白靈菇菌糠栽培基質(zhì)對杏鮑菇菌絲生長的影響

張熙凱，陳興喆，霍心平，武雪嬌，秦中杰，李奕葶

(1.天津農(nóng)學(xué)院農(nóng)學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院，天津 300384；2.天津市科學(xué)技術(shù)信息研究所，天津 300074)

食用菌菌糠是指在食用菌的生長過程中產(chǎn)生的廢棄物，含有大量未分解完全的蛋白質(zhì)、纖維素、半纖維素、木質(zhì)素等營養(yǎng)成分，可以作為一種優(yōu)質(zhì)的飼料和肥料。目前我國食用菌產(chǎn)量占據(jù)全球產(chǎn)量的70%以上，位居首位，因此每年我國生產(chǎn)食用菌的企業(yè)在生產(chǎn)過程中將會產(chǎn)生大量菌糠[1]。由于缺乏有效的處理和利用方法，我國大多數(shù)食用菌生產(chǎn)企業(yè)通常將菌糠堆放在露天場地或者焚燒處理，環(huán)境污染和資源浪費(fèi)等問題的日趨嚴(yán)重。隨著我國環(huán)境保護(hù)和資源可持續(xù)利用意識的增強(qiáng)，食用菌菌糠的合理處理和充分利用已成為當(dāng)前食用菌行業(yè)研究的熱點(diǎn)問題。

杏鮑菇是一種品質(zhì)優(yōu)良的大型肉質(zhì)傘菌，主要分布于南歐、北非，以及中亞地區(qū)的高山、草原和沙漠地帶；我國杏鮑菇主要分布于新疆和青海等地[2]。杏鮑菇的肉質(zhì)細(xì)嫩，口感鮮美，營養(yǎng)豐富，含有多種氨基酸、維生素和礦物質(zhì)，能夠增強(qiáng)人體免疫力，能夠預(yù)防感冒和其他疾病；杏鮑菇中含有的多糖及多酚類物質(zhì)還具有抗腫瘤作用，能夠抑制腫瘤細(xì)胞的生長和擴(kuò)散[3]。隨著杏鮑菇在市場上的需求量與日俱增，杏鮑菇栽培方式的優(yōu)化也愈發(fā)重要。

根據(jù)白靈菇菌糠添加量的不同, 本研究設(shè)計(jì)了5種配方，通過測定杏鮑菇菌絲的萌發(fā)時間、生長速度、滿瓶時間、木聚糖酶與漆酶的活力等指標(biāo)，綜合評價白靈菇菌糠對杏鮑菇菌絲生長的影響。本研究不僅可以為白靈菇菌糠作為杏鮑菇栽培基質(zhì)的可行性提供數(shù)據(jù)支持，同時也為白靈菇菌糠的資源化利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

菌種：杏鮑菇（閩中）由天津農(nóng)學(xué)院食用菌研究中心提供。菌糠：白靈菇菌糠由天津農(nóng)學(xué)院食用菌研究中心提供。原材料：棉籽殼、麥麩、石灰粉、蔗糖、碳酸鈣、雜木屑均由市場采購。原材料碳氮比見表1。

表1 原材料碳氮比

1.2 栽培基質(zhì)配方設(shè)計(jì)

表2 展示了白靈菇菌糠栽培基質(zhì)的添加配比，這些比例可以使菌糠的最終添加比例達(dá)到10%、20%、30%、40%和50%。本研究采用瓶式栽培方法，每個配方制作3 個瓶子，每個瓶子總量約為70 g，含水量約為60%。

表2 白靈菇菌糠栽培基質(zhì)添加配比（質(zhì)量比）%

1.3 菌糠前處理

挑出菌糠中殘留的白靈菇根以及發(fā)霉變質(zhì)的部分，并將菌糠鋪平晾曬至含水量保持不變，為6%。

1.4 培養(yǎng)料配制及菌絲培養(yǎng)

根據(jù)表2 稱取相應(yīng)質(zhì)量的各種培養(yǎng)料，以質(zhì)量比1∶1.1 加水?dāng)嚢瑁㈦S時測定含水量以及pH 值，控制含水量在60%，pH 值為8。裝瓶時，注意下緊上松，虛實(shí)均勻，封口后放入高溫高壓滅菌鍋中滅菌121 ℃2 h，待溫度冷卻后取出，放入超凈臺中，用紫外燈照射20 min。接種時，保持接種量一致，并做好分組標(biāo)記。接種后，將培養(yǎng)瓶放入恒溫培養(yǎng)箱中25 ℃發(fā)菌，培養(yǎng)瓶按組別擺放，以便統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。

1.5 菌絲生長速度測定及形態(tài)觀察

菌絲生長速度采用菌瓶瓶壁劃線測量法，在菌絲長至齊肩時開始劃線，7 d 后再進(jìn)行劃線，測量各配方菌瓶7 d 菌絲生長長度，計(jì)算菌絲平均生長速度，觀察菌絲長勢，記錄菌絲滿瓶時間等。

1.6 酶活力測定

1.6.1 粗酶液的制備 待瓶中菌絲長滿后，將菌絲與菌糠混合物從培養(yǎng)瓶中取出，攪拌均勻后做好標(biāo)號。用分析天平稱取標(biāo)好號的被測樣品10 g，放入100 mL 離心管中，每個離心管加50 mL 蒸餾水，在30 ℃恒溫水浴鍋內(nèi)浸提2 h，浸提完成后，5 000 r·min-1離心20 min，得到的上清液即為粗酶液，用于酶活力的測定。

1.6.2 漆酶酶活性測定 依次將0.15 mL 50 mmol·L-1的乙酸-乙酸鈉緩沖液（pH 值為4.2）、50 μL 酶液、0.1 mL 1 m mol·L-1的ABTS 加入96 孔板中。使用酶標(biāo)儀測定420 nm 下5 min 內(nèi)的吸光值變化。酶活力定義為每分鐘氧化1 μmol ABTS 所需的酶量為1 個酶單位（U）[4-5]。

式中，N為酶液稀釋倍數(shù)；V總為漆酶酶活測定反應(yīng)體體系的終體積；V酶為反應(yīng)添加的酶液體積；ΔOD420為t 時間內(nèi)反應(yīng)液在420 nm 處吸光度的增加值；3.6×104為420 nm 處ABTS 氧化態(tài)的摩爾吸光系數(shù)(L·moL-1·cm-1)；T 為反應(yīng)時間（min）。

1.6.3 木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 準(zhǔn)備1 mg·mL-1的木糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，加入檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液（pH 值為5.0，濃度為50mmol·L-1）定容至體積為2.0mL，配置成一系列不同濃度的木糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。然后，加入3mLDNS溶液，煮沸10min 后冷卻，定容至25 mL，用分光光度計(jì)測定540nm 下的吸收值。以木糖含量為橫坐標(biāo)，OD540為縱坐標(biāo)，繪制木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線[6-7]。

1.6.4 木聚酶酶活性測定 將1.5 mL 1%（w/v）櫸木木聚糖溶液和0.5 mL 酶液加入試管中，置于40 ℃水浴中反應(yīng)30 min。隨后，加入3 mL DNS 終止反應(yīng)液，煮沸10 min。最后，將溶液定容至25 mL，充分混合后使用移液槍吸取200 μL 溶液轉(zhuǎn)移到酶標(biāo)板中，通過酶標(biāo)儀測定OD540吸光度值，以測量酶活性。空白對照（CK）：在待測稀釋酶液中加入DNS 使酶失活，然后加底物，其他處理與樣品一樣[8]。

木聚糖酶活力單位定義：在上述反應(yīng)條件下，每分鐘催化底物水解生成1 μmol 木糖所需要的酶量為一個酶活力單位U。

式中，W為酶解反應(yīng)生成的木糖的質(zhì)量；N為表示稀釋倍數(shù)；150.13 為木糖的分子量；30 為酶與底物反應(yīng)時間；1 000 為轉(zhuǎn)換系數(shù)[6,9]。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

使用Microsoft Excel 2019 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，試驗(yàn)重復(fù)3 次以上。統(tǒng)計(jì)分析采用雙尾T-檢驗(yàn)，當(dāng)顯著性差異為P<0.1（*）、P<0.05（**）、P<0.01（***）時，結(jié)果具有顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 白靈菇菌糠添加比例對菌絲生長速率的影響

在白靈菇菌糠添加比例不同的條件下，杏鮑菇菌絲的生長速率不同。如圖2 所示，未添加菌糠時，杏鮑菇菌絲的生長速度為0.62 cm·d-1。隨著菌糠添加比例逐漸增加，菌絲生長速度也隨之加快。配方1與配方2 菌絲生長速度與CK 相差不大，分別為0.60、0.61 cm·d-1。當(dāng)菌糠添加量為50%時（配方5），菌絲生長速度最快，為0.74 cm·d-1。原因可能是菌糠的添加比例影響了栽培基質(zhì)營養(yǎng)成分的含量和比例，從而影響了菌絲的生長速度。

圖1 白靈菇菌糠對杏鮑菇菌絲生長速度的影響

圖2 不同時間杏鮑菇菌絲生長狀態(tài)

2.2 白靈菇菌糠添加比例對菌絲長勢及外觀性狀的影響

如表3 與圖2 所示，各配方的杏鮑菇均在接種后1 d 內(nèi)萌發(fā)，杏鮑菇菌絲在白靈菇菌糠添加比例不同的條件下，其菌絲長勢以及外觀性狀也不相同。試驗(yàn)結(jié)果表明：CK 的菌絲長勢比配方1 長勢好；配方2 菌絲長勢和CK 相似，但外觀性狀和CK 及配方1 相差不大；配方3 與配方4 的菌絲長勢較CK好，菌絲分布也較為濃密；配方5 即白靈菇菌糠添加量為50%時，杏鮑菇菌絲長勢最好，分布也更加濃密，滿瓶時間最早，為15 d。原因可能是原栽培料中難以利用的木質(zhì)素、纖維素、半纖維素等大分子物質(zhì)，被菌絲分泌的胞外酶大量降解為易于吸收的小分子物質(zhì)，因此菌糠更容易被杏鮑菇菌絲利用。李晶等[10]試驗(yàn)表明，在利用玉米漿發(fā)酵液這一材料代替后，杏鮑菇菌絲長勢、生長速度，以及生物量等都有所提高。

表3 杏鮑菇菌絲長勢及外觀性性狀

2.3 白靈菇菌糠添加比例對漆酶活性的影響

如圖3 所示，未添加菌糠時，CK 組的漆酶酶活為161.52 U·L-1。配方1～5 的杏鮑菇菌絲漆酶活性分別是186.87、168.93、187.46、180.95、179.68 U·L-1。因此，在添加了白靈菇菌糠的試驗(yàn)組中，除配方2 外，其他配方杏鮑菇菌絲的漆酶酶活與CK 相比顯著增加，但不同菌糠添加比例對漆酶酶活量的影響不大。原因可能是白靈菇菌糠中含有較為豐富的銅離子，食用菌在生長過程中會富集大量的礦物質(zhì)元素，尤其是出菇后菌糠中礦物質(zhì)元素會顯著增加[11]。銅離子作為漆酶的輔助因子，可以有效提升漆酶的活力,穩(wěn)定漆酶蛋白的活性或抑制漆酶的降解[12]。

2.4 白靈菇菌糠添加比例對木聚糖酶活性的影響

由圖4 可知，杏鮑菇菌絲胞外木聚糖酶活性在未添加菌糠的條件下，酶活為14.04 U·g-1。隨著白靈菇菌糠添加量的增加，木聚糖酶活性逐漸降低，白靈菇菌糠添加量為10%時（配方1），酶活性最高，達(dá)到了13.06 U·g-1；在菌糠添加量為20%～50%（配方2～5）時，酶活性分別為10.78、10.38、6.53、4.14 U·g-1。木聚糖酶可以將半纖維素中的木聚糖分解成五碳糖、六碳糖，以及糖醛酸，為食用菌供給碳源[13]。原因可能是白靈菇菌糠中的半纖維素含量較低，在菌絲生長過程中，菌絲分泌的木聚糖酶可以降解白靈菇菌糠栽培基質(zhì)中的半纖維素，在菌絲滿瓶后其胞外酶中的木聚糖酶活性相較CK 降低。

圖4 白靈菇菌糠對杏鮑菇菌絲漆酶活性的影響

3 討論與結(jié)論

據(jù)中國食用菌協(xié)會統(tǒng)計(jì)，2021 年全國食用菌總產(chǎn)量達(dá)4 133.96 萬t，較2020 年增長1.79%[14]。每生產(chǎn)1 kg 食用菌會產(chǎn)生3.25～5.00 kg 的菌糠，每年約產(chǎn)生1 億t 以上的菌糠[15]。菌糠雖然是生產(chǎn)食用菌過程中的副產(chǎn)物，但大量研究表明，菌糠中含有大量未被分解的纖維素、木質(zhì)素、蛋白質(zhì)等成分。隨著我國對于環(huán)境保護(hù)的重視程度增加以及科技水平的提高，對于菌糠的處理有了更加優(yōu)良的方法，例如將菌糠運(yùn)用于食用菌基質(zhì)、動物飼料、生物肥料等方面[16-19]。

相關(guān)研究結(jié)果表明，利用白靈菇菌糠栽培平菇與雞腿菇是切實(shí)可行的。與CK 相較，當(dāng)白靈菇菌糠添加量為4%、8%且輔料為棉籽殼、玉米芯時，平菇菌絲的生長速度加快，為13.5、13.7mm·d-1；當(dāng)白靈菇菌糠添加量≤24%時，平菇生物學(xué)轉(zhuǎn)化率為82.6%以上[20]。當(dāng)白靈菇菌糠添加量為25%～55%且輔料為棉籽殼、麩皮時，雞腿菇菌絲生長速度與CK 相比明顯加快，滿袋時間縮短，且雞腿菇生物學(xué)轉(zhuǎn)化率與CK 基本一致[21]。另外，與其他菌糠相比，白靈菇菌糠對杏鮑菇菌絲生長的促進(jìn)作用較為明顯。利用榆黃蘑菌糠作為杏鮑菇菌絲的培養(yǎng)基質(zhì)時，當(dāng)菌糠添加量為42%且輔料為木屑、米糠、玉米粉時，杏鮑菇菌絲的生長速度為0.71 cm·d-1，與本研究相比，生長速度稍慢[22]。而利用香菇菌糠作為試驗(yàn)材料時，當(dāng)香菇菌糠添加量大于40%且輔料為玉米芯時，杏鮑菇菌絲生長速度均低于CK，為0.42cm·d-1[23]。基于本課題組既往研究項(xiàng)目，利用杏鮑菇菌糠栽培白靈菇，當(dāng)菌糠添加量達(dá)到30%時，生物學(xué)轉(zhuǎn)化率為83.82%（CK 為96.45%），且對白靈菇農(nóng)藝性狀影響不大，可以運(yùn)用于實(shí)際生產(chǎn)[24]。未使用菌糠時的原單位鮮菇收益約為5 元·kg-1，利用杏鮑菇菌糠作為培養(yǎng)料后，降低了生產(chǎn)成本，提高了單位鮮菇收益，約為9 元·kg-1。

綜上所述，白靈菇菌糠替代一定比例的棉籽殼，對杏鮑菇菌絲的生長速度、宏觀形態(tài)，以及胞外酶活性都造成了一定的影響，同時白靈菇菌糠添加比例在30%以上時，對杏鮑菇菌絲的生長具有促進(jìn)作用。在實(shí)際生產(chǎn)中，白靈菇菌糠替代傳統(tǒng)的栽培基質(zhì)，不僅可以降低生產(chǎn)成本，還可以延長菌糠的物質(zhì)循環(huán)鏈條，減少環(huán)境污染與資源浪費(fèi)。