腫瘤相關(guān)基因ADAM15在結(jié)腸癌中一個(gè)非同義變異對(duì)細(xì)胞黏附及侵襲的影響

王 晶 賀禮兵 張國(guó)燕 劉筱涵 程 杉*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與發(fā)育生物學(xué)學(xué)系,北京 100069; 2.北京市十一學(xué)校,北京 100039)

結(jié)腸癌是全球第三常見(jiàn)的癌癥,據(jù)報(bào)道[1],2020年中國(guó)結(jié)腸癌新發(fā)病例達(dá)55.5萬(wàn),死亡病例 28.6萬(wàn),分別位居惡性腫瘤的第2位和第5位。結(jié)腸癌有高度侵襲性,其可滲透到結(jié)腸和直腸組織的深層,通過(guò)淋巴系統(tǒng)和血液循環(huán)擴(kuò)散轉(zhuǎn)移[2]。其惡性侵襲和轉(zhuǎn)移是當(dāng)前臨床治療的極大挑戰(zhàn)。

結(jié)腸癌是一種復(fù)雜的疾病,其發(fā)病不僅與生活方式、飲食習(xí)慣等多種環(huán)境因素相關(guān),也與遺傳因素密切相關(guān)。眾多參與腫瘤發(fā)生的癌基因及抑癌基因也與結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。去整合素和金屬蛋白酶(a disintegrin and metalloproteinase,ADAM)家族,作為一類(lèi)跨膜蛋白,包括多個(gè)成員,與包括結(jié)腸癌在內(nèi)的多種癌癥的侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程密切相關(guān)[3-4]。

ADAM家族蛋白主要包括金屬蛋白酶[metalloproteinase,adamalysin 2_like peptidase(reprolysin)]域、重復(fù)脯氨酸前體肽[reprolysin propeptide(Pep_M12B_propep)]域、去整合素(disintegrin)域以及富含半胱氨酸[ADAM cysteine-rich(ADAM_CR)]域等功能域[5]。其中金屬蛋白酶域作為ADAM家族最重要的功能域,其主要負(fù)責(zé)切割和處理細(xì)胞表面蛋白質(zhì),在和其他功能域的協(xié)調(diào)與配合下,完成調(diào)控細(xì)胞黏附、蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等功能[6]。

作為ADAM家族的基因之一,ADAM15所編碼的跨膜蛋白(即ADAM15),在細(xì)胞黏附、遷移、增殖、凋亡,以及調(diào)控細(xì)胞炎癥反應(yīng)和免疫微環(huán)境等方面具有廣泛作用[7-8]。已有文獻(xiàn)[9]報(bào)道,ADAM15基因在乳腺癌、肺癌、結(jié)腸癌和膀胱癌等組織中異常表達(dá),提示ADAM15的異常表達(dá)與腫瘤預(yù)后不良相關(guān)。因此,本研究選取具有侵襲表型的結(jié)腸癌患者的臨床腫瘤組織樣本,通過(guò)全外顯子組測(cè)序(whole exome sequencing,WES)發(fā)現(xiàn)并驗(yàn)證了ADAM15基因非同義單核苷酸變異(single nucleotide variation,SNV) rs6427128(NM_207194:exon6:c.A572C:p.K191T),進(jìn)一步通過(guò)細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)揭示該SNV對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、黏附、侵襲及轉(zhuǎn)移等惡性表型的影響。

1 材料與方法

1.1 臨床樣本收集

本研究采集首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院4例結(jié)腸癌患者的腫瘤組織(T1～T4),以及與腫瘤配對(duì)的2例癌旁組織(N1～N2),臨床樣本資料詳見(jiàn)表1。本研究通過(guò)首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院倫理委員會(huì)審批(審批號(hào):2017-P2-013-03)。

表1 研究納入結(jié)腸癌患者臨床信息Tab.1 Clinical Information of Included Patients

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-8購(gòu)自美國(guó)模式菌種收集中心,使用含10%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)基,培養(yǎng)于37 °C、5% (體積分?jǐn)?shù))CO2培養(yǎng)箱中。以對(duì)照質(zhì)粒pcDNA3.1、ADAM15過(guò)表達(dá)質(zhì)粒Flag-ADAM15wt-pcDNA3.1、ADAM15突變體表達(dá)質(zhì)粒Flag-ADAM15mt-pcDNA3.1(通用生物)轉(zhuǎn)染HCT-8細(xì)胞,用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 Western blotting

細(xì)胞裂解液首先通過(guò)SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳使蛋白質(zhì)樣本分離,再將凝膠上的蛋白電泳轉(zhuǎn)移到固相載體PVDF膜上,封閉液(脫脂牛奶)室溫封閉1 h;加入一抗(ADAM15,ab137387,Abcam公司,英國(guó))和內(nèi)參GAPDH抗體(TA-08,北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)孵育過(guò)夜,搖床充分洗滌后加入相應(yīng)二抗室溫孵育1 h,充分洗滌后加入ECL發(fā)光液,曝光,數(shù)碼凝膠圖像處理系統(tǒng)掃描圖像。

1.4 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞以2.0×103個(gè)/孔接種于96孔板中,培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～5 d;96孔板中加入用雙無(wú)培養(yǎng)基稀釋10倍的CCK-8溶液,100 μL/孔;孵育0～2 h;用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度值(OA值)。

1.5 細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)

96孔板鋪入4 μL Matrigel,過(guò)夜烘干。加入無(wú)血清培養(yǎng)基水化40 min后,2×105個(gè)細(xì)胞/孔接種細(xì)胞。培養(yǎng)箱孵育40 min后去除培養(yǎng)基,PBS清洗3次;黏附于基底膜上的細(xì)胞固定染色,光學(xué)顯微鏡下觀察、拍照。計(jì)數(shù)黏附的細(xì)胞數(shù),結(jié)果取均值。

1.6 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)

將Transwell小室置于24孔培養(yǎng)板中,鋪入40 μL Matrigel,過(guò)夜烘干。小室中加入無(wú)血清培養(yǎng)基水化基底膜40 min后,在小室下層加入600 μL含20%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基,上層加入200 μL細(xì)胞懸液。培養(yǎng)48 h后取出小室,固定染色,光學(xué)顯微鏡下觀察、拍照。隨機(jī)選取3個(gè)視野(放大40倍),計(jì)數(shù)穿過(guò)小室的細(xì)胞數(shù),結(jié)果取均值。

1.7 細(xì)胞遷移功能檢測(cè)

1.5×106個(gè)/孔細(xì)胞接種6孔板,使細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)夜后融合率達(dá)到100 %;以200 μL槍頭在每個(gè)孔中劃一條直線,用PBS清洗掉劃線時(shí)脫落的細(xì)胞,加入含10 %(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基;培養(yǎng)箱中培養(yǎng)不同時(shí)間點(diǎn),在顯微鏡下觀察劃痕生長(zhǎng)情況并拍照。Image J軟件測(cè)量劃痕寬度,結(jié)果取均值。

1.8 WES

從癌/癌旁組織樣本中提取總DNA。將提取的DNA樣本進(jìn)行機(jī)械消化,將DNA分成150 bp左右。使用SureSelect Human All Exon V8進(jìn)行外顯子捕獲;將捕獲的外顯子DNA片段連接到測(cè)序適配器上,形成DNA文庫(kù),擴(kuò)增文庫(kù),使用Illumina Hiseq X10平臺(tái)對(duì)文庫(kù)進(jìn)行雙末端測(cè)序(2×150 bp)。

1.9 全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

提取細(xì)胞總RNA。使用Nanodrop ND1000分光光度計(jì)(Thermo Scientific公司,美國(guó))確定RNA濃度。VAHTS Universal V6 RNA-seq文庫(kù)試劑盒、VAHTS RNA Multiplex Oligos Set1- Set2 for Illumina、VAHTS DNA Clean Beads、以及VAHTS mRNA Capture Beads(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估和mRNA測(cè)序文庫(kù)制備。使用Illumina Hiseq ×10平臺(tái)進(jìn)行成對(duì)末端多重測(cè)序(2×150 bp)。

1.10 高通量數(shù)據(jù)分析

(1)WES數(shù)據(jù):使用Trimmomatic(版本:0.39)用于輸入Fasta序列進(jìn)行成對(duì)匹配和篩選,去掉測(cè)序接頭。使用BWA(版本:1.5)讀段拼接和比對(duì)。使用SAMtools(版本:1.15.1)進(jìn)行二進(jìn)制格式轉(zhuǎn)換和排序。使用PICARD(版本:2.2.1)軟件標(biāo)記重復(fù),去除聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR) 重復(fù)。使用GAKT(版本:4.0)進(jìn)行變異檢測(cè)。使用Annova進(jìn)行功能注釋。

(2)全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù):使用Trimmomatic(版本:0.39)用于輸入Fasta序列進(jìn)行成對(duì)匹配和篩選,去掉測(cè)序接頭。使用HISAT2(版本:HISAT2 2.2.0)對(duì)處理后數(shù)據(jù)讀段進(jìn)行參考基因組比對(duì)。使用SAMtools(版本:1.15.1)進(jìn)行二進(jìn)制格式轉(zhuǎn)換和排序。使用DESeq2(版本:1.40.2)進(jìn)行RNA-seq差異表達(dá)基因分析。對(duì)基因功能和通路分別進(jìn)行基因本體(Gene Ontology,GO)(https://go.princeton.edu/)和京都基因和基因組百科全書(shū)(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)(https://www.kegg.jp/kegg/kegg1d.html)富集通路分析。

2 結(jié)果

2.1 WES檢出ADAM15基因非同義SNV

首先對(duì)4例癌組織及2例癌旁組織進(jìn)行2×150 bp雙端WES,篩選外顯子區(qū)域SNV,平均每例樣本攜帶24 212個(gè)變異,其中平均攜帶同義變異(synonymous SNV)11 981個(gè),非同義變異(nonsynonymous SNV)11 709個(gè),插入缺失(In/Del)395個(gè),無(wú)義變異(stop gain)115個(gè),以及終止缺失變異(stop loss)11個(gè)(圖1A表示每個(gè)樣本不同類(lèi)型變異攜帶數(shù))。

在腫瘤侵襲表型關(guān)聯(lián)基因ADAM15基因中,共計(jì)檢出3個(gè)變異,分別為①非同義變異NM_207194:exon6:c.G484C:p.G162R(T1,N1攜帶);②非同義變異NM_207194:exon6:c.A572C:p.K191T,rs6427128(全部6例樣本均攜帶);③同義變異NM_207194:exon19:c.G2277A:p.K759K(T2,N2攜帶)。其中rs6427128位于ADAM15基因6號(hào)外顯子,位于重復(fù)脯氨酸前體肽Pep_M12B_propep域和ADAM15最關(guān)鍵的結(jié)構(gòu)與金屬蛋白酶Reprolysin域之間(圖1A)。無(wú)獨(dú)有偶,查找公共數(shù)據(jù)庫(kù)TCGA(https://www.cancer.gov/ccg/research/genome-sequencing/tcga)顯示,結(jié)腸癌患者中聚集重復(fù)出現(xiàn)一些ADAM15基因的SNV(圖1A)。

此外,除了SNV的貢獻(xiàn)外,ADAM15基因的表達(dá)量也與預(yù)后潛在相關(guān),分析TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中結(jié)腸癌患者的ADAM15表達(dá)量與生存時(shí)間的關(guān)系,可知,相對(duì)于ADAM15低表達(dá)組,高表達(dá)組的結(jié)腸直腸癌患者在50個(gè)月后的生存率顯著下降(圖1B),但GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中收錄的數(shù)據(jù)又呈現(xiàn)不同趨勢(shì)結(jié)果,如圖1C所示,以“轉(zhuǎn)移”為觀察指標(biāo),相對(duì)于ADAM15低表達(dá)組,同時(shí)期高表達(dá)組的結(jié)腸直腸癌患者的轉(zhuǎn)移率較低,提示該基因與結(jié)腸癌病程具體表型的關(guān)聯(lián)仍需探索。

2.2 細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)顯示ADAM15基因非同義SNV影響腫瘤細(xì)胞的黏附及侵襲功能

2.2.1 Western blotting

用帶有FLAG標(biāo)簽的ADAM15過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至結(jié)腸癌HCT-8細(xì)胞中24 h后,采用Western blotting驗(yàn)證ADAM15的轉(zhuǎn)染效率(圖2A)。

2.2.2 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

利用CCK8法檢測(cè)ADAM15野生型和突變型過(guò)表達(dá)的HCT-8細(xì)胞的增殖能力,發(fā)現(xiàn)相對(duì)于野生型ADAM15,突變型ADAM15過(guò)表達(dá)的HCT-8細(xì)胞的增殖能力并未顯著提高(圖2B)。

2.2.3 細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)

野生型及突變型ADAM15均顯著促進(jìn)了HCT-8細(xì)胞的黏附能力(P<0.000 1);而突變型ADAM15呈現(xiàn)更強(qiáng)的促HCT-8細(xì)胞的黏附能力,相對(duì)于野生型ADAM15增加了26%(P<0.05)(圖2C)。

2.2.4 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)

相對(duì)于空載體,野生型及突變型ADAM15都顯著提高了細(xì)胞的侵襲能力(P<0.001),但rs6427128 SNV變異削弱了ADAM15促細(xì)胞侵襲的能力,相對(duì)于野生型ADAM15降低了80%(P<0.05)(圖2D)。

2.2.5 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,野生型及突變型ADAM15并未促進(jìn)HCT-8細(xì)胞的遷移能力(圖2E)。

2.3 ADAM15基因非同義SNV通過(guò)多種途徑影響結(jié)腸癌細(xì)胞的惡性表型

全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果顯示,與野生型ADAM15細(xì)胞相比,突變型ADAM15細(xì)胞,共計(jì)累積363個(gè)差異表達(dá)基因[log2(Fold Change)>0.585,Padj(FDR)<0.05],其中表達(dá)上調(diào)基因285個(gè),表達(dá)下調(diào)基因78個(gè)(圖3A,3B)。

圖3 ADAM15野生型和突變型細(xì)胞系轉(zhuǎn)錄組分析Fig.3 Transcriptome analysis of wild-type and mutant ADAM15 cell lines

GO分析顯示,差異基因群分別富集在185條生物學(xué)過(guò)程(biological process,BP)、29條分子功能(molecular function,MF)及22條細(xì)胞組分(cellular component,CC)相關(guān)通路。在CC的富集分析中,差異基因顯著聚集在細(xì)胞黏附功能相關(guān)通路[Padj(FDR)=0.009 6],而B(niǎo)P分析顯示主要富集在DNA復(fù)制轉(zhuǎn)錄活躍度(Padj(FDR)=0.000 32]及炎癥反應(yīng)[Padj(FDR)=0.003 9]等通路;MF方面顯示主要富集在解旋酶活性[Padj(FDR)=0.000 62]、趨化因子活性[Padj(FDR)=0.002 8]等通路(圖3C)。

KEGG分析結(jié)果顯示,差異基因群主要在27個(gè)通路呈現(xiàn)顯著富集,包括癌癥轉(zhuǎn)錄失調(diào)[Padj(FDR)=0.012]以及細(xì)胞凋亡[Padj(FDR)=0.023]等(圖3D)。

3 討論

ADAM15基因作為ADAM家族中的一員,已經(jīng)被證明在多種癌癥中過(guò)表達(dá),并與預(yù)后不良有關(guān),已有研究[10-11]結(jié)果顯示,異常表達(dá)的ADAM15可能影響結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲和黏附,而ADAM15基因的一些潛在功能性SNV可能影響其蛋白功能。

本研究首先選取已表現(xiàn)出侵襲表型的結(jié)腸癌患者的腫瘤組織和癌旁組織,通過(guò)外顯子組測(cè)序進(jìn)行了全面的遺傳分析。檢測(cè)并關(guān)注到ADAM15基因中的非同義SNV rs6427128。分析在TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)腸癌癌數(shù)據(jù)中收錄的26個(gè)SNV在ADAM15基因上的位置分布可以發(fā)現(xiàn),雖然包括了氨基酸鏈249位置的p. F249L及X249_splice在內(nèi)的8個(gè)位于已知重要功能結(jié)構(gòu)域內(nèi)的變異,但更多的變異是如本研究聚焦的rs6427128一樣,分布在各個(gè)重要功能結(jié)構(gòu)域周邊,這些變異對(duì)ADAM15基因功能的影響需要通過(guò)更有針對(duì)性地設(shè)計(jì)及更細(xì)致的實(shí)驗(yàn)方法重現(xiàn)和解析。因此,本研究揭示的位于重復(fù)脯氨酸前體肽和金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域之間的rs6427128對(duì)細(xì)胞表型的影響為此類(lèi)研究提供了具體實(shí)例及有益提示。

本研究顯示,野生型ADAM15具有增強(qiáng)細(xì)胞黏附和細(xì)胞侵襲的能力,而攜帶ADAM15基因非同義SNV rs6427128,呈現(xiàn)了更強(qiáng)的促進(jìn)腫瘤細(xì)胞黏附的能力,盡管這可能會(huì)犧牲它的一些促侵襲能力。雖然已有文獻(xiàn)[12]報(bào)道在人膀胱癌異種移植模型中,與對(duì)照組相比,敲除ADAM15可抑制45%腫瘤生長(zhǎng)。但本研究結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)野生型或突變型ADAM15,均未顯現(xiàn)增加細(xì)胞增殖能力,提示結(jié)腸癌中過(guò)表達(dá)ADAM15對(duì)細(xì)胞增殖的影響有限。

癌細(xì)胞與腫瘤微環(huán)境之間的相互作用影響腫瘤的進(jìn)展及其對(duì)治療的反應(yīng)。ADAMs家族的重要功能之一,即參與水解及釋放腫瘤微環(huán)境中的可溶性因子和信號(hào)受體。研究[13]表明,在肝細(xì)胞癌組織中,ADAM15高表達(dá)組的通路富集在細(xì)胞凋亡、細(xì)胞黏附通路。數(shù)字空間蛋白質(zhì)檢測(cè)技術(shù)分析野生型和ADAM15敲除的小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞系研究提示,ADAM15敲除可能通過(guò)促進(jìn)免疫細(xì)胞向腫瘤組織的浸潤(rùn),進(jìn)而增加腫瘤細(xì)胞的凋亡[14]。rs6427128 SNV可能通過(guò)影響腫瘤細(xì)胞的黏附能力,影響了結(jié)腸癌細(xì)胞與微環(huán)境中其他細(xì)胞及因子的互作,參與調(diào)節(jié)了腫瘤微環(huán)境的改變。細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析也顯示,野生型及突變型ADAM15過(guò)表達(dá)HCT-8細(xì)胞的差異表達(dá)基因,除了主要富集在DNA復(fù)制轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞凋亡以及細(xì)胞黏附等腫瘤相關(guān)重要的信號(hào)通路,也在炎癥反應(yīng)相關(guān)通路顯著富集。提示ADAM15基因的非同義SNV可能通過(guò)影響ADAM15的功能,參與了腫瘤微環(huán)境的調(diào)節(jié),影響結(jié)腸癌的進(jìn)展。

然而,需要指出的是,本研究還存在一些不足。首先,研究樣本量相對(duì)較小,未來(lái)需要更大規(guī)模的樣本研究來(lái)驗(yàn)證該發(fā)現(xiàn)。第二,雖然本研究選取了具有侵襲表型的結(jié)腸癌患者腫瘤樣本進(jìn)行WES,并檢出了rs6427128位點(diǎn),但細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,與野生型相比,rs6427128可能在結(jié)腸癌的黏附中發(fā)揮了重要作用,但不具備對(duì)腫瘤侵襲能力的促進(jìn)作用,這些結(jié)果也說(shuō)明腫瘤的發(fā)生發(fā)展是非常復(fù)雜的,其在體的侵襲表型受多基因、多信號(hào)通路,以及細(xì)胞間相互作用、腫瘤微環(huán)境、免疫內(nèi)生態(tài)等多種因素共同調(diào)控。rs6427128的影響可能在特定的條件下才能顯現(xiàn),而體外的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)難以完全模擬腫瘤微環(huán)境。此外,在結(jié)腸癌遺傳影響的研究方面,除了如MLH1、MSH2等一系列錯(cuò)配修復(fù)基因?qū)е碌倪z傳性非聚集性多臟器癌癥綜合征(Lynch綜合征)[15]外,更多的基因通過(guò)多基因致病的模式,以“微效基因”的方式,影響結(jié)腸癌的進(jìn)展。因此,未來(lái)的研究需要更多地關(guān)注到類(lèi)似ADAM15基因rs6427128在結(jié)腸癌整體疾病研究中的潛在價(jià)值。

本研究以具有侵襲表型的結(jié)腸癌患者的腫瘤樣本入手,從遺傳變異的角度出發(fā),提供了有關(guān)ADAM15基因非同義SNV在結(jié)腸癌中的作用機(jī)制的初步線索。ADAM15基因及其SNV rs6427128顯著促進(jìn)了結(jié)腸癌細(xì)胞的黏附和侵襲能力;ADAM15 rs6427128可能通過(guò)促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞黏附,參與調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境重塑,影響結(jié)腸癌的進(jìn)展。未來(lái)的研究需要更多地關(guān)注到類(lèi)似ADAM15基因rs6427128這樣的“微效基因”在結(jié)腸癌整體疾病研究中的潛在價(jià)值。以期為結(jié)腸癌患者的個(gè)體化診斷和治療提供更多的選擇,以改善結(jié)腸癌患者預(yù)后。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明王晶:實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)獲取、分析,論文撰寫(xiě);賀禮兵:實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)獲取、分析;張國(guó)燕:數(shù)據(jù)分析;劉筱涵:實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)獲取;程杉:研究命題的提出、設(shè)計(jì)。