經腎動脈移植骨髓間充質干細胞對慢性腎臟病大鼠細胞程序性壞死的影響

馬逸群 周新軍 許華 趙志友 馬永剛 王家平 陳士新

(1漢中市三二〇一醫院影像科,陜西 漢中 723000;2昆明醫科大學第二附屬醫院影像科)

程序性壞死屬于細胞程序性死亡的方式之一,是一種不依賴于半胱按酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)的細胞死亡途徑,可通過受體相互作用蛋白(RIP)1、受體相互作用蛋白(RIP)3與混合連接激酶結構域樣蛋白(MLKL)的活化啟動和調控促使細胞向凋亡、壞死或存活等不同發展方向〔1,2〕。研究表明,程序性壞死參與了慢性腎臟病(CKD)的過程,且其表達程度與CKD的嚴重程度呈正相關,故抑制程序性壞死的進程是一種有效的治療CKD的策略〔3～5〕。隨著再生醫學的發展,干細胞研究對CKD的治療提供了新的思路和方法。干細胞治療CKD時,不同移植途徑、次數和劑量對治療效果不同〔6〕。實驗證明,骨髓間充質干細胞(BMSCs)可通過分化和旁分泌作用對受損的靶組織進行修復,且經腎動脈移植干細胞的治療效果優于外周靜脈,但干細胞治療CKD時對程序性壞死相關蛋白及炎癥因子之間的關系尚不明確。本實驗建立CKD大鼠模型,將BMSCs經腎動脈移植入大鼠體內,探討其對CKD大鼠細胞程序性死亡的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物 34只SPF級雄性SD大鼠由昆明醫科大學實驗動物中心提供。選取2只6周齡大鼠〔體質量(150±10)g〕為BMSCs供體。32只10周齡〔體質量(200±15)g〕大鼠用于實驗,選取16只建立CKD模型并隨機均分為慢性腎臟病(B)組和BMSCs治療(C)組;剩余16只健康大鼠隨機均分為正常對照(N)組和培養基對照(A)組。操作過程符合動物倫理學標準。

1.2試劑及儀器 培養基(美國Gibco公司)、胎牛血清(FBS)、磷酸鹽緩沖液(PBS)、青鏈霉素、胰蛋白酶-0.25%乙二胺四乙酸(EDTA;均為美國Gibco公司);阿霉素(美國Sigma公司);anti-RIP1、anti-RIP3、anti-p-MLKL、anti-caspase8(均為英國Abcam公司);β-actin(武漢ABclonal公司);離心管、細胞培養瓶(無錫NEST公司);CKX41倒置相差顯微鏡(日本Olympus 公司);CO2培養箱(美國Thermo公司)。

1.3BMSCs的培養 選取2只6周齡大鼠〔體質量(150±10)g〕于清潔環境下脫頸椎處死、備皮,用75%酒精浸泡5 min后移至無菌間剪開雙側腿部皮膚,鈍性分離肌肉組織,完整取出雙側股骨及脛骨。剪斷長骨兩端的干骺端,充分暴露骨髓腔,用注射器吸取提前配制好的含有雙抗(100 U/ml青霉素+0.1 mg/ml鏈霉素)和抗凝劑的L-DMEM反復沖洗骨髓腔,直至沖洗液變澄清。收集BMSCs懸液于50 ml離心管中,室溫下以1 000 r/min離心5 min。將最終獲得的細胞團沉淀移入無菌操作間,于超凈工作臺中舍棄上清液,向細胞沉淀中加入5 ml完全培養液,用無菌玻璃吸管反復吹打重懸細胞;將細胞懸液接種在塑料培養瓶中并于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的恒溫培養箱中孵育。24 h后首次更換細胞培養液后每3～4 d換液1次。待其生長融合至80%～90%時按照1∶3傳代。取P4-P6 BMSCs備用。

1.4CKD模型制作與分組 選取32只10周齡大鼠〔體質量(200±15)g〕,按照文獻〔7〕采用2次尾靜脈注射阿霉素的方法將其中16只大鼠建立CKD模型后隨機均分為兩組:慢性腎臟病(B)組,不接受BMSCs移植;BMSCs治療(C)組經腎動脈移植BMSCs;剩余16只未注射阿霉素的健康大鼠隨機均分為兩組:正常對照(N)組不接受任何處理與治療;培養基對照(A)組不接受BMSCs的移植,僅在C組移植BMSCs的同時經腎動脈途徑注射相等劑量的L-DMEM培養基。

1.5各組處理方法 于第2次尾靜脈注射阿霉素8 w后,取傳代至P4-P6、生長至融合80%～90%的BMSCs,用L-DMEM培養基將BMSCs稀釋至2×106/ml,將細胞懸液分別收集于8支1.5 ml EP管中,每支0.5 ml,于-4 ℃保存。B組麻醉后仰臥位固定,備皮、消毒,用超聲探頭沿腹主動脈找到左腎動脈分叉處,在超聲引導下以胰島素針吸取BMSCs懸液經皮穿刺至左腎動脈分叉處,針尖斜端朝向腎動脈,確定無外漏后注射BMSCs 0.5 ml,術后將大鼠送回飼養籠中單只飼養。A組采用上述方法注射同等劑量的L-DMEM培養基。N組與C組不做任何處理。

1.6血、尿生化的收集與檢測 移植BMSCs后第1周末將各組大鼠置于單只代謝籠內,收集24 h尿液并行尾靜脈采血,用全自動生化儀檢測血尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)與24 h尿蛋白。

1.7腎臟病理檢測 將各組大鼠脫頸處死,以劍突為起點沿左右兩側肋下緣剪開皮膚與肋骨,充分暴露心臟,用眼科剪剪開右心耳,持50 ml注射器吸取生理鹽水從左心室入針反復灌注,直至流出液變澄清后完整取出左腎,沿縱軸將腎臟剖開并放入4%的多聚甲醛溶液中固定,梯度脫水后石蠟包埋。將蠟塊放置于切片機上,調整厚度為4 μmol/L并切片。獲得切片后貼于載玻片中,干燥并標記。將切片入蘇木素染液3～5 min,清洗、分化、反藍后再次清洗,梯度酒精脫水后放入伊紅染液5 min,脫水、封片后放于顯微鏡下觀察并采集圖像。按照文獻〔8〕所述,于400倍視野下對腎組織損傷程度進行評分。

1.8腎臟Masson染色 將組織切片放入重鉻酸鉀中浸泡過夜,用自來水清洗后放入鐵蘇木素染液中3 min,清洗、分化、反藍后放入麗春紅酸性品紅中浸染5 min,清洗后再放入磷鉬酸水溶液中浸染3 min,直接放入苯胺藍染液中3～6 min。分化、脫水、透明后中性樹脂封片并采集圖像。

1.9腎臟免疫組化檢測 將組織切片脫蠟后放入盛有枸櫞酸鹽緩沖液的燒杯內,之后放入微波爐內加熱沸騰10 min修復抗原,冷卻后用羊血清于室溫下孵育1 h,之后直接甩去羊血清,滴加一抗:RIP1(1∶150)、RIP3(1∶150),4 ℃過夜。次日用PBS清洗3次,每次5 min,并向免疫試劑盒中滴加二抗室溫孵育1 h,PBS清洗后滴加辣根過氧化物酶(HRP)標記的親和素室溫下孵育15 min。配制適當體積的二氨基聯苯胺(DAB)顯色液滴加于切片上,于顯微鏡下觀察樣本的顯色情況,染色深度合適后,將切片放置于自來水中終止顯色過程,記錄所需顯色時間,脫水、封片后采集圖片。

1.10Western印跡檢測 將各組大鼠腎臟取出后置于冰上切成小塊,取適量放入1.5 ml EP管中,加入RIPA裂解液、蛋白磷酸酶抑制劑與蛋白酶抑制劑,反復研磨EP管中腎組織直至成為絮狀物,置于冰上靜置30 min使組織充分裂解。按照10 000 r/min離心5 min,取上清并用二喹啉甲酸(BCA)法計算蛋白濃度。將制膠的玻璃板于制膠架上固定,根據試劑盒說明書配制分離膠,加入改良促凝劑并混合均勻,將配制好的分離膠加入玻璃板間,并用異丙醇進行壓膠,使液面水平。室溫靜置20 min后,觀察異丙醇與分離膠之間出現明顯分界線,倒掉上層異丙醇并用濾紙吸干。之后配制濃縮膠,混勻后加到分離膠上層,室溫靜置30 min。將配制好膠的玻璃板固定于電泳槽中,倒入適量電泳液,用60 V電壓電泳30 min,待各組條帶進入分離膠后,調節電壓至90 V繼續電泳1.5 h。取出分離膠,于4 ℃環境下用300 mA直流電轉膜45 min后停止。根據目的蛋白分子量大小按照marker刻度切下條帶,脫脂牛奶封閉后與4 ℃孵育抗體過夜并顯影。

1.11統計學分析 采用SPSS18.0軟件進行重復測量方差分析、LSD-t法、秩和檢驗。

2 結 果

2.1血、尿生化檢測 B組與C組BUN、Scr、24 h尿白蛋白總量均明顯高于N組(P<0.001)。經BMSCs移植治療后C組各項數據均有所改善,其中Scr與24 h尿蛋白相對B組下降明顯(P<0.05),而BUN相對于B組無統計學差異(P>0.05)。見表1。

表1 移植BMSCs后各組BUN、Cr、24 h尿蛋白的比較

2.2腎臟病理 N組腎固有細胞及間質細胞未見明顯異常;A組少數腎小球毛細血管袢擴張,未見腎小管萎縮或擴張,間質內炎細胞較少;B組可見較多腎小球硬化,腎小管上皮細胞空泡變性,系膜細胞和基質不同程度增生,部分腎小球毛細血管袢閉塞,間質內可見大量炎細胞浸潤;C組部分腎小球出現局灶節段性硬化,個別腎小球粘連,部分腎小管上皮細胞再生,間質內炎細胞浸潤。見圖1。

圖1 各組腎臟病理學(HE染色,×400)

2.3腎臟病理切片Masson染色檢測 N組腎固有細胞與腎間質未見明顯異常,腎組織內無藍染區域;A組腎小球硬化與腎小管擴張較少見,偶可見腎小管內蛋白管型,Masson染色未見明顯藍染區域;B組出現較多腎小球硬化、腎小球系膜區增寬,球囊區粘連,腎小管明顯擴張,擴張的腎小管內可見蛋白管型,間質內出現大量炎性細胞浸潤,腎小球、腎小管及腎間質內均出現大片狀藍染區域;C組萎縮與擴張的腎小管并存,部分腎小球呈節段性硬化,腎間質內炎性細胞較少,Masson染色腎小球呈藍染,腎間質藍染區面積較B組明顯減小。見圖2。

圖2 各組腎組織(Masson染色,×400)

2.4腎臟免疫組化 移植BMSCs后于第1周末檢測各組大鼠腎組織RIP1、RIP3表達,鏡下觀察到棕色顆粒為陽性細胞。N組與A組腎組織內幾乎無陽性表達;B組見大量陽性細胞呈棕色顆粒狀,RIP1、RIP3表達均明顯高于N組與A組;經BMSCs移植后,C組RIP1、RIP3表達均較B組有所降低,且以RIP3表達下降較為明顯。見圖3。

圖3 各組腎組織(免疫組化,×400)

2.5Western印跡檢測 與N組相比,B組腎臟RIP1、RIP3、p-MLKL蛋白表達均明顯上調,caspase8表達明顯下降(P<0.05)。移植 BMSCs治療后,C組RIP1、RIP3及p-MLKL蛋白表達較B組顯著下調,而caspase8表達較B組又明顯上調(P<0.05)。而N組與A組相比各項數據無顯著差異(P>0.05)。見圖4、表2。

圖4 各組RIP1、RIP3、caspase8、p-MLKL蛋白表達

表2 各組RIP1、RIP3、caspase8、p-MLKL蛋白表達

3 討 論

多年來,壞死一直被認為是偶然的、不受機體調控的、由環境應激所引起的細胞死亡方式〔9～12〕,直至2005年,人們才發現一種被稱為程序性壞死細胞死亡形式,其過程可通過機體內在的程序來控制〔13〕,在多種急慢性疾病進程中均有程序性壞死參與,CKD也不例外。CKD的進展是一個不可逆的過程,且缺乏有效的治療手段,在一般人群中CKD的死亡率為8%～16%〔14〕,其死亡率與嚴重程度呈正相關〔15〕。隨著再生醫學的發展,干細胞逐漸被應用于生物醫學,為CKD的治療帶來新的希望。BMSCs是一種存在于骨髓及各種間充質中的成體干細胞,作為干細胞家族的主要成員,BMSCs以其易分離性、多能性和無倫理爭議的特點已被應用于組織修復和再生領域〔16〕。現已證明移植入體內的BMSCs可抑制損傷組織中的炎癥反應,同時在多種趨化因子的綜合作用下向靶器官和靶組織遷移并定向分化為相應組織細胞,參與受損器官或組織的修復過程〔17,18〕,且課題組已證明經腎動脈途徑移植BMSCs的歸巢效果優于外周靜脈途徑〔19,20〕,對CKD治療效果更佳。

CKD大鼠腎臟損傷程度可通過Scr、BUN的濃度及24 h尿蛋白反映,CKD過程中腎的濾過功能受損,尿液中檢測的Scr、BUN及24 h尿蛋白含量增高,故血、尿生化檢測對腎臟損傷與腎功能恢復情況有著重要的指導意義。Zhu等〔21〕證實了在CKD過程中,程序性壞死是介導腎損傷的主要機制,及時阻斷程序性壞死可有效改善CKD早期和中期腎功能損傷。本實驗結果提示,BMSCs早期可能是以修復腎小球濾過屏障為主,證實BMSCs可歸巢到受損腎組織,通過分化機制改善腎組織的形態與功能。此外還有學者證明〔22～24〕,干細胞可通過旁分泌作用釋放肝細胞生長因子(HGF)、白細胞介素(IL)-1,基質細胞衍生因子(SDF)-1等因子,減少腎小管上皮細胞的凋亡與程序性壞死,對CKD腎組織進行修復。本實驗結果提示,程序性壞死過程被BMSCs抑制。在CKD期間,腎功能的喪失與腎臟程序性壞死的過程關系密切,證明BMSCs可有效抑制RIP1與RIP3的表達,進而抑制程序性壞死的進展。

慢性腎臟損傷的病理過程包括凋亡、壞死、自噬、炎癥等,有報道證明,程序性壞死在慢性腎臟損傷中扮演著重要的角色,程序性壞死是一種調節性壞死,當caspase8被抑制時,由RIP1與RIP3執行這一過程〔25,26〕,研究表明,程序性壞死在各種腎臟疾病的發病機制中起到至關重要的作用,如急性腎損傷和缺血/再灌注損傷等〔27,28〕。RIP1和RIP3是受體相互作用家族的成員,其激酶活性在程序性壞死過程中起著重要作用。當死亡受體被觸發時,RIP1被募集到死亡受體的信號復合物中,并被多泛素化〔26〕,RIP3是死亡受體誘導的程序性壞死的重要組成成分,RIP1與RIP3在程序性壞死過程中形成胞質內RIP1-RIP3復合物稱為壞死小體,當caspase8被抑制時可引發程序性壞死。還有研究表明,RIP3的關鍵下游分子p-MLKL可以與RIP1與RIP3結合形成RIP1-RIP3-p-MLKL復合物,從而引發程序性壞死〔29〕。本實驗證明,大鼠注射阿霉素后caspase8表達受到抑制并啟動了程序性壞死,驗證了BMSCs可在很大程度上阻止程序性壞死的進程從而對受傷的腎組織進行修復。

綜上,經腎動脈移植BMSCs可降低程序性壞死相關蛋白表達,并對CKD大鼠受損腎形態學起到一定的修復作用,對CKD具有較高的治療價值。但程序性壞死導致CKD的機制較多,其下游炎癥反應及相關蛋白的表達仍需進一步探索。