西南地區(qū)野生刺梨的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)研究

吳詩琪, 潘 鳳, 趙 財(cái)

( 貴州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院/農(nóng)業(yè)生物工程研究院, 山地植物資源保護(hù)與保護(hù)種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 貴陽 550025 )

隨著社會(huì)生活質(zhì)量的不斷提高,人們?cè)絹碓街匾暿澄锏臓I養(yǎng)價(jià)值。不僅如此,人類對(duì)綠色生活和綠水青山的需求更加迫切,因此需要開發(fā)利用更多優(yōu)質(zhì)的野生植物資源。刺梨(Rosaroxburghii)為薔薇科,薔薇屬重要植物資源。原產(chǎn)中國西南部,特別以貴州省資源最為豐富,湖南、湖北、甘肅、陜西和華東有零星分布,是我國特有的果樹資源(李楠玉等,2021)。因含有極高的維生素C成分而備受關(guān)注,其維生素C的含量比獼猴桃高9倍,被稱為 “維C之王”,因此深受消費(fèi)者青睞。刺梨具有巨大的開發(fā)利用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。其果實(shí)肉質(zhì)肥厚且具有濃烈的特殊香氣,包含豐富的超氧化物歧化酶、過氧化物酶、多酚、刺梨黃酮、刺梨多糖、刺梨三萜、氨基酸以及微量元素等物質(zhì)(張懷山等,2017)。同時(shí),刺梨的藥用價(jià)值高,其花、果、葉和籽均可入藥,有清熱降火、健胃、消食、滋養(yǎng)、潤肺止咳和止瀉等效果,尤其是刺梨含有豐富的超氧化物歧化酶,在心血管、消化系統(tǒng)和各種腫瘤疾病等防治方面的應(yīng)用十分廣泛(汪凱莎,2015)。因此,刺梨成為貴州省重點(diǎn)發(fā)展的果樹行業(yè)。隨著刺梨利用范圍的不斷擴(kuò)展,相關(guān)研究也不斷豐富,主要集中在化學(xué)成分以及藥理作用等方面(饒浠銳等,2022)。但是,近年來,新型城市化進(jìn)程加劇造成的土地侵占,以及土地開墾,農(nóng)業(yè)耕種時(shí)的濫砍濫伐等造成的生態(tài)損壞和生境破碎化,野生刺梨的種群數(shù)量和分布面積呈現(xiàn)下降趨勢(shì)(李楠玉等,2021)。這一綠色資源并沒有得到很好的開發(fā)利用,當(dāng)務(wù)之急就是對(duì)野生刺梨資源做好收集和遺傳背景分析及保護(hù)性利用等方面的管理工作(魯敏等,2020)。

目前,分子標(biāo)記技術(shù)已廣泛運(yùn)用于研究植物的遺傳多樣性,但刺梨種質(zhì)資源分子水平的研究起步較晚。文曉鵬和鄧秀新(2003)通過形態(tài)學(xué)性狀和RAPD標(biāo)記探索了刺梨及部分近緣種的親緣關(guān)系,并對(duì)不同自然分布區(qū)的30個(gè)野生刺梨進(jìn)行遺傳多樣性分析,結(jié)果表明來自貴州的樣品蘊(yùn)藏有最豐富的遺傳多樣性;鄢秀芹(2015)通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得刺梨大量功能基因組信息,開發(fā)了其EST-SSR標(biāo)記,并利用開發(fā)的引物進(jìn)行刺梨及薔薇屬種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析;魯敏等(2017)基于EST-SSR標(biāo)記構(gòu)建貴州刺梨核心種質(zhì);張懷山(2017)利用SSR標(biāo)記、ITS序列以及5個(gè)葉綠體基因?qū)σ吧汤婢尤哼M(jìn)行遺傳結(jié)構(gòu)及遺傳多樣性分析;魯敏等(2020)對(duì)西南地區(qū)12個(gè)居群構(gòu)建刺梨核心種質(zhì)。綜上表明,刺梨起源于西南地區(qū),但遺傳背景研究存在所使用標(biāo)記遺傳信息量少,采集樣本數(shù)量較少,地域性相對(duì)狹窄問題,未能詳細(xì)闡明刺梨的遺傳多樣性,地理分布格局和起源問題等。

單拷貝基因(scnDNA)是雙親遺傳,攜帶大量的遺傳信息,屬于直系同源,可以更好地反映物種的進(jìn)化史(畢毓芳等,2019)。近年來葉綠體基因(cpDNA)逐漸受到廣泛應(yīng)用,其特點(diǎn)是分子量小、序列較為保守、進(jìn)化遲緩、結(jié)構(gòu)單一、單親遺傳,并且不易受外界環(huán)境影響(樊守金和郭秀秀,2022),可以用來揭示物種應(yīng)對(duì)環(huán)境變化的進(jìn)化潛力,對(duì)其遺傳多樣性的保護(hù)以及保護(hù)計(jì)劃的制訂實(shí)施都具有非常重要的價(jià)值(劉海瑞等,2018)。將二者結(jié)合分析可以更好地開展物種遺傳多樣性研究,使結(jié)果更加準(zhǔn)確。

本研究采用2個(gè)單拷貝核基因(GAPDH和ncpGS)和進(jìn)化速率較快的3個(gè)葉綠體基因間隔區(qū)atpF-trnH、trnL-trnF和trnG-trnS序列結(jié)合對(duì)分布西南地區(qū)的5個(gè)省市,27個(gè)居群共320個(gè)野生刺梨材料進(jìn)行分析。采用群體遺傳學(xué)和譜系地理學(xué)的研究方法,探討野生刺梨居群遺傳多樣性和遺傳格局,種群歷史動(dòng)態(tài),并探究野生刺梨的起源演化歷史進(jìn)程,為刺梨的資源保護(hù)和遺傳育種提供科學(xué)參考資料。同時(shí),也為西南地區(qū)植物區(qū)系演化和物種形成機(jī)制研究奠定一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本研究的320個(gè)刺梨材料采自貴州省、四川省、云南省、重慶市和湖北省共5個(gè)省市,覆蓋了整個(gè)西南地區(qū)的27個(gè)自然居群(表1)。根據(jù)當(dāng)?shù)氐姆植家?guī)模決定居群的樣本數(shù)量,每個(gè)居群采樣5～18個(gè)不等,單個(gè)樣本間距離50 m以上(圖1)。每株采取新鮮幼嫩的葉片10～20 g,將采集好的葉片就地迅速保存于采集袋中,加入硅膠進(jìn)行干燥保存,后用于DNA提取。所采集的憑證標(biāo)本存放于貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院中。

1.2 DNA提取、PCR擴(kuò)增及測(cè)序

采用天根生化科技(北京)有限公司的植物基因組DNA試劑盒(DP305)提取刺梨DNA。利用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA是否提取成功。3段葉綠體基因序列(atpF-trnH、trnL-trnF和trnG-trnS)和2段單拷貝核基因(GAPDH和ncpGS)分別通過5段引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增(表2)。PCR擴(kuò)增反應(yīng)為25 μL 體系:2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL;上游引物、下游引物和DNA各1 μL;dd H20 9.5 μL。擴(kuò)增后得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)2%的凝膠電泳檢測(cè)后將凝膠成像系統(tǒng)上有清晰、明亮條帶的樣品送往北京擎科生物科技有限公司(重慶分公司)進(jìn)行純化及測(cè)序。

對(duì)于單拷貝核基因ncpGS序列所使用的反應(yīng)程序:預(yù)變性94 ℃ 5 min,變性95 ℃ 45 s,退火51 ℃ 45 s,延伸72 ℃ 2 min,循環(huán)34次,最后延伸72 ℃ 10 min,12 ℃恒溫保存。GAPDH序列所使用的反應(yīng)條件:預(yù)變性94 ℃ 4 min,變性95 ℃ 50 s,退火57 ℃ 50 s,延伸72 ℃ 2 min,循環(huán)34次,最后延伸72 ℃ 10 min,12 ℃恒溫保存。對(duì)于葉綠體基因atpF-trnH序列所使用的反應(yīng)程序:預(yù)變性94 ℃ 5 min,變性94 ℃ 50 s,退火55 ℃ 50 s,延伸72 ℃ 1 min,循環(huán)34次,最后延伸72 ℃ 10 min,12 ℃恒溫保存。trnL-trnF序列所使用的反應(yīng)條件:預(yù)變性96 ℃ 5 min,變性94 ℃ 40 s,退火54 ℃ 40 s,延伸72 ℃ 1 min,循環(huán)35次,最后延伸72 ℃ 10 min,12 ℃恒溫保存。trnG-trnS序列所使用的反應(yīng)程序:預(yù)變性85 ℃ 5 min,變性95 ℃ 1 min,退火54 ℃ 1 min,延伸72 ℃ 2 min,循環(huán)34次,最后延伸72 ℃ 10 min,12 ℃恒溫保存。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

獲得測(cè)序結(jié)果后,用Mega 6軟件(Tamura et al., 2013)刪掉序列兩端不可靠的堿基序列后進(jìn)行比對(duì),使用BioEdit軟件(Ahmed, 2011)查看測(cè)序峰圖,將序列進(jìn)行手工校正得到比對(duì)好的數(shù)據(jù)后,利用PhyloSuite軟件(Zhang et al., 2020)將兩個(gè)單拷貝核基因以及3個(gè)cpDNA片段分別拼接成一個(gè)整體的長片段。采用DnaSP 6軟件(Rozas et al., 2017)對(duì)27個(gè)刺梨居群進(jìn)行DNA多態(tài)性分析,得到相關(guān)所示數(shù)據(jù),如單倍型數(shù)量(H)、單倍型多樣性(Hd)、核苷酸多樣性(π)、變異位點(diǎn)(Vs)、簡約信息位點(diǎn)(Ps)。進(jìn)行中性檢驗(yàn)得到Tajima’sD值和Fu’sFs值,看結(jié)果是否符合中性進(jìn)化模型,從而判斷是否曾經(jīng)發(fā)生過擴(kuò)張現(xiàn)象;以及進(jìn)行錯(cuò)配分析,觀察曲線進(jìn)一步分析居群是否經(jīng)歷過擴(kuò)張或瓶頸效應(yīng)(張曉蕓等,2019)。用PERMUTCpSSR軟件(Caraux & Pinloche, 2005)計(jì)算遺傳分化系數(shù)NST和GST。利用Arlequin軟件(Excoffier & Lischer, 2010)進(jìn)行分子方差分析(AMOVA),計(jì)算刺梨居群內(nèi)和居群間的遺傳變異,并計(jì)算遺傳分化系數(shù)(FST)揭示群體間遺傳結(jié)構(gòu), 基因流(Nm)進(jìn)一步表明居群的分化水平。利用Mega 6軟件(Tamura et al., 2013)計(jì)算遺傳距離矩陣,利用Network軟件(Bandelt et al., 1999)基于簡約性原則采用MJ法構(gòu)建單倍型網(wǎng)絡(luò)圖(潘鳳等,2021);用ArcGis軟件(張智慧,2017)繪制單倍型在地理上的分布。

圖 1 刺梨采樣照片F(xiàn)ig. 1 Photos of collected Rosa roxburghii

表 1 27個(gè)刺梨居群的采集信息Table 1 Collection information of 27 Rosa roxburghii populations

表 2 引物名稱、序列及參考文獻(xiàn)Table 2 Primer name, sequence and reference

表 3 320個(gè)刺梨材料基于單拷貝核基因和葉綠體基因的多態(tài)分析Table 3 Polymorphic analysis of single-copy nuclear gene and chloroplast gene in 320 Rosa roxburghii samples

2 結(jié)果與分析

2.1 遺傳多樣性分析

如表3所示,2段單拷貝核基因GAPDH和ncpGS拼接后的總長度為1 294 bp。其中,AT含量為58.88%～59.12%,與GC含量相差不大。共檢測(cè)到8個(gè)核苷酸變異位點(diǎn),其中簡約性的信息位點(diǎn)5個(gè),單一突變位點(diǎn)3個(gè)。變異位點(diǎn)分別為107、154、592、1 096、1 131、1 180、1 182和1 225。將序列提交至GeneBank,序列號(hào)為OP526995～OP527024。拼接序列檢測(cè)到15個(gè)單倍型。單拷貝核基因拼接序列的遺傳多樣性水平較低(Hd=0.449 0,π=0.000 47),但不同刺梨居群間存在較大差異(Hd=0～0.800 0,π=0～0.000 84),27個(gè)居群中,黔西南貞豐QXNZF居群(Hd=0.800 0,π=0.000 78)、畢節(jié)納雍BJNY居群(Hd=0.714 3,π=0.000 84)和畢節(jié)黔西BJQX居群(Hd=0.670 3,π=0.000 84)表現(xiàn)出較高的遺傳多樣性。遺傳多樣性水平最低的是云南曲靖YNQJ居群和黔東南雷山QDNLS居群(Hd、π均為0)。

對(duì)3段葉綠體基因(atpF-trnH、trnL-trnF和trnG-trnS)序列進(jìn)行拼接后的總長度為1 865 bp,AT含量為71.92%～72.22%,堿基組成具有明顯的A/T偏好性,這與大多數(shù)葉綠體基因的堿基組成成分一致。其中,共檢測(cè)到20個(gè)核苷酸變異位點(diǎn),簡約性的信息位點(diǎn)12個(gè),單一突變位點(diǎn)8個(gè)。變異位點(diǎn)分別為55、88、142、175、209、344、415、423、430、545、556、573、590、591、656、696、967、1 227、1 592和1 740。將序列提交至GeneBank,序列號(hào)為OP526975～OP526994,OP545883～OP545922。拼接序列檢測(cè)到單倍型數(shù)量(H)20個(gè)。總體的遺傳多樣性水平不高(Hd=0.653 4,π=0.000 65),但不同刺梨居群間存在較大差異(Hd=0～0.800 0,π=0～0.001 29),在所有居群中畢節(jié)納雍BJNY居群(Hd=0.800 0,π=0.000 86)、畢節(jié)大方BJDF居群(Hd=0.736 3,π=0.000 74)和畢節(jié)七星關(guān)BJQXG居群(Hd=0.692 3,π=0.001 29)的遺傳多樣性水平較高。由此可見在西南地區(qū)中,畢節(jié)地區(qū)刺梨的遺傳多樣性較高,表明該地區(qū)野生刺梨的遺傳信息較豐富。遺傳多樣性水平最低的是湖北宜昌HBYC居群和四川涼山SCLS居群(Hd、π均為0)。

2.2 單倍型多樣性分析

基于單拷貝核基因的拼接序列,27個(gè)居群得到15個(gè)單倍型。其中,單倍型R-1分布最廣,在所有居群中均有分布,意味著單倍型R-1是主要單倍型,推測(cè)R-1為古老單倍型,其次為單倍型R-3,分布在15個(gè)群體中,為優(yōu)勢(shì)單倍型。安順平壩ASPB居群和畢節(jié)黔西BJQX居群共有單倍型R-7,單倍型R-9為分布在居群畢節(jié)納雍BJNY和銅仁梵凈山TRFJS中,畢節(jié)納雍BJNY居群與黔東南黃平QDNHP居群共有單倍型R-12。單倍型R-5只分布在安順普定ASPD居群中,單倍型R-11只分布在遵義湄潭ZYMT居群中,R-13只分布于黔東南黃平QDNHP居群中,R-15六盤水盤縣LPSPX居群中。其余單倍型均分布在多個(gè)居群中(表4)。

基于葉綠體基因的拼接序列,在27個(gè)刺梨居群中得到20個(gè)單倍型,其中單倍型H-1分布最廣,在26個(gè)居群中廣泛分布,意味著單倍型H-1是群體遺傳構(gòu)成的最主要單倍型,推測(cè)H-1為古老單倍型;其次是單倍型H-6,在16個(gè)居群中廣泛分布。單倍型H-4和單倍型H-5均是安順普定ASPD居群和畢節(jié)織金B(yǎng)JZJ居群共有;單倍型H-3只分布在安順紫云ASZY居群中,畢節(jié)七星關(guān)BJQXG擁有最多的特有單倍型(H-8、H-10、H-11和H-12,共4個(gè)特有單倍型),單倍型H-13分布在遵義湄潭ZYMT居群中,重慶酉陽CQYY居群存在特有單倍型H-14,單倍型H-15只分布在云南大理YNDL居群中,黔東南黃平QDNHP居群存在特有單倍型H-16,單倍型H-17分布在畢節(jié)金沙BJJS居群中,單倍型H-18分布在畢節(jié)大方BJDF居群中,畢節(jié)納雍BJNY居群存在2個(gè)特有單倍型H-19和H-20。其余單倍型均分布在多個(gè)居群中(表4)。

基于單拷貝核基因檢測(cè)到的15個(gè)單倍型構(gòu)建單倍型網(wǎng)絡(luò)圖(圖2,圖3)。由圖2可知,以單倍型R-1為中心向四周發(fā)散,與單倍型R-3、R-4、R-6、R-8、R-10和R-13以一種突變步的方式直接相連,又各自發(fā)生分化,構(gòu)成一個(gè)四邊形。單倍型R-10分化出R-12和R-15分別與R-3和R-8相連。單倍型R-7單獨(dú)分化出R-2。同時(shí),網(wǎng)狀進(jìn)化圖出現(xiàn)多個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu),說明核基因重組事件的發(fā)生。

基于葉綠體基因所檢測(cè)到的20個(gè)單倍型進(jìn)行單倍型網(wǎng)絡(luò)分析(圖4,圖5)。由圖4可知,20個(gè)單倍型在單倍型網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建圖中呈散射分布,可分為H-1和H-9兩個(gè)分支,每個(gè)分支又各自分化。一支以單倍型H-1為中心,與單倍型H-3、H-4、H-5、H-7、H-13、H-14和H-16以一種突變步的方式直接相連并聚為一類;另一支以H-9為中心,與H-2、H-6、H-8、H-10、H-11、H-12、H-14、H-15、H-18、H-19和H-20聚類在一起,包括畢節(jié)七星關(guān)BJQXG、畢節(jié)大方BJDF和畢節(jié)納雍BJNY居群的特有單倍型,表明這一支主要以畢節(jié)地區(qū)為主。特有單倍型主要位于圖的外側(cè),說明是最晚發(fā)生突變的單倍型,并且還存在缺失單倍型,可能是未收集到或在進(jìn)化過程中丟失。

圓圈大小代表頻率。下同。Circle size represents frequency. The same below.圖 2 基于刺梨單拷貝核基因構(gòu)建的單倍型網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 Network diagram of Rosa roxburghii single-copy nuclear gene haplotype

表 4 27個(gè)刺梨居群基于單拷貝核基因和葉綠體基因的樣品信息、單倍型分布及多態(tài)分析Table 4 Collection information, haplotype distribution and polymorphism analysis of 27 Rosa roxburghii populations on single-copy nuclear gene and chloroplast gene

2.3 遺傳結(jié)構(gòu)分析

分子方差分析(AMOVA)結(jié)果顯示(表5),基于單拷貝核基因的27個(gè)刺梨居群的遺傳變異主要發(fā)在居群內(nèi)(90.51% >>9.49%),遺傳分化系數(shù)FST為0.094 87 ,基因流為2.44,遺傳距離為0～0.004,群體間遺傳分化系數(shù)為GST= 0.056 0.05)。

利用DnaSP 6軟件分別基于單拷貝核基因和葉綠體基因的拼接序列對(duì)320個(gè)刺梨材料進(jìn)行中性檢測(cè),結(jié)果顯示,Tajima’sD統(tǒng)計(jì)值分別為-1.575 16 (0.010.01),均不顯著,符合中性進(jìn)化模型。這說明刺梨受到環(huán)境變化、人為因素的影響較低,進(jìn)化方式為平衡選擇。Fu’sFs值分別是-11.003和-12.066,均為顯著負(fù)值,說明刺梨居群發(fā)生過擴(kuò)張。為了進(jìn)一步驗(yàn)證27個(gè)刺梨居群是否經(jīng)歷擴(kuò)張,對(duì)其進(jìn)行失配分析(李楠玉等,2021)。失配分析是檢測(cè)物種居群的歷史動(dòng)態(tài),如果呈單峰分布,說明該種群經(jīng)歷了擴(kuò)張,呈雙峰或多峰分布時(shí),則認(rèn)為該居群持續(xù)處于動(dòng)態(tài)平衡或緩慢下降狀態(tài)(莫忠妹等,2022)。由圖6可知,葉綠體基因的失配分布圖呈雙峰,而單拷貝核基因的失配分布曲線呈單峰,推測(cè)刺梨居群只是在小范圍內(nèi)經(jīng)歷過擴(kuò)張,但總體上維持穩(wěn)定狀態(tài)。

3 討論與結(jié)論

3.1 刺梨居群的遺傳多樣性分析

刺梨單拷貝核基因GAPDH和ncpGS聯(lián)合序列(Hd=0.469 2,π=0.000 49)以及葉綠體基因atpF-trnH、trnL-trnF和trnG-trnS聯(lián)合序列(Hd=0.653 4,π=0.000 65)的遺傳多樣性顯著低于高源等(2020)采用4段葉綠體拼接序列對(duì)蘋果屬植物的結(jié)果(Hd=0.879,π=0.009 52),劉晶(2013)對(duì)薔薇科豆梨(cpDNA:Hd =0.719,π=0.001 05)和川梨(cpDNA:Hd =0.718,π=0.000 85)的結(jié)果,同時(shí)還低于張懷山(2017)對(duì)刺梨cpDNA的研究結(jié)果(Hd=0.829,π=0.001 31),但高于其ITS序列的結(jié)果(Hd=0.247,π=0.000 40)。本研究結(jié)果表明,刺梨具有較低的遺傳多樣性。西南地區(qū)刺梨的遺傳多樣性偏低,可能與本研究所用3個(gè)cpDNA間隔區(qū)序列的進(jìn)化速率有關(guān),選用的葉綠體基因序列較為保守,需要更加精準(zhǔn)的結(jié)果時(shí)則需要結(jié)合其他cpDNA間隔區(qū)序列(王崇等,2021);也可能是標(biāo)記的基因、自身屬性以及有效群體大小不同等因素所導(dǎo)致。因?yàn)橐吧汤嬖谶M(jìn)化過程中由少數(shù)種群產(chǎn)生的建立者效應(yīng)或者近期發(fā)生過瓶頸效應(yīng),造成遺傳變異大量丟失,遺傳多樣性結(jié)果較低(何文等,2014)。刺梨每個(gè)居群間的單倍型多樣性(Hd)表現(xiàn)不同,推測(cè)可能是西南地區(qū)的地形十分復(fù)雜,使各居群所在的環(huán)境條件具有差異,經(jīng)過長期不同的生態(tài)環(huán)境和自然選擇,會(huì)導(dǎo)致具有一定地理隔離的刺梨居群的遺傳多樣性存在差異。

3.2 刺梨居群的遺傳結(jié)構(gòu)分析

種群在進(jìn)化過程中,遺傳漂變、自然選擇、種群歷史和突變等因素的影響導(dǎo)致其遺傳結(jié)構(gòu)產(chǎn)生復(fù)雜的構(gòu)成(任婧等,2019)。通過對(duì)單拷貝核基因的研究發(fā)現(xiàn),遺傳分化系數(shù)較低(FST=0.094 87),遺傳系數(shù)為NST=0.076 >GST=0.056 (P>0.05),雖然P值顯著,但是低于Petit等(2005)總結(jié)的基于核基因標(biāo)記的22種植物的平均遺傳分化程度(GST=0.15)。從兩個(gè)基因的單倍型網(wǎng)絡(luò)圖可以看出,高頻率的單倍型分布到多數(shù)種群中,存在明顯網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),但同時(shí)各單倍型在種群中交織分布,與種群的地理分布沒有明顯聯(lián)系,這也與種群間基因交流廣泛,缺乏種群特有的高頻率的單倍型有關(guān)。此外,刺梨種群的不同居群間出現(xiàn)了大量親緣關(guān)系靠近的單倍型,表明刺梨群體間不存在明顯的譜系地理結(jié)構(gòu)。不同于葉綠體基因僅有的母系遺傳,核基因還存在花粉流,導(dǎo)致刺梨種群間基因交流更頻繁,基因流(Nm=2.44)較高。植物居群間遺傳結(jié)構(gòu)存在較大的差異性,主要是地理上的隔離、突變、動(dòng)蕩等環(huán)境因素以及基因流的隔離導(dǎo)致居群的遺傳分化所致(莫忠妹等,2022)。

圖 3 基于單拷貝核基因構(gòu)建的單倍型地理分布圖Fig. 3 Haplotype geographical distribution map based on single-copy nuclear gene construction of Rosa roxburghii

紅點(diǎn)表示丟失單倍型; mv后的數(shù)字反映兩兩單倍型之間的突變步數(shù)。Red points indicate missing haplotypes; the number after mv reflects the number of mutation steps between haplotypes.圖 4 基于刺梨葉綠體基因構(gòu)建的單倍型網(wǎng)絡(luò)圖Fig. 4 Network diagram of Rosa roxburghii chloroplast gene haplotype

表 5 刺梨種群的分子方差分析Table 5 Analysis of molecular variance in Rosa roxburghii populations

葉綠體基因的居群遺傳分化系數(shù)為GST= 0.2730.05),FST=0.336 47>0.25,顯著高于張懷山(2017)基于刺梨cpDNA的遺傳分化系數(shù)(FST=0.136),劉晶(2013)對(duì)浙江省豆梨(FST=0.23)的研究結(jié)果說明,刺梨葉綠體基因居群間的遺傳分化較高且NST、GST均不顯著(P>0.05),在分布范圍內(nèi)群體間不存在明顯的譜系地理結(jié)構(gòu)。吳錦等(2019)研究表明特有單倍型頻率高的種群無法揭示出明顯的譜系地理結(jié)構(gòu),并且居群內(nèi)部存在明顯的可以識(shí)別的遺傳變異,本研究發(fā)現(xiàn)西南地區(qū)的野生刺梨,特別是以貴州省為主的居群存在較高的單倍型頻率,進(jìn)一步闡明不存在明顯的譜系地理結(jié)構(gòu)。基因流Nm=0.61<1,表明群體間基因流動(dòng)頻率較低,說明居群間發(fā)生較強(qiáng)烈分化,遺傳漂變成為居群遺傳變異的主導(dǎo)因素。

圖 5 基于刺梨葉綠體基因構(gòu)建的單倍型地理分布圖Fig. 5 Haplotype geographical distribution map based on chloroplast gene construction of Rosa roxburghii

圖 6 刺梨種群單拷貝核基因(左)和葉綠體基因(右)的失配分析Fig. 6 Mismatch analysis of Rosa roxburghii single-copy nuclear gene (left) and chloroplast gene (right)

通過AMOVA 分析,結(jié)果均顯示刺梨種群主要的遺傳變異發(fā)生于居群內(nèi),居群間遺傳差異較小,可能是受到奠基者效應(yīng)的影響。本研究發(fā)現(xiàn)核基因的居群內(nèi)遺傳變異(90.51%)高于葉綠體基因的居群內(nèi)遺傳變異(66.35%),推測(cè)此結(jié)果可能的原因如下:(1)刺梨有自交繁育系統(tǒng),而葉綠體基因僅有母系遺傳;(2)個(gè)體間花期不重疊導(dǎo)致居群間的花粉流有限制;(3)地理隔離和人為因素的影響,使刺梨呈現(xiàn)片段化分布;(4)在刺梨歷史基因流中,種子流起到最主要的作用。劉慎諤(1985)在河流流向?qū)χ参锓植嫉挠绊懼刑岬?刺梨多分布于四川、貴州,而云南僅大理有分布,推測(cè)該物種沿著金沙江古道擴(kuò)散至大理,表明河流為刺梨物種分布和基因流提供地理便利或通道,而西南地區(qū)的高山阻隔在一定程度上阻礙了風(fēng)媒和蟲媒等介導(dǎo)的花粉流,只能在有限范圍內(nèi)進(jìn)行基因交流。這與張懷山(2017)得到刺梨種子流大于花粉流的結(jié)果一致。本研究得出野生刺梨居群遺傳結(jié)構(gòu)的主要特點(diǎn)是遺傳變異主要發(fā)生在居群內(nèi),居群間具有基因交流較頻繁、遺傳距離小等特點(diǎn),與張懷山(2017)、魯敏等(2020)以及李楠玉等(2021)的結(jié)果一致。

中性檢驗(yàn)結(jié)果表明,Tajima’sD值均為不顯著負(fù)值,符合中性進(jìn)化模型。Fu’sFs值均為顯著負(fù)值,再結(jié)合兩個(gè)單倍型網(wǎng)絡(luò)圖與錯(cuò)配分布曲線考慮,存在缺失單倍型,說明刺梨居群發(fā)生過小范圍擴(kuò)張,但總體上維持穩(wěn)定狀態(tài)。根據(jù)葉綠體基因和單拷貝核基因的單倍型網(wǎng)絡(luò)圖表示,H-1和R-1的分布范圍最廣,推測(cè)其為古老單倍型。溯祖理論認(rèn)為在居群中遺傳多樣性水平最高的區(qū)域極有可能是物種的起源中心或冰期避難所(潘鳳等,2021)。我們?cè)谝巴庹{(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn)西南地區(qū)的野生刺梨以貴州省分布最多,其他省市分布較少。在本研究中貴州省內(nèi)的居群遺傳多樣性普遍較高,推測(cè)刺梨在西南地區(qū)的冰期避難所為貴州省,以貴州省為主向四周擴(kuò)散,擴(kuò)張時(shí)可能由于云貴高原阻斷,只能在周圍發(fā)生小距離擴(kuò)張,與張懷山(2017)的結(jié)論一致。貴州省內(nèi)遺傳多樣性較高的居群有畢節(jié)地區(qū)的居群,黔西南地區(qū)的居群和安順地區(qū)的居群,推測(cè)在第四紀(jì)冰期時(shí)期貴州省為主要避難所且貴州省內(nèi)還存在多個(gè)避難所。

3.3 刺梨的保護(hù)策略

隨著城鎮(zhèn)化進(jìn)程加劇以及自然環(huán)境被破壞,為避免刺梨種質(zhì)資源的大規(guī)模遺失,對(duì)刺梨資源的收集和保護(hù)等方面的工作刻不容緩(魯敏等,2020)。在西南地區(qū)的27個(gè)居群中,畢節(jié)地區(qū)不僅是貴州省的主產(chǎn)地之一,有豐富的刺梨資源,而且遺傳多樣性水平高,還擁有多個(gè)特有單倍型,應(yīng)進(jìn)行優(yōu)先保護(hù),在就地保護(hù)的基礎(chǔ)上進(jìn)行種子保存,還可采集特有單倍型居群中的少數(shù)個(gè)體以及有特殊性狀的植株,將其移至資源圃中進(jìn)行保護(hù)(何文等,2014)。研究認(rèn)為,對(duì)種群數(shù)量很多且遺傳多樣性水平較高的居群,特別是畢節(jié)地區(qū)、安順平壩ASPB和黔西南貞豐QXNZF等居群,應(yīng)實(shí)施就地保護(hù)的策略(魯敏等,2020),對(duì)于擁有獨(dú)特單倍型的居群,如安順紫云ASZY、遵義湄潭ZYMT、畢節(jié)七星關(guān)BJQXG、畢節(jié)金沙BJJS、畢節(jié)大方BJDF、畢節(jié)納雍BJNY、重慶酉陽CQYY和黔東南黃平QDNHP居群,進(jìn)行優(yōu)先保護(hù)。由于刺梨主要的遺傳變異發(fā)生在居群內(nèi),而個(gè)體維持遺傳變異有著重要作用,因此在制定遷地保護(hù)策略的同時(shí),應(yīng)當(dāng)盡量多保存所收集到的刺梨樣品(李楠玉等,2021)。