噁唑烷硫酮降解率分別為92.20%、35.81%、100%。Wang等[33]研究表明以菜籽粕為原料,采用三菌進行混菌發酵,最初硫苷含量由75.6 μmol/g降解85.05%后,硫苷含量下降至11.3 μmol/g,提高飼料的營養價值。本研究發現與前人研究結果相似,游離棉酚降解率為77.38%,硫苷降解率為66.98%,單寧降解率為10.20%,結果表明游離棉酚和硫苷的降解效果理想,而單寧降解效果不理想,在發酵過程中影響抗營養因子降解率的原因可能為:一是混菌發酵比單菌發酵過程中產酶能力更強,在發酵過程選擇菌種不同,分泌降解抗營養因子的酶類也不同;二是不同復合發酵底物中營養物質以及抗營養因子比單一底物更豐富,從而使得抗營養因子的降解效果略有差異。

3.3 混菌發酵復合植物蛋白源對常規營養物質的影響

混菌發酵過程中,會使得很多酶的活性得到提高。金紅春等[34]以棉粕為原料,復合菌發酵后的淀粉酶和脂肪酶都有不同程度的提高。萬里等[35]研究表明混菌發酵后的飼料酸性蛋白酶、脂肪酶、α-淀粉酶活性與未發酵相比有顯著提高。周金影[36]研究發現不同菌種發酵混合棉粕后,蛋白酶活性均顯著提高。本研究與之相似,胃蛋白酶和脂肪酶活性具有顯著提高。

飼料中粗蛋白以及鈣、磷等營養物質的攝入量不足,會影響動物健康發育以及經濟效益。本研究發現發酵后的復合植物蛋白源的粗蛋白提高了12.98%,粗灰分質量分數提高了4.87%,鈣、磷質量分數分別提高了9.83%、1.31%。目前有相關研究也證實發酵后的營養物質得到了提高,涂瑞等[21]以菜粕和棉粕為原料,利用三菌混合固態發酵,發酵后混合粕類粗蛋白和粗灰分質量分數分別提高了15.19%和11.67%,鈣、磷質量分數分別顯著提高了18.18%和22.43%;王曉玲等[37]以棉粕為原料,利用兩菌混合固態發酵,發酵后粗蛋白質量分數提高了19.00%。鄭環宇等[38]以豆粕為原料,利用四種菌進行固態發酵后,粗蛋白質量分數由43.62%提高到54.22%。粗蛋白含量有所提高,可能是枯草芽孢桿菌和杰丁塞柏林德納氏酵母在發酵過程中能分泌多種酶,同時將底物中的非蛋白態氮轉化為菌體蛋白或分泌蛋白,使發酵后蛋白含量提高。發酵后復合植物蛋白源中的粗灰分含量提高,原因可能是礦物質在發酵過程中不斷累積。菌種在發酵過程中消耗了底物中的能量物質,導致能量物質逐步減少,鈣和磷比例在干物質中就相對提高。

必需氨基酸的缺乏會影響動物正常生長,賴氨酸是動物飼料中極易缺乏的,近年來對必需氨基酸中的亮氨酸、纈氨酸以及異亮氨酸等相關研究成為熱點。付敏等[39]以菜粕和麥麩為原料,在接種量16%、料水比(1∶1),發酵時間4 d條件下,利用白地霉、黑曲霉以及枯草芽孢桿菌進行混菌發酵,發酵后的總必需氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸和賴氨酸質量分數分別增加了3.82%、6.88%、20.39%、33.33%和22.73%;張文舉等[40]以棉粕為原料,采用黑曲霉和酵母菌混菌發酵,總氨基酸和必需氨基酸質量分數分別提高了18.15%和19.18%,賴氨酸、蛋氨酸、纈氨酸和亮氨酸質量分數分別提高了20.24%、66.29%、35.55%和29.12%。Zhang等[41]以南美對蝦商業飼料為原料,在溫度35 ℃,時間24 h,料水比1∶0.6條件下利用三菌(植物乳桿菌、釀酒酵母和薩芬斯芽孢桿菌)進行混菌發酵。發酵后的總氨基酸和必需氨基酸質量分數分別提高了14.63%和11.66%。賴氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸分別提高了16.35%、13.25%、14.72%和11.32%。本研究與前人研究結果一致,發現發酵后復合植物蛋白源中氨基酸中的纈氨酸、異亮氨酸、賴氨酸和亮氨酸質量分數分別提高了7.64%、6.70%、10.37%和7.10%。在混菌發酵過程中,影響氨基酸變化原因可能是在發酵過程中將底物非蛋白態氮轉化為微生物蛋白或分泌蛋白,因此發酵后蛋白含量提高,在發酵過程中會將蛋白分泌成氨基酸和其他小分子蛋白。

4 結論

通過添加不同接種比例發酵復合植物蛋白源,以游離棉酚降解率為評價指標,當杰丁塞柏林德納氏酵母和枯草芽孢桿菌混菌的接種比例為1∶3,游離棉酚降解率最高。為優化發酵工藝參數,采用以發酵時間、發酵溫度、料水比以及接種量為因素的正交實驗,最佳發酵工藝為發酵溫度32 ℃,接種量8%,料水比1.0∶0.6,發酵時間24 h,在此工藝下混菌發酵后的復合植物蛋白源,游離棉酚降解率以及硫苷降解率得到明顯提高,粗蛋白含量、鈣含量、磷含量、氨基酸等營養物質均得到提高,研究發現不但能有效降解復合植物蛋白源中抗營養因子,還提高了復合植物蛋白源中營養物質的含量。