慢性阻塞性肺疾病相關性氣管支氣管軟化癥模型建立及評價

李雪蓮 余薇 周鵬程

(1四川省第二中醫醫院急診科,四川 成都 610031;成都中醫藥大學 2臨床醫學院;3附屬醫院呼吸內科)

世界衛生組織關于病死率和死因的預測數字顯示,在未來40年里慢性阻塞性肺疾病(COPD)的患病率將繼續上升,預測至2060年死于COPD及相關疾病的患者數超過540萬/年〔1～3〕。COPD相關流行病學數據顯示,我國患者數約1億〔4〕,40歲以上人群患病率高達13.7%,且發生急性加重平均為0.5～3.5次/年〔5〕,24.4%～24.8%的患者處于極高經濟風險,因其年人均疾病經濟負擔高達20 107.58元〔6〕。氣管支氣管軟化癥以反復肺部感染、呼吸衰竭和肺功能加速惡化為主要表現,可導致猝死,危害巨大。其病因主要為慢性炎癥,病理改變為氣道軟骨壞死或變性,從而使管壁失去支撐作用,因此氣管管腔隨胸內外壓力改變及呼吸運動呈動態性狹窄〔7〕。目前研究顯示 COPD 是導致氣管支氣管軟化癥最常見的危險因素之一〔8,9〕,同時氣管支氣管軟化癥也可加速 COPD 病情進展,增加患者死亡等風險。近年來,針對絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)信號通路的研究發現,p38MAPK信號通路在關節軟骨的破壞中處于一個樞紐地位,與軟骨炎性細胞因子、軟骨細胞凋亡的產生等都有密切關系〔10〕。本研究探討COPD相關性氣管支氣管軟化癥模型構建方法,并評價了p38MAPK抑制劑的作用效果。

1 材料與方法

1.1實驗動物 Wistar大鼠12只,雄性,8周齡,體質量230～270 g,SPF級,購于遼寧長生生物技術股份有限公司,許可證號SCXK(遼)2020-0001。

1.2試劑、耗材及儀器 脂多糖(Lot.No.426Y0-39,北京索萊寶科技有限公司);伊紅染色液(G1100,Solarbio);超凈高級封片膠(YZB,BASO);Scott藍化液(G1865,Solarbio);DMEM/F-12,GlutaMAXTM(10565018,Gibco);胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(EDTA)消化液(T1300,Solarbio);青鏈霉素混合液(100X)細胞培養專用(P1400,Solarbio);胎牛血清(FBS,E600001-0500,BBI Life Sciences);Ⅱ膠原酶(C8150,Solarbio);白細胞介素(IL)-1β(LC13AP1902,SB);SB203580(GC13595,GLPBIO);CCK-8法細胞增殖檢測試劑盒(KGA317,凱基生物);軟骨染色液(甲苯胺藍法;8101A16,LEAGENE);Ⅱ型膠原(AF-1035,Affinity);辣根酶標記山羊抗兔IgG(H+L;ZB-2301,中杉金橋);二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑盒(CW0125,CWBIO);中性樹脂(CW0136,CWBIO);蘇木素染液(AR1180-1,博生德);Collagen Ⅱ(ab188570 abcam);HiScript Ⅱ Q RT SuperMix for熒光定量聚合酶鏈反應(qPCR,+gDNA wiper;R223-01,Vazyme 諾唯贊);2×SYBR Green PCR Master Mix(A4004M,Lifeint 生命互聯);miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit(by stem-loop;MR101-02,諾唯贊);miRNA Universal SYBR qPCR Master Mix(MQ101-02,諾唯贊);RIPA細胞裂解液(C1053,北京普利萊基因技術有限公司);二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒(CW0014S,康為世紀);30% 丙烯酰胺(A1010,Solarbio);內參一抗:Mouse Monoclonal Anti-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH;TA-08,中杉金橋,1/2 000);二抗:辣根酶標記山羊抗鼠IgG(H+L;ZB-2305,中杉金橋,1/2 000),目的一抗:兔抗caveolin-1(ab32577,Abcam,1/1 000),兔抗p-p38MAPK(af4001,Affinity,1/500),兔抗腫瘤壞死因子(TNF)-α(af7014,Affinity,1/500),兔抗IL-1β(af5103,Affinity,1/500),兔抗基質金屬蛋白酶(MMP)-13(af5355,Affinity,1/500),兔抗B細胞淋巴瘤(Bcl)-2相關X蛋白(Bax;50599-2-lg,Proteintech,1/5 000),兔抗Bcl-2(bs-34012R,Bioss,1/500);二抗:辣根酶標記山羊抗兔IgG(H+L;ZB-2301,中杉金橋,1/2 000)。

隔膜真空泵(GM-0.5A,天津市津騰實驗設備有限公司);顯微鏡(CX41 OLYMPUS);切片機(2235,Leica);CO2培養箱(BPN-80CW,上海一恒科學儀器有限公司);倒置熒光顯微鏡(MF53,廣州市明美光電有限公司);全自動酶標(WD-2102B、蛋白垂直電泳儀(DYY-6C,北京市六一儀器廠);超高靈敏度化學發光成像系統〔Chemi DocTM XRS+,伯樂生命醫學產品(上海)有限公司〕。

1.3COPD大鼠模型建立 實驗分為空白對照組、COPD模型組。每組隨機分配6只大鼠,COPD模型組在飼養第1、8、15、22天用10%水合氯醛按照3 ml/kg的比例腹腔注射麻醉,頸部剃毛,碘伏消毒頸部皮膚,用手術剪剪開頸部皮膚,鈍性分離頸部肌肉,暴露氣管,用1 ml注射器刺入氣管,緩慢注入0.2 ml脂多糖(LPS)溶液,注射完將大鼠直立旋轉1 min,使藥液在肺部均勻分布,肌肉和皮膚分別縫合,縫合完畢后碘伏消毒。在前4 w每天放入染毒箱被動吸煙30 min(給藥當天不用吸煙),在第5～10周隔天放入染毒箱被動吸煙30 min,按照6只大鼠每天8只香煙的比例吸煙。空白對照組采用相同方法在氣管內滴入等量生理鹽水,正常飼養不予煙熏。

1.4COPD大鼠模型鑒定 麻醉大鼠后取肺組織,生理鹽水沖洗后,使用甲醛溶液固定,再取出組織,流水沖洗數小時,先后予70%、80%、90%各級乙醇脫水,純酒精、二甲苯(1∶1)混合液15 min,二甲苯Ⅰ 15 min、Ⅱ 15 min,將透明的肺組織放入石蠟、二甲苯(1∶1)的混合液15 min,再用石蠟Ⅰ透蠟50～60 min、石蠟Ⅱ透蠟50～60 min。然后依次進行石蠟包埋、切片、烤片、脫蠟、水化,再使用蘇木素水溶液染色3 min,鹽酸乙醇分化液分化15 s后,水洗,返藍15 s,流水沖洗,伊紅染色3 min,再依次進行流水沖洗、脫水、透明、封片、鏡檢。

1.5氣道軟骨細胞分離 將模型組斷頸處死后,采用75%酒精浸泡3 min,無菌取下大鼠的氣管及左右主支氣管,放在75%酒精浸泡10 s,取出用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗兩遍,在體視鏡下取出支氣管軟骨,并剪成1 cm×1 cm大小的軟骨塊,1 000 r/min離心3 min,棄去上清,用0.2%Ⅱ膠原酶過夜消化,次日棄去上清,在加入0.2%Ⅱ膠原酶37 ℃消化30 min,之后加入完全培養基終止消化,1 000 r/min離心3 min,棄去上清加入新鮮配制的培養基,重懸組織塊,接種到培養瓶中進行培養。

1.6氣管軟骨細胞鑒定 采用甲苯胺藍染色和免疫組織化學鑒定氣道軟骨細胞。去除培養基,加入PBS,清洗3次(5 min/次),于軟骨染色液中浸染15～20 min(根據細胞量的多少而定),自來水清洗2 min,吸干,加入丙酮,至紫藍色軟骨細胞清楚可見,逐級乙醇脫水,封片,鏡檢。在培養板中用PBS浸洗已爬好細胞的培養皿,再用4%的多聚甲醛固定15 min,細胞通透打孔后,加入新鮮配制的3% H2O2,室溫孵育10 min,PBS充分淋洗,非特異性封閉后,用移液槍吸干培養皿中的封閉液后,在每個培養皿中滴加足夠量的按1∶200比例稀釋好的一抗:Ⅱ膠原,然后放入濕盒中,4 ℃孵育過夜,次日取出在室溫靜置45 min,PBS浸洗玻片3次(5 min/次),滴加聚合辣根酶標記抗兔IgG二抗工作液,37 ℃孵育30 min,再次PBS充分淋洗,顯色復染后脫水、透明、封片、鏡檢。

1.7CCK8法篩選傳代軟骨細胞及P38MAPK抑制劑(SB203580)劑量 將原代軟骨細胞傳代至1代,2代,3代,4代的細胞消化、重懸,計數,鋪板,細胞密度為3×103個/孔;分別在0、1、2、3、4、5 d進行CCK8檢測,待測細胞均更換為相同的培養基(100 μl/孔);每孔加入10 μl CCK8 試劑后,于培養箱中孵育2 h;用酶標儀在450 nm波長處檢測每孔的吸光度(OD)值,經過數據分析繪制細胞生長曲線,并選擇其中一代細胞進行后續實驗。將篩選得到的傳代支氣管軟骨細胞消化、重懸,計數,鋪板,細胞密度為5×103個/孔;待細胞貼壁后,加入不同劑量的SB203580(5、10、20、30 μmol/L),繼續傳代培養,分別在15、24、48 h進行CCK8檢測。將待測的96孔板細胞的培養基換成每孔100 μl的相同培養基;加入CCK8(10 μl/孔)試劑,置于培養箱中孵育2 h,在450 nm波長處檢測每孔的OD值,經過數據分析確定傳代軟骨細胞、SB203580劑量,用于后續實驗。

1.8建立COPD相關性氣管支氣管軟化癥(TBM)模型 將篩選出的傳代軟骨細胞培養至狀態良好,實驗分為對照組、模型組、P38MAPK抑制劑(SB203580)組。對照組用含1% FBS的血清培養基干預軟骨細胞48 h;模型組用含1% FBS的血清培養基、10 ng/ml IL-1β干預軟骨細胞48 h;SB203580組加入SB203580處理30 min,再以含1% FBS的血清培養基、10 ng/ml IL-1β干預軟骨細胞48 h。

1.9檢測細胞凋亡率 收集細胞(1×106～3×106個),加入1 ml的PBS,1 500 r/min離心3 min,清洗兩遍后,用雙蒸水將5×結合緩沖液稀釋為1×結合緩沖液,然后取300 μl預冷的重懸細胞,每管各加入5 μl的膜聯蛋白Ⅴ-異硫氰酸熒光素(Annexin Ⅴ-FITC)和10 μl的碘化丙啶(PI),輕微混勻,室溫下避光孵育10 min,再加入預冷的1×結合緩沖液200 μl/管,混勻,采用流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.10Western印跡檢測 將各組培養皿中的細胞培養液棄掉,加入細胞裂解液(100 μl/孔),放置于冰上20 min,將細胞刮至一側,EP管做好標記后,采用移液槍將細胞吸入EP管中。以12 000 r/min離心10 min,將上清液取出,移至新的EP管中,在-20 ℃下保存總蛋白。BCA試劑盒測定蛋白濃度,蛋白變性,進行1.5 h的十二烷基苯磺酸鈉凝膠電泳(SDS-PAGE),然后再進行1.5 h的300 mA恒流轉膜。用聚偏氟乙烯(PVDF)膜孵育一抗,在4 ℃條件下過夜,次日在室溫下用PVDF膜孵育二抗2 h,洗膜,然后用發光液浸濕,采用超高靈敏度化學發光成像系統顯影成像。

1.11qPCR分析 收集各組細胞于培養皿中,加入Trizon Reagent(1 ml/皿)后,加入0.2 ml氯仿,分別采用miRNA提取試劑盒和mRNA超純提取試劑盒提取miRNA、mRNA,紫外可見分光光度計測定miRNA和mRNA的濃度和純度(OD260/OD280),通過miRNA逆轉錄試劑盒合成micDNA、mRNA逆轉錄試劑盒合成cDNA,然后定量PCR。反應體系如下:10 μl 2×SYBR Green PCR Master Mix或10 μl miRNA Universal SYBR qPCR Master Mix、1 μl cDNA、0.4 μl上游引物、0.4 μl下游引物、8.2 μl雙蒸水RNase Free d H2O 。反應步驟如下:10 min 95 ℃預變性;10 s 95 ℃變性;30 s 58 ℃退火;30 s 72 ℃延伸;以上進行40個循環。內參為β-actin,根據2-△△Ct法計算基因的相對表達量。見表1。

表1 引物名稱及序列

1.12統計學分析 采用SPSS23.0軟件進行單因素方差分析和LSD分析。繪圖采用GraphPad Prism9軟件,Adobe Photoshop CS6軟件用于合成組圖,各條帶灰度值采用Image Pro Plus軟件分析。

2 結 果

2.1COPD大鼠模型鑒定 HE染色結果顯示:對照組支氣管管腔圓闊,無壞死細胞,肺泡結構整齊,肺泡間隔無增厚,未見明顯炎癥細胞浸潤;模型組支氣管管腔明顯增厚,管腔狹窄,纖毛上皮細胞變性壞死脫落,肺泡間隔增寬,結構融合或紊亂,可見大量巨噬細胞、淋巴細胞、中性粒細胞等炎癥細胞浸潤。見圖1。表明COPD大鼠模型構建成功。

圖1 兩組肺組織病理結構(HE染色,×100)

2.2氣管軟骨細胞鑒定 甲苯胺藍染色和免疫組化分析結果顯示:經甲苯胺藍特異性染色后細胞周圍有少量淺藍色異染顆粒,胞質呈紫藍色,細胞核呈深藍色;Ⅱ型膠原免疫組織化學分析中胞質被染成棕黃色,可見黃褐色顆粒,細胞外也可見到棕黃色,提示有Ⅱ型膠原的合成,表明分離得到的細胞為支氣管軟骨細胞。見圖2。

圖2 COPD大鼠支氣管軟骨細胞(×400)

2.3傳代軟骨細胞篩選 倒置顯微鏡下顯示,氣管軟骨分離、消化和培養后,3～5 d內逐漸從軟骨組織塊邊緣長出為多角形或三角形的原代軟骨細胞,胞核為圓形或橢圓形,位于胞體中心,1～3個核仁,胞質豐富,隨著細胞生長可見細胞成簇現象和重疊生長現象,細胞增殖明顯,細胞間開始有突起相連,周圍有基質樣物質沉積,細胞保持圓形或橢圓形生長狀態,單層生長,約1 w鋪滿培養瓶。傳代后,第1代軟骨細胞貼壁時間較原代縮短,一般24 h即可完全貼壁。第2代軟骨細胞生長狀態較好,增殖較快,接種6 h后即可見部分細胞已經貼壁,4～5 d后即可達到90%細胞匯合,細胞大小一致,呈多角形,胞質多,胞體大,核仁2～3個。第3～4代軟骨細胞生長平穩,大約第4天即達到平臺期;傳至第5代及以后,軟骨細胞生長十分緩慢,多為長梭形,體積肥大伴較多空泡改變,邊界不清,稀疏平鋪培養瓶壁上。見圖3。大鼠支氣管軟骨細胞生長曲線顯示,第1、2代細胞在培養前4 d OD值增長迅速,而后變平穩,第3、4代整體的增長趨勢較為平穩,且第4代的OD450略高于第3代,最終確定選擇第4代細胞用于下一步實驗。見表2。

圖3 大鼠支氣管軟骨細胞傳代(×100)

表2 不同時間傳代骨細胞生長OD值

2.4COPD相關性TBM軟骨細胞模型鑒定 COPD大鼠模型制備成功后,分離并培養氣管軟骨,將IL-1β加入第4代軟骨細胞誘導細胞退變,以此建立COPD相關性TBM模型,對照組僅以1% FBS的血清培養基干預。結果顯示:倒置顯微鏡下,對照組細胞生長平穩,4～5 d即可鋪滿瓶底,細胞呈多角形,胞質多,胞體大,大小較一致;模型組細胞生長速度減慢,一般要9～10 d才能長滿瓶底,細胞變狹長,多為單層生長,胞質內可見大量空泡,細胞形態不規則。甲苯胺藍特異性染色后,對照組細胞核染成深藍色,胞質呈紫藍色,細胞形態規則,核仁清晰,以1～3個核仁多見,細胞周圍也可見淺藍色異染顆粒;模型組中染色淺而稀疏,細胞形態不規則,僅殘存的軟骨細胞及簇集的細胞核藍染。免疫組織化學分析顯示:對照組胞質呈棕黃色,見較多黃褐色顆粒,細胞外也被染成棕黃色,提示有Ⅱ型膠原的合成;模型組顯示胞質黃褐色顆粒型稀疏,提示Ⅱ膠原含量明顯降低。以上表明IL-1β成功誘導了COPD模型中軟骨細胞退變,從而建立COPD相關性TBM軟骨細胞模型。見圖4、表3。

圖4 COPD相關性TBM細胞模型鑒定

表3 不同劑量SB203580處理對氣管軟骨細胞增殖活性的影響

2.5不同劑量SB203580篩選 與0 μmol/L濃度SB203580相比,5 μmol/L處理的細胞活性顯著升高(P<0.05),且細胞活性在15、24、48 h時均最高,且在處理48 h時提高細胞活性作用更明顯。因此選定5 μmol/L濃度SB203580處理48 h進行下一步實驗。

2.6SB203580對細胞凋亡和增殖活性的影響 流式凋亡檢測顯示:模型組凋亡率顯著高于其他組。SB203580處理后凋亡率顯著低于模型組。見圖5。CCK8檢測顯示:模型組細胞增殖率〔(101.09±2.27)%〕顯著低于SB203580組〔(124.37±4.55)%,P<0.05〕。以上表明SB203580處理可以顯著降低細胞凋亡,增強細胞活性。

圖5 3組SB203580影響細胞凋亡

2.7Western印跡檢測caveolin-1-p38MAPK信號通路中蛋白表達 模型組caveolin-1、p38MAPK、MMP-13、1L-1β蛋白表達水平均顯著高于對照組,SB203580處理后能顯著降低上述蛋白表達水平(P<0.05)。以上表明在COPD相關性TBM細胞模型中,IL-1β激活了caveolin-1-p38MAPK信號通路,而SB203580處理可有效抑制caveolin-1-p38MAPK信號通路中caveolin-1、p38MAPK、MMP-13、1L-1β蛋白表達。見表4。

表4 各組caveolin-1-p38MAPK信號通路中相關蛋白及基因表達

2.8qPCR檢測caveolin-1-p38MAPK信號通路中基因表達 模型組caveolin-1、p38MAPK、MMP-13、1L-1β mRNA表達水平均顯著高于對照組,SB203580處理后能顯著下調上述基因表達。SB203580處理可以有效抑制caveolin-1-p38MAPK信號通路中MMP-13、p38MAPK、caveolin-1、IL-1β基因的表達,從而發揮軟骨保護作用。見表4。

3 討 論

氣管支氣管軟化癥按病因不同分為先天性和繼發性。先天性氣管支氣管軟化癥多見于早產兒,其中男性患兒多見,常由氣道軟骨發育異常造成〔11,12〕。目前認為COPD是繼發性氣管支氣管軟化癥最常見的危險因素之一,多數學者認為與COPD持續的氣道炎癥、肺氣腫彈性纖維減少和慢性咳嗽產生的氣道壓力改善等因素有關,但其誘導氣管支氣管軟化癥的機制仍舊不明〔13〕。

臨床上并非所有COPD都合并有氣管支氣管軟化癥,因此需要建立一種穩定且理想的COPD相關性氣管支氣管軟化癥模型,在前期研究中本團隊通過在香煙提取物刺激離體氣管軟骨細胞基礎上加入IL-1β誘導軟骨細胞退變,成功建立了一種造模方法〔14〕。盡管試驗證實它能較好的模擬COPD相關性氣管支氣管軟化癥的病理過程。盡管研究顯示COPD造模方法有很多,如LPS或蛋白酶氣管滴入、煙熏、基因水平造模等〔15～17〕,但目前認為采用多因素聯合的方式進行COPD造模更為符合人類 COPD 病理改變及特征變化,其中煙熏聯合氣管內滴入LPS是主要的方法之一〔18～20〕。因此,本課題組采用氣管內滴入LPS加煙熏的方法建立COPD相關性氣管支氣管軟化癥模型〔21～23〕,研究結果證實該方法穩定可靠,與前期研究結論一致。

研究表明,氣管支氣管軟化是由于具有支撐氣道作用的軟骨退化所致,并且在晚期軟骨環還可被吸收形成膜性組織〔24〕。研究發現 p38MAPK 信號通路在關節軟骨的破壞中處于一個樞紐地位〔10〕。p38MAPK 是一種分子量為38 kD的絲裂原活化蛋白激酶,會參與細胞的生長、分化、退變、衰老及凋亡等多種生理病理過程〔25〕。本研究結果表明,p38MAPK信號通路參與了COPD氣管軟骨細胞退變和損傷過程。現在認為caveolin-1與肺氣腫、COPD和骨關節炎等衰老性疾病密切相關〔26〕。caveolin-1 蛋白是p38MAPK信號通路上游的關鍵信號分子〔27〕。本研究結果表明,caveolin-1通過激活p38MAPK信號參與了COPD氣管軟骨細胞退變。

MMP-13是降解軟骨細胞外基質(ECM)的主要酶,通過對Ⅱ型膠原的不可逆降解,從而破壞關節軟骨〔28〕。有研究表明,IL-1β等激活p38MAPK,磷酸化的p38MAPK可以激活活化劑蛋白-1,活化的活化劑蛋白-1可以與MMP-13等相應基因啟動區相結合,從而啟動MMPs過表達,MMPs 的表達增加導致軟骨膠原的降解加強〔29,30〕。本研究表明,IL-1β激活了caveolin-1-p38MAPK信號通路,從而上調下游效應因子MMP-13表達,加重軟骨細胞的破壞。