桐花樹活性內生真菌篩選及其抗菌化學成分的研究

羅志宏, 依旺的, 邢楠楠, 劉永宏, 高程海, 夏辰曦, 陳顯強*

( 1. 廣西中醫藥大學 海洋藥物研究院, 南寧 530200; 2. 廣西中醫藥大學 廣西中醫藥科學實驗中心/廣西中醫基礎研究重點實驗室, 南寧 530200; 3. 廣西中醫藥大學 廣西海洋藥物重點實驗室, 南寧 530200 )

桐花樹(Aegicerascorniculatum)是紅樹林的重要組成之一,從中分離得到的甾醇、三萜、醌類、黃酮、有機酸等化合物具有抗炎鎮痛、抗腫瘤、抗菌、抗氧化、降血糖、抗瘧疾、止瀉、保肝、抗凝血等藥理活性(田曉萌等,2017;Bibi et al., 2019)。這些活性物質的提取需要砍伐大量的桐花樹,易破壞紅樹林生態系統。為了保護且合理利用桐花樹的藥用資源,桐花樹內生菌及其代謝產物研究在近年來受到了更多的關注。李菲等(2020)報道桐花樹內生細菌具有抗血栓作用,是發掘溶血栓活性物質的資源。目前活性代謝產物多來源于桐花樹內生真菌,主要包括生物堿、蒽醌、聚酮類、酚類等,它們在抗病毒、抗腫瘤等方面具有潛在的價值(Wang et al., 2014;Cadamuro et al., 2021)。從桐花樹內生真菌Pestalotiopsissp.中分離到的含有不飽和脂肪鏈的苯酚和苯甲醛類化合物(pestalols A-E)和甾醇化合物對甲型流感病毒亞型(H3N2)和甲型病毒(H1N1)有抑制作用,pestalol B和pestalol C還對多個腫瘤細胞有細胞毒活性(Sun et al., 2014)。內生真菌Fusariumincarnatum從桐花樹內果實分離得到,其代謝產物中的3個結構獨特生物堿對HUVEC、K-562和HeLa細胞系有較弱的抗增殖和細胞毒活性(Ding et al., 2012)。蒽醌二聚體衍生物alterporriols K-M從桐花樹內生真菌Alternariasp. ZJ9-6B分離得到,alterporriols K和L對腫瘤細胞有一定的細胞毒作用(Huang et al., 2011)。多個特特拉姆酸和聚酮類化合物從桐花樹內生真菌Penicilliumsp.中分離,有較好的抑制腫瘤細胞增殖作用(Lin et al., 2008a, b)。雖然桐花樹內生真菌有較高的藥用開發潛能,但關于其抗菌化學成分報道較少。

本研究以采自廣西茅尾海康熙嶺紅樹林自然保護區的桐花樹為材料,分離其中的內生真菌,以內生真菌發酵產物的抑菌活性為指標篩選活性菌株,通過抑菌活性導向分離活性菌株的次級代謝產物,采用微孔板法測定次級代謝產物的抗菌作用,擬探討桐花樹內生真菌代謝產物的抗菌藥用價值,為抗生素的開發拓展資源和提供物質基礎。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

乙腈為色譜純(上海星可高純溶劑有限公司),甲醇、乙酸乙酯、石油醚等化學試劑為分析純(廣東光華科技股份有限公司);DNA提取試劑盒 [DP305,天根生化科技(北京)有限公司];PCR試劑盒(2×EasyTaq PCR Super Mix,北京全式金生物技術股份有限公司);引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)/ITS4(5′- TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′) [生工生物工程(上海)股份有限公司合成];柱層析硅膠,薄層硅膠板(煙臺江友硅膠開發有限公司);抗菌活性指示菌:耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureusATCC 43300)、表皮葡萄球菌(StaphylococcusepidermidisATCC 12228)、銅綠假單胞菌(PseudomonaaeruginosaATCC 10145)、粘性放線菌(ActinomycesviscosusATCC 15987)、藤黃微球菌(MicrococcusluteusATCC 49732)、枯草芽孢桿菌(BacillussubtilisATCC 6051)、金黃色葡萄球菌(StaphylococcusaureusATCC 14222)、大腸桿菌(EscherichiacoliATCC 25922)、肺炎克雷伯菌(KlebsiellapneumoniaeATCC13883)和鮑曼不動桿菌(AcinetobacterbaumanniiATCC 19606)由廣西中醫藥大學海洋藥物研究院保藏;查氏培養基、虎紅(瓊脂)培養基、MB培養基用于桐花樹內生真菌分離;大米培養基(大米100 g、海鹽1.5 g、蒸餾水110 mL)用于內生真菌的擴大發酵;桐花樹葉于2020年9月采集于廣西欽州市茅尾海康熙嶺紅樹林自然保護區。

LC-2030C 3D Plus型高效液相色譜儀(日本島津公司);Avance III HD 500M超導核磁共振波譜儀(Bruker公司);EYELA N-1300D型旋轉蒸發儀(東京理化器械株式會社);C1000型 PCR儀(Bio-Rad公司);sepacore型中壓制備色譜儀(瑞士Buchi公司);SHZ-CB型循環水真空泵(鞏義市予華儀器有限公司);KQ-250DB型超聲儀(鞏義市予華儀器有限公司);電泳儀(北京六一生物科技有限公司);凝膠成像分析儀(VILBER LOURMAT公司);培養箱(上海精宏實驗設備有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 桐花樹內生真菌的分離與鑒定 參考Shan等(2012)的方法分離桐花樹內生真菌,新鮮樹葉用無菌水漂洗3次后,浸泡在70%乙醇中30 s,0.2%升汞處理20 min,無菌水反復漂洗5次,無菌濾紙吸干樹葉表面水分。用剪刀將樹葉剪成約0.5 cm的碎片,均勻地放置在MB培養基、查氏培養基和虎紅(瓊脂)培養基上,置于28 ℃恒溫箱中培養。待菌落長出后,挑取形態、色澤不同的菌落接種于新的培養基上,連續多次純化,直至得到單一菌落。純菌株保藏在4 ℃下,備用。

取少量新鮮菌體,根據試劑盒的操作說明提取真菌基因組DNA,以獲得的DNA為模板,采用真菌核糖體轉錄間隔區通用引物ITS1和ITS4進行PCR擴增。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物,擴增成功后送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。測序結果提交到GenBank數據庫應用BLAST比對序列相似性,下載同源性較高的序列。運用MEGA X 軟件的Neighbor-Joining法構建系統發育樹,按照p-distance方法計算進化距離,可靠性設置1 000次bootstrap計算得出。

1.2.2 桐花樹內生真菌發酵產物的制備 內生真菌菌株接種至MB液體培養基,28 ℃、180 r·min-1條件下培養3～5 d,即獲得種子液。將種子液接種到裝有大米固體培養基的1 000 mL錐形瓶中,共2瓶。在28 ℃下靜置培養30 d。乙酸乙酯超聲提取3次,合并提取液,減壓回收溶劑,得到菌株發酵產物。

1.2.3 桐花樹內生真菌發酵產物的抑菌活性測試 采用濾紙片瓊脂擴散法篩選桐花樹內生真菌發酵產物的抑菌活性。發酵產物溶解在DMSO中,初始濃度為50 mg·mL-1。陽性對照氨芐青霉素鈉和環丙沙星溶解在DMSO,初始濃度為0.1 mg·mL-1。DMSO作為陰性對照。吸取3 μL待測樣品到直徑為6 mm的無菌濾紙片上,載樣濾紙片貼于有指示菌的LB平板上,37 ℃培養16 h。采用十字交叉法記錄抑菌圈的直徑。通過抑菌圈直徑大小評價發酵產物活性,從而篩選出能夠產生抗菌物質的活性菌株。

1.2.4 菌株Phomopsissp. GXIMD02029擴大發酵和代謝產物的分離Phomopsissp. GXIMD02029的發酵方法同1.2.2項下,發酵數量擴大至100瓶。用乙酸乙酯浸提發酵產物5次,減壓濃縮,得到浸膏95 g。浸膏經正相硅膠(200～300目)柱層析,二氯甲烷-甲醇(100∶0～ 0∶100,V/V)梯度洗脫,根據薄層色譜分析結果合并,得到4個組分(Fr. 1～Fr. 4)。Fr. 2運用反相色譜柱分離,甲醇-水(30∶70 ～ 70∶30,V/V)梯度洗脫得到Fr.2.1～2.4組分。Fr. 2.1經過兩次硅膠柱層析分離得到化合物5(40.0 mg)。Fr. 2.2經反相色譜柱(甲醇-水30∶70 ～ 70∶30,V/V)梯度分離,再運用HPLC制備(乙腈-水25∶75,V/V)得到化合物7(184.4 mg)。Fr. 2.3經凝膠柱脫色后,再經HPLC制備(乙腈-水55∶45,V/V)得到化合物1(7.6 mg)。Fr. 2.4經反相色譜柱分離,甲醇-水(80∶20,V/V)等度洗脫得到組分Fr. 2.4A和 Fr. 2.4B。Fr. 2.4A經凝膠柱分離和HPLC制備(乙腈-水60∶40,V/V)得到化合物3(11.3 mg)和化合物2(293.5 mg);Fr. 2.4B經HPLC制備(乙腈-水70∶30,V/V)得到化合物4(13.6 mg)。Fr.3經凝膠柱純化,再經HPLC制備(乙腈-水70∶30,V/V)得到化合物6(67.7 mg)。

1.2.5 單體化合物的最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration,MIC)測定 單體化合物溶解在DMSO中,初始濃度為10 mg·mL-1的溶液。陽性對照為氨芐青霉素鈉和環丙沙星配成1 mg·mL-1的DMSO溶液。指示菌接種于LB培養基,37 ℃下振蕩培養至對數期,調節菌懸液106CFU·mL-1。96孔板的第1列加入190 μL LB液體培養基和10 μL樣品,第2至第9列每孔加入100 μL LB液體培養基。第1列混合均勻后,取100 μL培養液到第2列,倍比稀釋至第8列。第1至第8列每孔加入100 μL菌液,第9列不加菌液作為陰性對照,第10列每孔加入100 μL LB培養液和100 μL菌液作空白對照。單體化合物的終濃度依次為250、125、62.5、31.25、15.625、7.812 5、3.906 25、1.953 125 μg·mL-1,每個濃度設3復孔,實驗重復3次。37 ℃恒溫培養24 h,觀察實驗結果,若孔內澄清,說明小孔內細菌生長被抑制,對應澄清孔的最小濃度值為化合物的MIC值。

2 結果與分析

2.1 菌株鑒定結果

根據菌落形態、顏色特征排重后,選取16株內生真菌基因組DNA進行PCR擴增,獲得500～600 bp的單一片段堿基對。基于BLAST比對擴增產物序列的結果見表1。由表1可知,16株內生真菌分屬2綱7目10科10屬,鐮刀屬(Fusarium)為優勢菌屬,占鑒定菌株的25%。選取同源性較高的相似菌株序列以Neighbor-Joining法聚類構建系統發育樹(圖 1),16株內生真菌均與相似菌株構成了末端聚類且支持率大于50%。

表 1 桐花樹內生真菌ITS序列在GenBank數據庫比對結果Table 1 Matching results in GenBank database of ITS sequence of endophytic fungi derived from Aegiceras corniculatum

2.2 活性菌株篩選結果

菌株發酵產物抑菌結果見表2,菌株GXIMD02029和GXIMD02039的發酵產物對枯草芽孢桿菌、表皮葡萄球菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌、粘性放線菌和金黃色葡萄球菌有不同程度的抑制作用;菌株GXIMD02038的發酵產物對藤黃微球菌、粘性放線菌和金黃色葡萄球菌有一定的抑制作用;其他菌株發酵產物未顯示抑菌活性。所有菌株發酵產物對銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌和大腸桿菌均未顯示抑制作用。

圖 1 基于Neighbor-Joining法構建內生真菌的ITS-rDNA序列系統發育樹Fig. 1 Phylogenetic tree of ITS-rDNA sequences of endophytic fungi by Neighbor-Joining method

2.3 Phomopsis sp. GXIMD02029代謝產物的分離與結構鑒定

運用硅膠柱色譜、反相柱色譜、凝膠柱色譜和高效液相制備色譜技術從桐花樹內生真菌Phomopsissp. GXIMD02029發酵產物中分離到7個化合物,分別鑒定為 (15R)-acetoxydothiorelone A (1)、cytosporone B(2)、pestalotiopsone H(3)、pestalotiopsone B(4)、對羥基苯甲醛(5)、對羥基苯甲酸(6)、N-(2-苯乙基)乙酰胺(7),化合物結構見圖2。

化合物1白色粉末。1H NMR (500 MHz, CD3OD)δH: 6.20 (1H, d,J= 2.2 Hz, H-4),6.27 (1H, d,J= 2.2 Hz, H-6),3.58 (2H, s, H-2),2.91 (2H, t,J= 7.5 Hz, H-10),4.11 (2H, q,J= 7.0 Hz, H-17),2.01 (3H, s, H-20),1.28～1.68 (8H, m, H-11-H-15),1.20 (3H, d,J= 6.5 Hz, H-16),1.25 (3H, t,J= 7.0 Hz, H-18);13C NMR (125 MHz, CD3OD)δC: 173.6 (C-1),40.5 (C-2),137.0 (C-3),111.7 (C-4),161.3 (C-5),102.7 (C-6),159.8 (C-7),121.2 (C-8),208.8 (C-9),45.0 (C-10),25.4 (C-11),30.2 (C-12),26.3 (C-13),36.8 (C-14),72.4 (C-15),20.2 (C-16),61.8 (C-17),14.5 (C-18),172.7 (C-19),21.2 (C-20)。上述數據與文獻(Luo et al., 2018)數據基本一致,故化合物1被鑒定為(15R)-acetoxydothiorelone A。

圖 2 從Phomopsis sp. GXIMD02029中鑒定的化合物結構Fig. 2 Chemical structure of compounds identified from Phomopsis sp. GXIMD02029

表 2 菌株發酵產物的抑菌活性Table 2 Antibacterial activities of ferment extracts of the strains

化合物2淡黃色粉末。1H NMR (500 MHz, CD3OD)δH: 6.25 (1H, d,J= 2.5 Hz, H-4),6.18 (2H, d,J= 2.5 Hz, H-6),4.09 (2H, q,J= 7.5 Hz, H-17),3.56 (2H, s, H-2),2.89 (2H, t,J= 7.5 Hz, H-10),1.60 (2H, m, H-11),1.26～1.34 (8H, m, H-12-H-15),1.22 (3H, t,J= 7.5 Hz, H-18),0.88 (3H, t,J= 7.5 Hz, H-16 );13C NMR (125 MHz, CD3OD)δC: 173.5 (C-1),40.5 (C-2),137.0 (C-3),102.7 (C-4),161.3 (C-5),111.7 (C-6),159.8 (C-7),121.2 (C-8),209.0 (C-9),45.2 (C-10),25.5 (C-11),30.4 (C-12),30.2 (C-13),32.9 (C-14),23.6 (C-15),14.4 (C-16),61.8 (C-17),14.5 (C-18)。上述數據與文獻(Brady et al., 2000)數據基本一致,故化合物2被鑒定為cytosporone B。

化合物3白色粉末。1H NMR (500 MHz, CD3OD)δH: 6.76 (1H, d,J= 2.4 Hz, H-6),6.67 (1H, d,J= 2.4 Hz, H-4),5.99 (1H, s, H-10),4.12 (2H, q,J= 7.2 Hz, H-17),4.06 (2H, s, H-2),2.60 (2H, t,J= 7.6 Hz, H-12),1.72 (2H, m, H-13),1.37 (4H, m, H-14, H-15),1.23 (3H, t,J= 7.2 Hz, H-18),0.92 (3H, t,J= 7.0 Hz, H-16);13C NMR (125 MHz, CD3OD)δC: 173.5 (C-1),42.0 (C-2),138.8 (C-3),119.6 (C-4),163.4 (C-5),102.9 (C-6),161.3 (C-7),115.7 (C-8),181.4 (C-9),110.4 (C-10),170.5 (C-11),34.5 (C-12),27.6 (C-13),32.3 (C-14),23.4 (C-15),14.3 (C-16),61.7 (C-17),14.5 (C-18)。上述數據與文獻(Luo et al., 2018)數據基本一致,故化合物3被鑒定為pestalotiopsone H。

化合物4淡黃色粉末。1H NMR (500 MHz, CD3OD)δH: 6.77 (1H, d,J= 2.3 Hz, H-8),6.68 (1H, d,J= 2.3 Hz, H-6),6.00 (1H, s, H-10),4.13 (2H, q,J= 7.5 Hz, H-19),4.07 (2H, s, H-2),2.61 (2H, t,J= 7.5 Hz, H-12),1.72 (2H, m, H-13),1.26～1.43 (8H, m, H-14-H-17),1.21 (3H, t,J= 7.5 Hz, H-20),0.90 (3H, t,J= 7.0 Hz, H-18);13C NMR (125 MHz, CD3OD)δC: 173.4 (C-1),42.1 (C-2),138.7 (C-3),119.5 (C-4),163.3 (C-5),102.9 (C-6),161.2 (C-7),115.7 (C-8),181.4 (C-9),110.4 (C-10),170.5 (C-11),34.5 (C-12),27.9 (C-13),30.1 (C-14),30.0 (C-15),32.8 (C-16),23.7 (C-17),14.50 (C-18),61.7 (C-19),14.40 (C-20)。上述數據與文獻(Beekman et al., 2013)數據基本一致,故化合物4被鑒定為pestalotiopsone B。

化合物5白色粉末。1H NMR (500 MHz, CD3OD)δH: 9.74 (1H, s, CHO),7.75 (2H, d,J= 8.4 Hz, H-2, H-6),6.90 (2H, d,J= 8.4 Hz, H-3, H-5);13C NMR (125 MHz, CD3OD)δC: 130.2 (C-1), 133.4 (C-2, C-6),116.8 (C-3, C-5),165.1 (C-4),192.8 (CHO)。上述數據與文獻(Shataer et al., 2020)數據基本一致,故化合物5被鑒定為對羥基苯甲醛(p-hydroxybenzaldehyde)。

化合物6淡黃色粉末。1H NMR (500 MHz, CD3OD)δH: 7.86 (2H, d,J= 8.7 Hz, H-2, H-6),6.81 (2H, d,J= 8.7 Hz, H-3, H-5);13C NMR (125 MHz, CD3OD)δC: 122.7 (C-1),133.0 (C-2, C-6),116.0 (C-3, C-5),163.4 (C-4),170.2 (COOH)。上述數據與文獻數據(Shataer et al., 2020)基本一致,故化合物6被鑒定為對羥基苯甲酸(p-hydroxybenzoic acid)。

化合物7白色粉末。1H NMR (500 MHz, CDCl3)δH: 7.16～7.30 (5H, m, H-2-H-6),3.49 (2H, t,J= 7.0 Hz, H-8),2.80 (2H, t,J= 7.0 Hz, H-7),1.92 (3H, s, H-10);13C NMR (125 MHz, CDCl3)δC: 138.9 (C-1),128.6 (C-2, C-6),128.7 (C-3, C-5),126.5 (C-4),35.6 (C-7),40.6 (C-8),170.1 (C-9),23. 2 (C-10)。上述數據與文獻(Vaca et al., 2020)數據基本一致,故化合物7被鑒定為N-(2-苯乙基)乙酰胺 [N-(2-phenylethyl)acetamide]。

2.4 單體化合物抑菌結果

采用濾紙片瓊脂擴散法初步篩選抗菌活性單體化合物,化合物1和化合物2在每片30 μg給藥量時對枯草芽孢桿菌、表皮葡萄球菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌、粘性放線菌、金黃色葡萄球菌有抑制活性,因此,測定其MIC值,具體測定結果見表3。化合物1對6株病原菌的MIC值在7.812 5～31.25 μg·mL-1之間,對測試菌株有一定的抑制活性。化合物2的MIC值為62.5～250 μg·mL-1,有較弱的抑菌活性。

3 討論與結論

16株內生真菌從桐花樹葉中分離得到,隸屬2綱7目10科10屬,這些科屬類別與前人報道的桐花樹內生真菌科屬基本一致。Li等(2016)報道桐花樹枝內生真菌比葉內生真菌豐富,葉點霉屬(Phyllosticta)和小光殼屬(Leptosphaerulina)為葉片內生真菌的優勢屬。Gong等(2014)報道刺盤孢屬(Colletotrichum)和擬盤多毛孢屬(Pestalotiopsis)是桐花樹枝的優勢內生真菌。鄧祖軍等(2010)報道桐花樹的葉脈、樹皮、 莖的優勢內生真菌在不同季節有差異。鐮刀屬(Fusarium)在本研究中是優勢菌屬,與前人的研究有所差異,這個差異的原因可能是采集的桐花樹部位以及采集季節的降水量、氣溫、濕度、光照強度等變化影響了內生真菌的類群。

表 3 化合物抑菌活性結果Table 3 Antibacterial activities of compounds

擬莖點霉屬(Phomopsis)真菌代謝產物在醫藥、農業等領域有重要的應用前景。該屬真菌能夠產生聚酮、萜類、大環內酯、生物堿等結構多樣性的次級代謝產物,具有細胞毒、抗菌、抗病毒、抗氧化、抗炎等多種生物活性(Xu et al., 2021)。Phomoxanthone A是從擬莖點霉屬分離的聚酮類化合物,是一個有望發展為抗耐藥性癌癥的藥物(Chen et al., 2022)。本研究以內生真菌次級發酵產物的抑菌活性為指標篩選出GXIMD02029、GXIMD02038和GXIMD02039為抗菌活性菌株,其中菌株Phomopsissp. GXIMD02029具有較好的抗菌活性,因此,本研究開展了GXIMD02029菌株的次級代謝產物研究。為了快速、高效地發掘菌株Phomopsissp. GXIMD02029中的抗菌活性成分,本研究以抗菌活性為導向分離其代謝產物。

基于活性導向方法從內生真菌Phomopsissp. GXIMD02029中分離得到的7個化合物主要為聚酮類化合物。化合物1已從內生真菌Phomopsissp.和Diaporthesp. SCSIO 41011中被分離(Luo et al., 2018;Santos et al., 2021),但未見有抗菌活性報道。本研究首次報道了該化合物的抑菌活性,化合物1對枯草芽孢桿菌、表皮葡萄球菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌、粘性放線菌和金黃色葡萄球菌有不同程度的抑制作用。Beau等(2012)報道化合物2抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的MIC值為72 μmol·L-1。Huang等(2008)報道化合物2抑制白色念珠菌和尖孢鐮刀菌活性的MIC值為64 μg·mL-1,對腸炎沙門菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌在最大濃度128 μg·mL-1下未測得MIC值。化合物2的抗菌活性結果與文獻報道基本一致,但本研究結果拓展了化合物2的抗菌譜。文獻報道化合物4對表皮葡萄球菌的IC50值為421 μg·mL-1(Beekman et al., 2013),本研究在初篩時未見化合物4有抑菌活性,未開展化合物4的MIC值測定。本研究結果可為抗菌活性次級代謝產物分離提供微生物資源,為桐花樹內生真菌抑菌活性物質的挖掘提供科學依據,對桐花樹內生真菌在抗菌方面的應用有一定的促進意義。