溫針聯合桃紅四物湯對腰椎骨折大鼠骨愈合能力、骨礦化及Smad4通路的影響

高宇 王曉云 文培培 池紅萬

(鄭州市骨科醫院 1頸肩腰腿痛科Ⅱ,河南 鄭州 450052;2康復醫學科)

脊柱骨折包括頸椎、胸椎、胸腰段及腰椎的骨折,胸腰段最常見〔1,2〕。腰椎骨折是指外傷或病理等原因致使腰段脊柱骨質的完整性或連續性受到破壞,主要有腰部疼痛、腰背部肌肉痙攣、翻身困難等表現〔3〕。腰椎骨折除腰椎損傷外還經常伴有脊髓、馬尾等損傷,致殘率高,但是經過及時治療,多數患者預后較好。造成腰椎骨折的病因較多,暴力外傷是主要原因,有骨質疏松者、腰椎骨腫瘤或結核的患者是主要好發人群〔4,5〕。骨折愈合是一個復雜的過程,主要分為骨損傷早期、肉芽組織形成期、骨痂形成期、板層狀骨痂形成期、重建和塑形期。骨折愈合過程中許多因素如血液循環狀態、組織細胞代謝、骨礦化等多種因素均可影響骨折愈合。其中骨基質礦化是新骨形成的重要環節,骨質疏松、軟骨病等多種骨代謝疾病或骨結構和骨功能的病理狀態均與骨礦化緊密相關〔6,7〕。 Smads蛋白家族是轉化生長因子(TGF)-β1細胞內傳導信號的唯一轉導分子,Smads能夠與其他轉錄分子結合將應答信號由細胞膜轉至細胞核,Smad4是TGF-β1各種信號轉導所需的共同分子。腰椎骨折患者主要通過復位固定方式治療,解除脊髓神經的壓迫,恢復腰胸椎的生理功能。雖然手術復位治療短期效果較好,但是易引發遲發性脊髓及神經的損傷,存在一定的危險性。骨折中醫治療具有副作用小,價格低廉等優點。桃紅四物湯中含有桃仁、紅花、川芎等成分,是活血化瘀的代表方,具有活血化瘀、養血補血的雙重功效〔8〕。有研究表明溫針對骨質疏松錐體壓縮性骨折患者有較好的療效〔9〕。本文探討針灸聯合桃紅四物湯對腰椎骨折大鼠骨愈合能力、骨礦化及Smad4信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1實驗大鼠 45只SD雄性大鼠,由上海雷根生物科技公司提供,體質量190～220 g,分4籠飼養,溫度(22±1)℃,濕度45%～55%,大鼠活動飲水自由,術前禁食12 h,嚴格按照《實驗動物管理條例》規定進行實驗,本實驗經醫院動物倫理委員會審核批準(批準編號為2018011),動物許可證號:SYXK(滬)2019-0036。

1.2藥物、試劑與儀器 桃紅四物湯(桃仁15 g,紅花8 g,熟地黃15 g,當歸10 g,白芍10 g,川芎8 g)中所有中藥從醫院中藥局采購,在醫院中藥局采用傳統煎煮方法,浸泡、過濾、離心、水煎煮,濃縮配置成生藥含量1.0 g/ml的水煎液備用。蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒來自北京索萊寶科技公司;全自動生化分析儀來自廣州市艾貝泰生物科技;低溫離心機來自濟南云騰醫療器械;電針治療儀來自廣州康軒醫療器械;華佗牌銀針來自河北喜樂福醫療器械;磷酸鹽緩沖液(PBS)來自北京伊塔生物科技;蛋白電泳儀來自江蘇博美達生命科學;TGF-β1抗體來自上海博湖生物科技;Smad4抗體來自深圳海思安生物技術;辣根根過氧化物酶標記羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G來自武漢亞科因生物。

1.3分組與模型制備 分組:隨機將45只大鼠分為5組,假手術(CO)組、模型(MO)組、針灸(AC)組、桃紅四物湯(PE)組、聯合(JO)組每組9只。建模:用2%戊巴比妥鈉麻醉大鼠,腹部向下固定,通過大鼠脊柱下段兩側可觸及的一對鈍性突起髖結節,對應腰6錐體,向上一節為腰5錐體,椎體L5部位剃毛備皮3 cm×6 cm、消毒。縱行切開大鼠L5椎體皮膚、暴露腹膜后間隙、分離背闊肌、背最長肌、棘間肌和韌帶、鈍性分離椎前軟組織,暴露L5,從椎體側前方剪斷L5,術后不做內固定,剪斷的椎體斷端骨小梁會因相互擠壓、扭曲而導致L5椎體變短,在多種外力下壓縮成模,術畢用生理鹽水對骨折處進行沖洗,逐層縫合肌肉層、皮下、皮膚,所有操作遵守無菌操作。假手術組只暴露L5部位,不造成腰椎骨折。術后大鼠均肌肉注射青霉素10萬U,治療3 d。

1.4干預方法 建模成功后,AC組大鼠給予溫針,大鼠針灸穴位為主穴:大杼、大椎、命門、懸鐘、膈俞、足三里。用銀針針刺穴位(針刺深度為2～5 mm)后,接電針治療儀,溫度45 ℃,留針30 min,電流100 mA,刺激10 min/次,隔天1次,共28 d。PE組大鼠按成人(體質量70 kg)臨床用量的10倍換算〔10〕,給予桃紅四物湯6 ml/kg灌胃。JO組在PE組的基礎上給予針灸。CO組和MO組均給予等量生理鹽水灌胃。每天給藥和生理鹽水均1次/d,連續給藥28 d。

1.5標本采集及處理 各組大鼠在末次灌胃給藥后禁食12 h,給予2%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)麻醉大鼠,將大鼠固定于潔凈干燥的操作臺上,腹部酒精消毒后,剖開腹部,采腹主動脈取血,血液靜置30 min后,于低溫低速離心機以3 000 r/min,離心15 min,取血清/血漿保存于-80 ℃冰箱中,用于后續鈣和磷水平的檢測。取血后在腰椎骨折處取腰椎組織、脊髓組織放置凍存管內后,放置在液氮內超低溫保存備用。

1.6骨礦化檢測

1.6.1比色法測定血清鈣(Ca)濃度 血清中的Ca離子在堿性溶液中與甲基百里香粉藍結合,生成藍色絡合物,靜置5 min,置于分光光度610 nm波長處,1 cm光徑,空白試管調零,測定吸光度。通過比色之后與同樣處理的鈣標準進行比較,計算出樣品中Ca的含量。計算公式:血清中Ca含量(mmol/L)=測定OD值/標準OD值×標準濃度(2.5 mmol/L)×樣本測定前稀釋倍數。

1.6.2磷鉬酸法測定血清磷(P)濃度 血清中的P和鉬酸發生反應生成磷鉬酸,磷鉬酸被還原成鉬藍,在波長660 nm處被吸收,測定各管吸光度,通過比色可以計算P的含量,計算公式:血清中P含量(mmol/L)=測定OD值-空白OD值/標準OD值-空白OD值×標準濃度(0.5 mmol/L)×樣本測定前稀釋倍數。

1.7檢測堿性磷酸酶(ALP)、骨鈣素(BGP)水平 將血清樣本2 ml放在全自動生化分析儀檢測ALP水平。放射免疫法檢測BGP水平,并嚴格按照說明書操作。

1.8脊髓組織病理學觀察 取大鼠脊髓組織將標本置于4%多聚甲醛液固定24 h,取出已經固定好的組織,梯度酒精脫水,透明,浸蠟包埋、切片取4 μm厚度,用二甲苯脫蠟,梯度酒精水化,水洗5 min,置于蘇木素染色10 min,水洗,置于伊紅染色10 min,再次梯度酒精脫水,二甲苯透明,中性樹膠封片。觀察脊髓組織變化。

1.9免疫組化檢測內皮生長因子(VEGF)表達 取大鼠腰椎組織石蠟切片制作為4 μm厚度,脫蠟至水,檸檬酸鹽緩沖液高壓熱修復3 min,10%過氧化氫(H2O2)室溫封閉10 min,PBS洗滌后加入一抗MC,濃度為 1∶200,用磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗做陰性對照,4 ℃孵育過夜,二抗室溫孵育30 min,鏡下二氨基聯苯胺(DAB)顯色、蘇木素復染、梯度酒精脫水、封片。在光學顯微鏡200倍下,每切片選取3個高倍視野,拍攝腰椎組織圖像。醫學圖像分析軟件(Image Pro-plus6.0)分析測定每張圖像的積分光密度(IOD)值。

1.10Western印跡檢測TGF-β1、Smad4蛋白的表達 取大鼠腰椎組織用PBS洗滌后切碎,再加1 ml細胞裂解液裂解30 min,14 000 r/min 4 ℃離心5 min,取上清液,用5×上樣緩沖液混合于PBS稀釋蛋白樣品中,按照4∶1的比例進行,然后在沸水浴中煮沸5 min,采用二喹啉甲酸(BCA)法測總蛋白濃度,每孔上樣蛋白量20 μg,凝膠電泳。轉印緩沖液配制好后要放入4 ℃冰箱內預冷,然后全部轉移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,加入脫脂奶粉,全程封閉時長為1 h。加入兔抗鼠TGF-β1(稀釋比例1∶200)、Smad4一抗(稀釋比例1∶500)后,TTBS漂洗3次,每次10 min;4 ℃過夜,加入辣根根過氧化物酶標記羊抗兔IgG二抗(稀釋比例1∶2 500),37 ℃孵育45 min,TTBS漂洗10 min×3次,用DAB試劑盒,在1 ml水中加A、B、C液各一滴,再加于膜上,電化學發光(ECL)試劑后凝膠成像系統分析目標條帶的光密度值。

1.11統計學分析 采用SPSS22.0軟件進行單因素方差分析、t檢驗。

2 結 果

2.1各組血清中Ca、P水平 與CO組相比,MO組血清中 Ca、P水平均顯著降低(P<0.05),與MO組相比,AC組、PE組和JO組 Ca、P 水平均顯著升高(P<0.05),AC組和PE組比較無統計學差異(P>0.05),與AC組相比,JO組 Ca、P 水平均明顯升高(P<0.05)。見表1。

表1 各組血清中Ca、P、ALP、BGP水平及腰椎組織中VEGF、TGF-β1和Smad4蛋白表達比較

2.2各組血清中ALP、BGP水平 與CO組相比,MO組血清中ALP、BGP水平均明顯降低(P<0.05),與MO組相比,AC組、PE組和JO組ALP、BGP水平均明顯升高(P<0.05),AC組和PE組比較無統計學差異(P>0.05),與AC組相比,JO組ALP、BGP水平均明顯升高(P<0.05)。見表1。

2.3各組腰椎組織中TGF-β1、Smad4蛋白表達 與CO組相比,MO組腰椎組織中TGF-β1、Smad4表達顯著降低(P<0.05),與MO組相比,AC組、PE組和JO組TGF-β1、Smad4表達顯著升高(P<0.05),AC組和PE組相比,組間比較無統計學差異(P>0.05),與AC組相比,JO組TGF-β1、Smad4表達顯著升高(P<0.05)。見表1、圖1。

圖1 各組腰椎組織中TGF-β1、Smad4蛋白表達

2.4各組腰椎組織中VEGF陽性表達 與CO組相比,MO組腰椎組織中VEGF陽性表達顯著降低(P<0.05),與MO組相比,AC組、PE組和JO組VEGF陽性表達顯著升高(P<0.05),AC組和PE組相比,組間比較無統計學差異(P>0.05),與AC組相比,JO組VEGF表達顯著升高(P<0.05)。見表1、圖2。

圖2 各組腰椎組織中VEGF炎性表達(免疫組化染色,×200)

2.5各組神經組織HE染色 CO組顯示灰白質邊界清楚,神經元豐富;MO組顯示出以為灰白質邊界不清及神經元數目顯著降低為特征的嚴重損害;與MO組相比,AC組、PE組神經元數目明顯增加,但灰白質邊界欠清;與AC組、PE組相比,JO組神經元數目增加更明顯,脊髓的結構更好。見圖3。

圖3 各組神經組織(HE染色,×100)

3 討 論

腰椎骨折是一種比較常見的脊柱損傷,多發于成年人,75%為穩定性壓縮型骨折,20%為不穩定性骨折〔11〕。腰椎骨折后患者會出現腰部疼痛、腫脹、腰部活動受限等典型癥狀,有些患者甚至會并發腹膜后血腫、脊髓損傷等癥狀。近年來對腰椎骨折的治療主要通過腰椎復位進行治療,但是存在復位不理想的情況,導致錐體后移等不良后果,引給患者帶來不必要的痛苦同時還增加了經濟負擔。現代藥理學研究表明桃紅四物湯具有擴張血管增強冠脈血流、調節免疫功能、補充微量元素等作用。

本研究說明,針灸和桃紅四物湯可以提高鈣磷含量,促進鈣鹽的沉積,促進骨折的愈合。骨基質礦化是成骨細胞合成并分泌骨的有機成分,在一定條件下無機鹽有秩序地沉積,使鈣和磷形成羥基磷灰石,再與有機質形成螯合物,變為正常骨質的過程。鈣、磷作為骨骼中最為重要的礦物質與血液中的鈣、磷維持著動態平衡,當機體發生骨折時,這種平衡就會被打破,從而影響鈣磷沉積。骨鈣、磷含量是檢測骨量、反映骨骼是否存在骨質疏松狀態的指標,同時還用于評定骨脆性和預測骨折的風險指標〔12〕。針灸可以通過神經,體液和免疫系統等對機體的各系統、各器官的生理病理狀態進行影響和調整,針灸相關穴位,可以激發經絡之氣,啟動機體自身內在的調和能力,從而達到對骨折的治療作用。有研究發現大杼穴與骨代謝有關,針灸大杼穴可以提高血鈣的含量〔13〕。針灸腎之背俞穴有補腎壯骨的功效,同時對下丘腦-垂體-腎上腺皮質系統有調節作用。桃紅四物湯可以減輕骨折愈合過程中患者的疼痛感,促進骨質的鈣化,縮短骨折愈合的時間。有學者通過對75例骨折患者進行研究發現,桃紅四物湯不但可以提高患者血清中鈣磷比例,還可以提高VEGF、ALP的表達,改善骨代謝的指標,減少并發癥,促進患者骨折的愈合〔14〕,本研究和上述研究一致。

本研究說明,針灸聯合桃紅四物湯可以升高VEGF、ALP、BGP表達,促進骨愈合。VEGF是一種促血管形成的關鍵因子,是骨折愈合過程的一種重要因子。VEGF在骨形成過程的作用通過對內皮細胞的特異性作用,促使內皮細胞增殖分化形成血管,提高血管通透性,促血管生成參與骨發育形成,參與骨形成及骨愈合〔15〕。ALP和BGP都是成骨細胞分泌的物質,兩者均是與骨形成有關的代謝指標,均具有調節和維持骨鈣的功能,同時還在骨愈合和骨重建中起到關鍵性作用〔16〕。中醫認為骨折后局部氣血瘀滯導致全身血液運行不暢,瘀阻不通,形成血瘀證。有研究發現針灸可以更好地發揮行氣血、調和陰陽的作用,抑制骨吸收,促進骨形成〔17〕。桃紅四物湯具有補血而不滯血,和血的同時還不傷血的功效,其中當歸、川芎活血祛瘀,消腫止痛,配桃仁、紅花加強其破瘀血、生新血之功效。對于骨折來說,桃紅四物湯是通過祛腐生新,使骨折局部淤血減輕,促進血液循環,為骨折愈合創造良好的內環境,促進骨折愈合。陳海波等〔18〕通過對106例脛骨骨折患者進行研究,發現經過桃紅四物湯干預后,患者血清中BGP水平明顯升高、ALP水平明顯下降,改善局部的血液循環,提高了患者的膝關節功能,有利于病情恢復,本研究和上述研究一致。

本研究說明,針灸聯合桃紅四物湯增加TGF-β1、Smad4表達,從而促進骨愈合。TGF-β是個龐大的家族,其中TGF-β1是一種重要多肽類生長因子,在骨重建過程中有重要調節作用〔19〕。Smads蛋白直接參與TGF-β家族中信號轉導,包括受體調節型 Smad(Smad1,2,3,5,8)、通用型Smad(Smad4)和抑制型Smad(Smad6,7),其中Smad4S可在骨髓板的全區廣泛表達,Smad4可通過成熟成骨細胞中的線粒體途徑調節成骨細胞及多種細胞的凋亡,參與調節成骨細胞及成軟骨細胞的分化,調節成骨細胞對骨組織的修復和重建〔20〕。中醫認為一般發生骨折后局部血瘀形成,因此治療骨折的基本原則為活血化瘀。桃紅四物湯活血化瘀同時又可補氣養血,行氣而不傷正,該方中的熟地黃與當歸甘溫以滋陰補肝、 養血調經,兩者配伍可增強當歸補血,活血的功效。吳震〔21〕有對脛骨骨折大鼠進行研究,結果經過桃紅四物湯干預后,X線結果顯示,大鼠的骨痂密度均勻,接近正常骨組織密度,Western印跡檢測TGF-β信號通路上相關蛋白Smad2 及Smad4的蛋白表達明顯增加,說明桃紅四物湯可以調控TGF-β/Smad信號通路,促進骨折的愈合。本文和上述研究一致。

綜上所述,溫針聯合桃紅四物湯可以抑制骨礦物質的流失及增強骨吸收,加快鈣鹽的沉積,上調Smad4水平,促進骨愈合。