嫁接緩解煙草低鉀脅迫的生理機制研究

胡瑋，邸青

（重慶市農業科學院，重慶 401329）

作為一種大量營養元素，鉀不僅能夠影響烤煙（Nicotiana tabacum Linn.）的生長狀況，同時也是煙葉質量的評價標準之一，是我國優質烤煙生產的一個重要限制因素。核酸、蛋白質、碳水化合物的形成、光合作用、酶的活化和滲透調節的過程都與鉀有關[1-2]。只有在足夠高的鉀積累條件下生長，烤煙產品才具有更好的芳香味、易燃性和葉片的加工性[3]。但是，對于我國大部分煙草種植區來說，植煙土壤中有效鉀含量較低，使得煙葉中的鉀含量無法達到全球優質煙葉的標準。根據植煙土壤區劃調查結果顯示，我國63.1%煙草種植土壤中有效鉀含量低于臨界水平（150 mg·kg-1），其中極缺鉀土壤占19.6%，平均有效鉀含量僅為57.5 mg·kg-1，缺鉀土壤占43.5%[4]。因此，提高烤煙對鉀的吸收和利用效率已成為煙草種植中的一個重要議題。

鉀在植物中具有很強的流動性，可以實現地下部到地上部的循環利用，這一功能對植物的電離平衡和能量節省具有重要作用。K+通道基因SKOR和AKT2調控了K+在植物體內的再分布過程，前者在根系的中柱鞘和木質部薄壁細胞中大量表達，介導了K+由地下部到地上部的轉運[5]；而后者在根和葉的韌皮部維管系統中大量表達，在韌皮部K+的卸載過程中起主導作用[6]。當植物感知到外部鉀虧缺信號時，細胞產生短期和長期響應模式：對于短期響應，AKT1上調表達，細胞質中的鉀水平通過液泡向外釋放K+來維持；對于長期響應，當脅迫期持續數天甚至數周時，細胞質中的K+濃度降低，會影響植物細胞的代謝過程，依賴于K+活化的H+-PPase 活性被抑制，丙酮酸含量降低[7]。除此之外，植物根系伸長區的細胞伸長亦需要K+產生的細胞膨壓。當根土界面鉀水平較低時，植株根系形態會發生變化，主根生長受到抑制，根毛生長旺盛，而這種對環境的適應是由和生長激素共同決定的[8]，乙烯在這個過程中充當了低鉀脅迫信號轉導的信息物質[9]。擬南芥生長素合成基因缺失突變體aux1、axr1、axr2的研究表明，生長素也是根系形態對鉀脅迫響應機制的組成部分[10]。

隨著研究的不斷深入，嫁接技術可提高作物品質、長勢和產量，改變品種，提高環境抗逆性和優化異花授粉[11-13]。此外，嫁接技術對提高植物養分吸收也有顯著的影響[14-16]。然而，關于嫁接對烤煙鉀饑餓耐受性的影響，文獻報道較少。因此，本研究希望驗證能否通過鉀高效基因型煙草砧木嫁接誘導烤煙對鉀的脅迫耐受。為了完成這一目的，筆者分析了鉀脅迫時下胚軸和根分生組織的凈K+流速、不同組織中的鉀含量、烤煙生長，以及參與鉀吸收和轉運的關鍵基因的時空特征。

1 材料與方法

1.1 供試材料

鉀高效基因型烤煙五峰2 號和常規品種云煙87 分別由湖北省煙草公司宜昌市公司和貴州省煙草公司畢節市公司提供。

1.2 試驗地點與處理

試驗在重慶農科院日光溫室進行。為了保證嫁接成功率，砧木種子在接穗種子前7 d 播種。當砧木上出現6～8 片真葉時，選擇“劈接”方式進行嫁接處理。當嫁接植株長出新葉后，將植株移栽到水培箱中，每個容器種植12 株幼苗。水培營養液的配方與筆者之前的研究一致[17]。試驗過程中，利用壓縮機軟管向每個水培箱供氧，以保證氧氣供應。試驗設置了2 個鉀水平：+K，正常鉀供應水平（5 mmol·L-1）；-K，鉀脅迫（0.5 mmol·L-1）。營養液中以K2SO4為鉀源，調節不同K+水平。此外，采用4 種嫁接組合[五峰2號（W）、云煙87（Y）、W/Y（W 為接穗，Y 為砧木）和Y/W（Y 為接穗，W 為砧木）]進行試驗。8 個處理重復6 次，每個重復12 株，每隔4 d 更換1 次營養液。處理20 d 后，收集植株樣品。

1.3 測試指標與方法

1.3.1 植株長勢指標 每個處理分別選取4 株烤煙幼苗，對各處理的干物質質量、株高、莖圍、根長、葉面積進行測定。選擇莖上的倒數第二片真葉進行葉面積測量（LI-3000C,LI-COR,USA）；用電子天平測定煙株的干質量；根長采用WinRhizo Pro 軟件進行分析；用皮卷尺測量株高和莖圍。

1.3.2 煙株中鉀含量的測定 煙草植株在子葉下胚軸被切成2 段。子葉上方為地上部，子葉下方為地下部。采用火焰原子吸收光譜儀測定干樣品（Varian AA-220FS,Thermo Fisher Scientific,USA）中的鉀含量[18]。

1.3.3 煙株下胚軸橫切面K+流速測定 試驗開始前，先在+K 水平的處理中選取一半植株使用0.5 mmol·L-1K2SO4進行預處理2 h，以觀察各嫁接組合在短期鉀脅迫下的表現。將煙草植株從子葉下胚軸處切成2 段，之后膠帶分別將地上部和地下部固定于測量液中[0.1 mmol·L-1CaCl2和0.3 mmol·L-12-ethanesulfonic acid（MES）,pH 值為6]平衡30 min。將樣品分別放入含有0.5 mmol·L-1K+和5 mmol·L-1K+水平的測量室中。將電極固定在樣品橫截面的中心，在該試驗條件下測定凈K+通量20 min，以減小波動引起的變異性。每個樣品測量2 次。

每個嫁接組合選取6 株煙株，采用非損傷微測技術（NMT system BIO-IM;Younger Corp.,Amherst,MA,USA）測定其下胚軸橫切面的凈K+流速[19-20]，用ASET 2.0 （Sciencewares, Falmouth, MA, USA）和iFluxes 1.0 （YoungerUSA, LLC, Amherst, MA, USA）軟件記錄并轉化數據[21]。利用Fick 擴散定律計算凈K+流速[22]。

1.3.4 烤煙根系分生區K+流速測定 該試驗只涉及烤煙根系對養分離子的吸收。因此，本試驗部分處理減少為只有未嫁接的W 和Y 烤煙品種2 個處理，測定部位為根的分生組織。為了闡明K+通道和質膜H+-ATP 酶復合物在2 個烤煙品種中對K+吸收轉運的影響，筆者分別使用了原釩酸鹽和氯化銫對試驗樣品進行了預處理（前者為質膜H+-ATP 酶的特異抑制劑，后者為K+通道的阻斷劑）[23]，并設置了不使用抑制劑的對照處理。其余測定方法與煙草下胚軸橫截面K+流速測定方案一致。

1.3.5 總RNA 的提取與實時定量PCR 使用TRIzol 試劑（Invitrogen,ThermoFisher，USA），根據說明書從各嫁接組合中提取總RNA（根：HAK1 和NKT1；莖：SKOR 和AKT2）。之后，使用RNase-free DNase 去除剩余的DNA 污染。cDNA 第一鏈的合成體系由1 μg 總RNA、1 μL oligo（dT）18primer、MMuLV reverse transcriptase（TaRaKa, Japan）構成，加水定容至20 μL。按照試劑盒Light Cycler 480 SYBR Green I Master kit 的說明操作，采用實時熒光定量PCR（ABI 7900HT,Applied Biosystems,USA）技術檢測目標基因的表達，每個樣本分析至少重復3次。采用Primer premier 5.0 軟件設計基因特異性引物，所有引物如表1 所示。熔融曲線分析表明，各引物具有較高的特異性。PCR 產物的技術使用2-ΔΔCt方法[24]。

表1 實時定量PCR 分析中使用的引物

1.3.6 數據分析 所有研究數據均以平均值±標準差的形式表示，采用SAS 9.3 版（StatisticalAnalysis System Institute Inc., Cary, NC, USA）進行雙因素方差分析，以確定嫁接對煙草的影響，采用鄧肯新復極差法對各處理之間的顯著性進行檢驗（P<0.05）。

2 結果與分析

2.1 烤煙植株長勢

鉀脅迫顯著抑制了煙草植株的生長，而嫁接技術則顯著緩解了這種抑制作用。對于-K 處理來說，烤煙幼苗全株干質量、株高、莖圍、葉面積、根長均顯著降低。通過不同砧木的嫁接看出，與W/Y（44.5%）和Y（61.3%）處理相比，鉀饑餓導致W（31.1%）和Y/W（32.2%）的干質量減少量較低（表2）。各嫁接處理的株高、莖圍、根長、葉面積指標變化的趨勢與干質量類似。在正常供鉀水平下，W 和Y/W 處理的生長表現明顯優于W/Y 和Y 處理，而使用相同砧木的處理則差異不顯著（如W 和Y/W 處理）。缺鉀條件下，煙草生長趨勢與+K 條件下一致。值得注意的是，在鉀脅迫下，W/Y 嫁接組合的植株長勢明顯優于Y 品種，這與+K 條件下這兩者之間沒有顯著差異不同。

表2 不同嫁接組合和鉀水平對植株長勢的影響

2.2 烤煙植株地上部和地下部鉀含量的分布

嫁接同時影響了不同烤煙品種K+的吸收和分布狀況。由圖1 可見，鉀脅迫顯著降低了烤煙的整株K+吸收能力，但不同嫁接組合的對烤煙整株K+吸收能力的降低程度不同。在+K 水平下，以W 為砧木的嫁接組合（如W 和Y/W）整株鉀含量比以Y 為砧木的嫁接組合增加了97.6%，在-K 水平下，整株鉀含量增加了137.76%。值得注意的是，與+K 水平的數據不同，W/Y 的整株鉀含量在-K 水平時顯著高于Y，而前者沒有顯著差異。這表明在缺鉀條件下，W基因型烤煙品種作為接穗可以提高Y 基因型烤煙對K+的吸收。在-K 處理時，地上部平均鉀含量占植株總鉀含量的44.3%，比+K 處理高7.3%。此外，在鉀脅迫下，煙草整株鉀含量的分布由地下部向地上部傾斜的趨勢在W 和Y/W 嫁接組合中更為明顯。

圖1 嫁接組合和鉀供應水平對煙草植株鉀離子分布的影響

2.3 鉀脅迫下煙草下胚軸凈K+流速的響應

試驗數據表明，當外部環境中鉀水平發生變化時，煙草下胚軸橫截面K+凈流速的上下對比也發生了變化。試驗中，由于煙株在子葉下胚軸處被切成2段，這2 個部分橫截面的K+流速所代表的的意義不同。地上部橫截面通過韌皮部下行的K+流被定義為地上部到地下部的K+流，而地下部橫截面通過木質部上行的K+流被定義為地下部到地上部的K+流。由圖2 可知，在+K 條件下，煙株下胚軸橫截面地上部到地下部平均凈K+流速為1 782.72 pmol·cm-2·s-1，是地下部到地上部的1.59 倍。除此之外，各嫁接組合上、下凈K+流速無顯著差異。為了明確K+在不同鉀水平下長距離運輸中運動的相對方向，將向下的實時K+流速減去向上的實時K+流速定義為相對K+流量強度。各嫁接組合的相對K+流量強度在+K 條件下的整個測量周期內均為負值，說明在K 供應充足時，烤煙植株的K+有從地上部向地下部遷移的趨勢。在-K 條件下，各嫁接組合由地下部到地上部的凈K+流速在整個測量周期內是穩定的且差異不顯著，但是地上部到地下部的凈K+流速卻出現了明顯的波動狀況。以W 基因型烤煙為砧木的處理凈K+流速在試驗開始后迅速下降，5 min 后逐漸穩定；而以Y 基因型烤煙為砧木的處理凈K+流速下降16 min 后才趨于穩定。下胚軸橫切面處煙株地上部到地下部的平均凈K+流速為373.45 pmol·cm-2·s-1，是地下部到地上部的52.3%。同時，以W 基因型烤煙為砧木的處理地上部到地下部的平均凈K+流速顯著低于以Y 為砧木的處理。與+K 條件下相反，在-K處理的整個測量周期內，各嫁接組合的相對K+流量強度均為正，說明在鉀供應不足時，煙草植株的K+有從地下部向地上部遷移的趨勢。

圖2 嫁接對煙草下胚軸凈K+流速的影響

2.4 鉀脅迫對烤煙根系K+獲取模式的影響

通過對烤煙根系凈K+流速的數據分析，結果發現W、Y2 個烤煙品種對環境低鉀脅迫的耐受策略存在顯著差異。在正常供鉀條件下，W 品種根分生區平均凈K+流入速率為549.05 pmol·cm-2·s-1，為Y品種的1.13 倍。當2 個烤煙品種都使用CsCl 進行預處理之后，其平均凈K+流入速率與原來相比顯著下降，W 品種降低了52.6%，Y 品種降低了37.5%，而且降低后的W 品種平均凈K+流入速率顯著低于Y 品種。當預處理劑使用原釩酸鹽時，2 個烤煙品種根分生區K+凈流入量的變化均不顯著（圖3）。在鉀脅迫條件下，所有處理的平均凈K+流入速率明顯降低，而W 品種根分生區平均凈K+流入速率仍然顯著高于Y 品種。使用預處理劑后，供試品種的表現與正常供鉀條件下不同。CsCl 顯著降低了W 品種根分生區平均凈K+流入速率，而對Y 品種沒有顯著影響；原釩酸鹽則同時降低了2 個品種的烤煙根分生區平均凈K+流入速率，其中Y 品種下降幅度較大，比W 品種下降幅度多15.4%。

圖3 不同鉀水平條件下烤煙根系分生區的凈K+流速

2.5 不同處理K+吸收相關基因的表達水平

qRT-PCR 結果表明，鉀虧缺顯著改變了煙草植株HAK1、NKT1、SKOR和AKT2 的轉錄水平。如表3 所示，各處理HAK1 的表達均無明顯變化。在鉀脅迫條件時，SKOR和AKT2 表達上調，而NKT1 則下調表達。對于不同的嫁接組合，在正常鉀供應水平下，以W 為砧木的處理所有相關基因的表達水平顯著高于以Y 為砧木的處理。在鉀饑餓條件下，筆者觀察到類似的情況。然而，在W/Y 處理中，SKOR和AKT2 的表達水平顯著高于Y 處理，且不低于W 和Y/W 嫁接處理。這種現象在W/Y 處理的HAK1 和NKT1 中沒有出現。

表3 在2 種鉀供應條件下，煙草中與鉀吸收和轉運相關的基因相對表達水平

3 討論與結論

3.1 嫁接改善了鉀脅迫條件下烤煙植株的長勢

近年來，嫁接技術已成功用于多種作物應對環境壓力和改善礦質養分的吸收，其中包括番茄[25]、西瓜[26]、棉花[15]和黃瓜[27]。然而，嫁接對煙草K 脅迫的緩解作用及其機制尚不清楚。本研究表明，在鉀脅迫下，煙草植株生長明顯減弱，但鉀利用效率較高的砧木嫁接可以緩解這一壓力。與W/Y 和Y 嫁接組合相比，W 和Y/W 只略微降低了植株的干質量，株高、莖圍、根長和葉面積的變化趨勢相似。無論鉀水平如何，W 基因型煙草的全株干質量、株高、莖圍、根長、葉面積均顯著高于Y 基因型。通過嫁接，以W 為砧木的Y 基因型煙草的生長指數接近了W 基因型煙草的水平，顯著高于未嫁接的原品種。此外，W 作為接穗對砧木的反饋調節，也提高了W/Y 嫁接組合烤煙的長勢表現。在嫁接過程中，這種反饋調控機制通常由長距離信號主導，miRNA 或激素信號均可能作為信號物質發揮作用[28-30]。

3.2 鉀饑餓改變了烤煙植株中K+的分布趨勢

同一作物的不同基因型在養分吸收和轉化方面差異很大。嫁接可以有效利用這一特性，將營養效率高的砧木與目標接穗結合，提高作物品質和產量[31-33]。在煙草方面的研究中，有許多嫁接對多種養分物質吸收產生影響的例子[34,35]。在筆者的研究中，W 基因型烤煙不僅在整株鉀含量上優于Y，而且當W 作為砧木時，相對應的嫁接組合鉀含量也得到了提高。同時，無論是正常供鉀還是缺鉀條件下，W 基因型煙草砧木植株的鉀含量均顯著高于Y 基因型。從植株生長結果來看，與未嫁接的原品種相比，嫁接提高了Y 基因型烤煙全株鉀含量。當環境中鉀水平降低時，K+在煙草植株中的分布發生了變化。一般情況下，烤煙植株地下部的鉀含量通常高于地上部。然而，在缺鉀條件下，植株的K+保留在地上部中，而不是將其運輸到地下部，這是煙草植株耐受鉀脅迫的機制之一。此外，這種趨勢在W 和Y/W 嫁接組合中表現得更為明顯。當植物幼苗對養分的需求增加時，通過韌皮部到達根系的養分濃度降低，作為反饋信號，根系對養分離子的吸收率提高。同樣，當植株對營養物質的需求減少時，韌皮部循環的養分離子濃度增加，抑制了根對相應離子的吸收[36-37]。

3.3 烤煙植株下胚軸和根分生組織橫截面的凈K+流速分析

K+自根表面橫向運輸到薄壁組織，通過木質部裝載由地下部運輸向地上部，又由韌皮部向下循環到根部[38]。K+在韌皮部和木質部的轉運受植物各組織中鉀水平的調節[39]。試驗數據表明，在+K 處理下，經韌皮部向地下部輸送的K+流量大于經木質部向地上部部輸送的K+流量，在-K 處理下，情況正好相反。這一現象印證了上述關于K+在不同鉀水平下在植株體內分布規律的結論。在鉀脅迫條件下，當砧木相同，接穗不同時，由地上部向下的凈K+流速下降到穩定狀態所需的時間相同。當砧木不同，接穗相同時，由地上部向下的凈K+流速下降到穩定狀態所需的時間不一致（以W 為砧木的處理5 min 就能穩定，而以Y 為砧木的處理需要16 min）。這表明煙草植株在外部環境中鉀濃度變化的感覺機制以砧木為主，而非接穗。這種感覺機制主要來自細胞膜電位的變化，細胞膜電位異常敏感，通常在外界環境鉀水平下降幾分鐘內就能觀察到[40-41]。研究表明，產生上述電勢變化的主要受體有2 種，包括Shaker 家族的K+通道基因(由AKT1介導)和H+-PPase[7]。此外，以W基因型烤煙為砧木的處理凈K+流速下降到穩定水平所需的時間小于以Y 為砧木的處理。這表明W基因型烤煙在鉀脅迫下可以更快地改變植物體內鉀的分布格局，并通過減少向下的鉀循環來維持地上部相對較高的鉀水平。本研究結果還表明，W 基因型煙草對鉀脅迫的快速反應能力能夠通過嫁接傳遞給Y 基因型煙草，使其對鉀脅迫耐受性更強。

高親和轉運系統（HATS）和低親和轉運系統（LATS）是植物由根系自土壤界面吸收K+的2 種途徑[42]。分析不同鉀水平條件下HATS 和LATS 在根系K+吸收過程中分別扮演的角色，對于理解不同基因型烤煙在應對低鉀脅迫方面的措施有著重要的意義。試驗數據表明，在不添加抑制劑的情況下，W 基因型煙草根分生組織對K+的吸收速率明顯高于Y基因型煙草。筆者發現，使用特異性抑制劑后，正常鉀水平下2 種煙草砧木K+吸收的主導模式都是依賴于K+通道的LATS。而在鉀脅迫下，2 種砧木對K+吸收所依賴的模式則產生了差異。W 品種烤煙根系中依賴于鉀轉運蛋白的HATS 轉運量較大，但與LATS 的差異不顯著，說明在鉀脅迫時2 種K+吸收體系的地位同等重要；而Y 品種烤煙根系K+吸收模式主要為HATS 和LATS 受到抑制。根系細胞膜電位的變化可以作為植物對缺鉀的響應信號，當外源鉀水平較低時，質膜超極化激活K+通道；相反，當外源鉀水平較高時，質膜去極化。本研究結果表明，W基因型烤煙根系中K+通道蛋白和轉運體在應對鉀脅迫方面發揮著同樣重要的作用，而Y 基因型中只有鉀轉運體起主導作用。這是2 個烤煙品種K+吸收效率差異的重要原因，同時也是利用嫁接技術提高烤煙K+吸收效率的理論基礎，在耐鹽南瓜砧木中也發現了類似的結果[43]。

3.4 烤煙鉀轉運途徑相關基因表達分析

K+通道家族[5]、高親和轉運蛋白家族[44]、共轉運蛋白家族[45]、反向轉運蛋白家族、質子泵供能基因[46]共同參與調控了烤煙K+的攝取和轉運過程。HAK1在低鉀環境中調控K+的跨膜吸收，是高親和力K+轉運蛋白家族的成員[47-48]。NKT1是煙草細胞內表達的Shaker-like 家族4 種K+通道基因中，介導K+吸收的內向整流K+通道基因[49]。SKOR負責K+向木質部的轉運，而AKT2參與K+從合成位點的裝載和從貯藏組織的卸載[49]。本研究中，鉀供應水平和嫁接處理均影響相關基因的表達。外界鉀濃度的變化并沒有改變煙草根系中HAK1的表達水平，說明低鉀環境并不是誘導HAK1表達的因素。當防御基因表達所消耗的能量不能超過它所帶來的積極影響時，植物往往會選擇下調這些基因的表達水平[50-51]。NKT1在鉀脅迫下的下調表達正好與烤煙根分生組織中凈K+流速的研究結果相對應，即在環境中鉀水平較低時，K+通道在鉀跨膜吸收過程中所起的作用相對下降。鉀脅迫下SKOR和AKT2的上調表達表明，煙草通過提高K+在植物地上部與地下部之間的循環效率，降低了鉀缺乏對植物生長的抑制作用。值得注意的是，這種調控可以通過信號物質在砧木和接穗之間傳遞，還需要進一步的研究。

總之，采用烤煙品種五峰2 號砧木嫁接可以提高云煙87 對鉀的吸收、轉運效率和煙株長勢。原因可以歸于根系較高的K+吸收能力和地上部較高的循環轉運效率，從而使烤煙對鉀水平變化的感受信號更為敏感，同時K+在木質部和韌皮部運輸能力得到了提升，使煙株在面對鉀脅迫時具有更好的耐受性。本研究中出現的接穗與砧木之間反饋調節現象表明，不同基因型烤煙嫁接過程伴隨著信號物質的傳遞。