西南地區六種魔芋屬植物基于cpDNA序列的遺傳多樣性研究

殷 斯, 郝 轉, 陸飛東, 高 永*

( 1. 曲靖師范學院 生物資源與食品工程學院, 云南 曲靖 655011; 2. 渭南師范學院 環境與生命科學學院, 陜西 渭南 714099 )

探究栽培作物野生資源的遺傳多樣性及遺傳分化機制對種質資源的收集與品種改良具有重要的應用價值和科研意義。魔芋是天南星科(Araceae)、魔芋屬(AmorphophallusBlume)的多年生草本植物(白立偉等,2016),主要分布于西非、亞洲中南半島、中國西南山地和東南亞國家的熱帶及亞熱帶地區,全球約200種,我國約有20種(劉佩瑛,2004)。魔芋在我國具有悠久的栽培利用歷史并且野生種質資源豐富,其地下球狀塊莖富含葡甘聚糖,具有重要的經濟價值(李恒和龍春林,1998)。近年來,我國的魔芋種植面積不斷擴大,自2017年起,西南各省的總種植面積已達到世界第一(Srzednicki &Borompichaichartkul, 2020)。但是,由于長期無性繁殖,魔芋種質出現了品質下降、產量降低、病害流行等問題,因此,要推動魔芋產業的進一步發展,加快野生種質資源的收集與遺傳多樣性評價已刻不容緩(宣慢,2010)。

20世紀80年代起,我國對魔芋種質資源的起源與進化、種質的親緣關系和分類等進行了研究并取得一定的成果(牛義等,2005)。李恒研究整理了中國魔芋屬植物19種,包括中國特有的8個種,后續又發現命名了3個新種(李恒,1988)。一些分子生物學研究利用ISSR、RAPD、AFLP等分子標記,探討了魔芋部分栽培品種之間的親緣關系(張盛林和孫遠航,2006;任盤宇和潘明清,2013;Pan et al., 2015)。但是目前,我國在魔芋野生資源的親緣關系特別是分子系統進化方面的研究還較為欠缺,各地命名混亂,同種異名和同名異種的現象較為突出,特別是對野生魔芋資源的遺傳變異缺乏系統研究(牛義等,2005)。

作為西南地區的特色經濟作物,魔芋具有重要的經濟與生態價值(趙培城等,2015)。但環境污染、生境破壞等人類活動,造成了魔芋野生群體的衰退(牛義等,2005)。作為種質資源改良的優良材料,加快野生種質資源的研究與利用,對魔芋的品種改良具有重要意義。當前對魔芋野生群體的遺傳背景缺乏了解,給資源保護和育種工作造成了很大阻礙(Gao et al., 2017)。葉綠體DNA(cpDNA)為單系遺傳,遺傳過程不經歷基因重組,被廣泛地應用于植物系統發育、遺傳多樣性評價等研究中(李婭翔等,2020)。cpDNA 片段trnK-matK、rbcL和trnL在天南星科的系統進化研究中,被證明具有通用性好、突變率高的特點(Grob et al., 2002; Sedayu et al., 2010)。破碎生境對種群動態的影響及演化趨勢是保育遺傳學研究的熱點問題,遺傳多樣性則是推斷物種進化潛力的重要指標之一(王崢峰和葛學軍,2009)。為評估西南地區魔芋屬物種野生群體的遺傳多樣性,探究代表物種的系統發育地位,本研究采用以上3個cpDNA片段對西南地區6種魔芋屬植物的野生群體進行遺傳多樣性及種間系統發育研究,以期為西南地區魔芋物種的保護提供指導,為今后魔芋的種質創新提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2019—2021年,本研究采集南方五省(區)(云南、廣西、貴州、湖南、江西)的魔芋屬6個種,即花魔芋(Amorphophalluskonjac)、東京魔芋(A.tonkinensis)、西盟魔芋(A.krausei)、滇魔芋(A.yunnanensis)、疣柄魔芋(A.paeoniifolius)、東亞魔芋(A.kiusianus)的野生群體。采樣過程中,隨機選擇植株,每株樣本間隔至少5 m,采集葉片置于硅膠中干燥保存(表1)。采用植物基因組DNA提取試劑盒(天根,北京)提取魔芋葉片總基因組DNA,1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。

表 1 本研究的魔芋群體樣本采集地點信息Table 1 Geographic information of Amorphophallus populations collected in this study

1.2 PCR擴增和測序

利用已發表的引物對trnK-matK、rbcL和trnL 3個cpDNA片段進行PCR擴增(表2)。PCR擴增體系總體積為30 μL,包含20～50 ng DNA模板,正、反向引物(10 μmol·L-1),2×PCR StarMix(GenStar)和ddH2O等。反應程序:預變性,95 ℃,5 min;35個擴增循環,95 ℃變性30 s,56 ℃退火30 s,72 ℃延伸60 s;終延伸,72 ℃,7 min。擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測,合格產物送生工生物工程(上海)股份有限公司進行雙向測序。

表 2 cpDNA片段擴增所用引物序列Table 2 Primer sequences used in the amplification of cpDNA fragments

1.3 數據分析

采用Lasergene軟件的Seqman工具對3個cpDNA片段進行拼接(DNAStar Inc., Madison, WI, USA);使用MEGA v7.0的Clustal W算法對所有樣本的DNA序列進行比對,將同一個體的3個cpDNA片段序列串聯作為一個整體進行分析(Kumar et al., 2016)。在遺傳多樣性評估時,將連續多堿基的插入/缺失突變視為單突變事件(Simmons &Ochoterena, 2000)。為減少誤差,樣本量少于3個的群體(KZSMY、GXKK)不用于群體遺傳多樣性分析。采用Arlequin軟件評估6個物種間的遺傳分化系數(FST),并用1 000次模擬運算評估顯著性(Excoffier &Lischer, 2010)。

為評估魔芋6個物種之間的親緣關系及系統進化地位,本研究使用IQ-TREE 1.6.12對cpDNA單倍型序列進行核酸替代模型檢測,構建最大似然法(maximum likelihood,ML)系統進化樹,運行1 000次bootstrap檢測顯著性(Nguyen et al., 2014)。此外,采用SplitsTree 4.14.6對所有單倍型序列構建Neighbor-Net樹,評估魔芋種間的網狀進化關系(Huson &Bryant, 2006)。

2 結果與分析

2.1 cpDNA序列擴增

對來源于28個野生群體的170個樣本分別進行cpDNA序列擴增,3個cpDNA片段的電泳檢測結果表明,PCR目的產物條帶清晰,符合測序要求(圖1)。

2.2 基于cpDNA的物種遺傳變異與遺傳多樣性

經樣本間的序列拼接和比對,得到的3個葉綠體片段trnK-matK、rbcL和trnL的序列長度分別為719、1 312、315 bp。將同一個體的3條序列串聯進行整體分析,序列總長度為2 346 bp。在所有樣本序列中檢測到128個多態性位點,其中插入/缺失突變位點78個,共得到57個單倍型。遺傳多樣性分析表明,群體遺傳多樣性較低,核苷酸多樣性(用π表示)在0～0.009 31之間。在部分群體只有一個單倍型(26個群體中的12個),群體DW(疣柄魔芋)和NJZ(疣柄魔芋)具有最高的群體單倍型多樣性(Hd=1.0)。在物種水平,每個物種的單倍型數量從4到14不等,其中疣柄魔芋和東京魔芋的遺傳多樣性較高(表3)。在花魔芋、東京魔芋、西盟魔芋和滇魔芋的種內群體間發現了共享單倍型,但6個物種之間沒有共有單倍型存在。物種間的兩兩遺傳分化表明,花魔芋和滇魔芋兩個物種間的遺傳分化系數最高(FST=0.942),而花魔芋和西盟魔芋的遺傳分化系數最低,FST為0.481(表4)。

2.3 魔芋屬系統發育關系

為評估魔芋屬各物種的系統發育關系,結合GenBank數據庫下載的21個魔芋物種的cpDNA序列進行系統發生分析(表5),根據BIC(Bayesian information criterion)評分,HKY+F+R2模型被檢測為最優核酸替換模型。最大似然樹表明,27個魔芋物種聚成3個主要分支,即非洲分支、東南亞分支和東亞大陸分支。本研究關注的6個物種則以較高的支持率分別被劃分在東亞大陸分支和東南亞分支,疣柄魔芋列入東南亞分支。東亞大陸分支又進一步分化為兩支(分支A和分支B),分支A包含花魔芋和西盟魔芋,分支B由東亞魔芋、滇魔芋和東京魔芋構成 (圖2)。Neighbor-Net網狀進化分析的結果與ML樹基本一致, 支持東亞魔芋、滇魔芋和東京魔芋構成一個分支且花魔芋與西盟魔芋的親緣關系較近的結論(圖3)。

M表示DL2000 Marker。M indicates DL2000 Marker.圖 1 部分樣本3個cpDNA片段 [rbcL (A)、trnL (B)、trnK-matK (C)]擴增產物電泳圖Fig. 1 Electrophoretograms of amplification products of three cpDNA fragments [rbcL (A), trnL (B) and trnK-matK (C)]

3 討論與結論

遺傳多樣性與遺傳分化不僅能反映物種遺傳變異的高低,還能在一定程度上推斷群體的演化機制,為制定保護措施提供依據(王崢峰和葛學軍,2009)。本研究檢測到西南地區魔芋屬的6個物種存在低水平的群體遺傳多樣性,造成此現象的主要原因可能是植物的自身散布能力有限,西南山地的生境阻隔造成了群體遺傳多樣性降低(Gao et al., 2015)。我國西南山地的多種植物,如苦苣苔、胡黃連等, 也被報道由于隔離造成了低水平的群體遺傳多樣性(Gao et al., 2015; 李國棟等,2016; Wang et al., 2017)。此外,近年來西南地區野生魔芋的生境由于人為破壞呈破碎化狀態,加劇了種群衰退和地理隔離,這是群體遺傳多樣性降低的人為因素(賀水蓮等,2016)。針對該情況,可根據魔芋的遺傳分化格局,確定核心種質資源,通過建立群體種源保護地、種質資源圃等多種措施來進行保育(臧潤國等,2016)。在物種水平上,滇魔芋的遺傳多樣性在6個物種中最低,預示著該物種適應環境變化的能力較其他物種更弱,后續應加強對其野生群體的保護。

表 3 西南地區魔芋屬6個物種的cpDNA序列遺傳多樣性參數Table 3 Genetic diversity parameters of six Amorphophallus species from Southwest China surveyed for cpDNA sequences

表 4 西南地區魔芋屬6個物種的種間遺傳分化系數(FST)Table 4 Genetic differentiation coefficient (FST) among six Amorphophallus species from Southwest China

表 5 本研究下載的魔芋cpDNA序列NCBI GenBank登錄號Table 5 Accession numbers of cpDNA sequences downloaded from NCBI GenBank in this study

系統發育分析表明魔芋屬物種按照地理分布形成3個主要分支,而東亞大陸的類群則進一步分化為兩支(Claudel et al., 2017)。目前對魔芋東亞大陸類群分化為兩支的原因尚未有明確結論,兩個分支之間存在地域重疊,魔芋屬早期演化的快速擴張可能導致了該分化格局(Claudel et al., 2017)。形態學研究認為,東亞大陸兩個類群間的果實顏色存在差異,可能與吸引相應昆蟲進行種子散播有關(Claudel et al., 2017)。鑒于此,生態適應可能也是東亞大陸類群的分化機制之一。細胞學研究也為推斷該屬的演化歷史提供了一些佐證(張風潔,2014)。學者認為2n=26是魔芋屬的原始核型,2n=24和2n=28由減數分裂過程配子丟失或增加1條染色體造成,而2n=39則可能是由未正常減數分裂的配子(n=2x=26)與正常減數分裂的配子(n=x=13)雜交形成(Zhao et al., 2021)。針對本研究的物種,東南亞分支的疣柄魔芋和A.commutatus的染色體數量分別為2n=28和2n=26,東亞大陸分支的花魔芋、西盟魔芋、滇魔芋和謝君魔芋的染色體數目均為2n=26(張風潔,2014)。目前染色體核型研究涉及的魔芋物種較少,后續需要解析更多物種的染色體組型,以期更深入了解魔芋屬的演化歷史及規律。

本研究鑒定了西南地區魔芋代表物種間的親緣關系,雖然我國魔芋栽培面積位居世界第一,但育種資源狹窄,當前品種已不能滿足種植產業的需要。要解決魔芋的良種問題,雜交育種不失為一種可行的解決方案。目前已有一些研究開展了魔芋的種間雜交實驗,但需要注意因遠緣雜交成功率低、子代不育等造成經濟損失(劉二喜等,2020)。根據本研究得出的魔芋屬物種的親緣關系合理選擇雜交親本組合,可為今后魔芋的種質創新、雜交育種及雜種優勢群的構建提供理論依據。

綜上所述,為對我國西南地區的魔芋野生資源進行遺傳評價,研究利用3個cpDNA標記分析了魔芋屬6個物種的遺傳多樣性與遺傳分化,鑒定了各物種之間的系統進化關系。研究結果表明,生境隔離和人為干擾可能導致了魔芋野生群體的遺傳多樣性降低,東亞大陸類群分化為兩支可能與早期演化的快速擴張和生態適應相關。魔芋屬種間的親緣關系鑒定可為后續的野生資源利用奠定理論基礎。