基于p38MAPK/NF-κB信號通路探討針刺調控線粒體自噬促進大鼠功能性消化不良發生發展的機制

郭炳濤 李雪松 黃亞蓉 范乾 雷旭東

(甘肅省腫瘤醫院 1血液病科,甘肅 蘭州 730050;2消化腫瘤內一科;3慶陽市中醫院針灸推拿科;4甘肅省腫瘤醫院臨床營養科)

功能性消化不良為臨床常見多發病,主要是由胃腸動力紊亂導致的,患者長期處于焦慮、抑郁狀態,可導致功能性消化不良的發生〔1,2〕使線粒體結構、數目、功能改變,對線粒體數量進行控制,影響細胞的分化〔3〕。中醫認為使用針刺治療,可對低度炎癥、腦腸軸、生態失調、胃酸分泌進行調節,使功能性失調患者胃腸道得到改善〔4〕。p38絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)/核因子(NF)-κB信號通路為機體內重要通路,可對細胞周期進行調節,在多種細胞過程中具有重要作用〔5〕。臨床中暫未有研究顯示針刺可通過調控p38MAPK/NF-κB介導線粒體自噬對功能性消化不良造成影響。本文基于p38MAPK/NF-κB信號通路探討針刺調控線粒體自噬對功能性消化不良大鼠的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物:選取SPF級SD大鼠50只,體質量(223.25±12.05)g,購自深圳市領先醫療服務有限公司,動物許可證號:SYXK(粵)2022-0295,所有大鼠在相對濕度65%、室溫22～25 ℃下飼養,每日光照12 h,飼養期間大鼠自由飲水。本次實驗操作均嚴格參照動物實驗倫理要求相關規定進行。

1.2分組與建模 選取10只大鼠作為對照組,其余40只大鼠參照張萍等〔6〕研究中的方法構建功能性消化不良模型,采用0.1%碘乙酰胺水溶液進行灌胃,使用鉗夾夾住大鼠尾巴中外1/3處,使大鼠憤怒反抗、撕咬,注意避免大鼠尾部破皮,連續刺激大鼠30 min,后將大鼠放置與疲勞轉棒儀,以35 r/min轉動10 min,3次/d,每次間隔4 h,連續造模10 d,造模過程中大鼠皮膚抓傷后使用碘伏消毒,防止感染,共有30大鼠建模成功,將建模成功大鼠分為模型組、藥物對照組、針刺組各10只。

1.3給藥干預 造模成功后,對大鼠進行治療,對照組、模型組不接受治療,藥物對照組采用莫沙必利治療,針刺組選取大鼠太沖穴、足三里穴,將大鼠束縛,使用25、13 mm毫針進針,太沖穴采用13 mm毫針進針深度為3～5 mm,足三里穴采用25 mm毫針進針深度為7～15 mm,1次/d,治療14 d。

1.4樣本采集 采集大鼠尾靜脈血,取3 ml,設置離心半徑5 cm,以3 000 r/min的轉速進行離心處理15 min,將上層血清分離,-80 ℃保存。

1.5一般情況、病理組織學觀察 處死前對各組大鼠活動、形態、納食、毛發光澤度等一般情況進行觀察,后將大鼠斷頸處死,取大鼠胃組織,剪取0.5 g腎臟組織,于-80 ℃儲存,在多聚甲醛固定4 h,進行脫水處理,石蠟包埋,制作5 μm切片,再次脫蠟、脫水,采用蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒染色,光學顯微鏡觀察其病理變化。

1.6飲水量、進食量、胃腸動力檢測 末次治療后,對大鼠禁食、禁水24 h,給予大鼠飼料、水,大素飲水、進食后,測量剩余水量、食量,飲水量=給予量-剩余量,進食量=給予量-剩余量。在200 ml蒸餾水中加入10 g羧甲基纖維素鈉,后加入奶粉16 g、淀粉、糖各8 g、碳墨4 ml,攪拌均勻,制成黑色半固體營養糊,以10 ml/kg灌胃,30 min后,對大鼠進行麻醉、開腹,將其胃賁門、幽門結扎,取大鼠胃部,使用濾紙吸干,進行稱重,沿胃部大彎將胃體剪開,清洗干凈內容物,即為胃凈重。胃排空率=1-(胃全重-胃凈重)/胃全重×100%。同時將小腸分割,測量幽門、盲腸距離,并測量幽門、黑色半固體糊前沿距離。小腸推進率=(小腸全長-推進長度)/小腸全長×100%。

1.7炎癥因子水平檢測 取各組大鼠靜脈血清,采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測白細胞介素(IL)-6、IL-1β、腫瘤壞死因子(TNF)-α水平,使用碳酸鹽緩沖液,將待測液稀釋,后倒入孔中,4 ℃下過夜處理,后棄去,洗凈,孔中加入1%牛血清白蛋白(BSA),37 ℃孵育60 min,后棄去,洗凈,稀釋抗血清,每孔加入0.1 ml,37 ℃下進行輕微搖晃40 min,后棄去,沖洗干凈,使用四甲基聯苯胺(TMB)進行顯色處理,后在450 nm波長下檢測OD值,查出IL-6、IL-1β、TNF-α表達水平。試驗重復進行5次。

1.8線粒體自噬檢測 取大鼠組織切片,放于pH為8.0的乙二胺四乙酸(EDTA)抗原修復盒,使用微波加熱8 min,8 min后使用低火微波加熱7 min,冷卻后,放入pH7.0磷酸鹽緩沖液(PBS),晃動洗滌3次,使用組織化筆在周圍畫圈,后放入雙氧水溶液,室溫下孵育25 min,放于緩沖液洗滌,后加入BSA,封閉處理30 min,加入一抗、二抗、CY3-酪酰胺信號放大(TSA),進行微波處理,后在切片圈滴加4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染液,放置5 min,進行沖洗,顯微鏡下觀察切片情況。

1.9線粒體膜電位變化比例、ATP、ROS檢測 取大鼠胃組織,加入8 ml純水稀釋JC-1,后加入2 ml JC-1染色緩沖液配成JC-1染色工作液,按照1∶1 000的比例在細胞培養液中加入氧化磷酸化解耦聯劑,將其稀釋至10 μmol/L,對貼壁細胞、懸浮細胞、純化線粒體膜電位進行檢測,顯微鏡下進行觀察。采用ELISA檢測三磷酸腺苷(ATP)、活性氧(ROS)水平,檢測方法同1.5。

1.10p38MAPK/NF-κB通路檢測 取各組胃組織,放置于冰上溶解25 min,加入9倍生理鹽水,放入組織勻漿中充分均漿,使用BCA試劑盒檢測p38MAPK、NF-κB蛋白含量,分析蛋白表達情況。試驗重復進行5次。

1.11統計學處理 采用SPSS19.0軟件進行方差分析。

2 結 果

2.1一般情況觀察 對照組活動靈敏,毛發順滑、皮膚光亮,眼角未出現分泌物;模型組毛色暗淡,毛發雜亂,易驚、易怒,且形體消瘦,對外界聲音較為敏感;藥物對照組、針刺組皮毛較為順滑、光亮,對外界聲音敏感狀態好轉,眼部分泌物正常,活動量增加。

2.2組織學觀察 如圖1所示,對照組胃黏膜表面平整光滑,具有少量的中性粒細胞、淋巴細胞、嗜酸性粒細胞,腺體規則排列;模型組胃黏膜表明受到損傷,出現炎性浸潤,中性粒細胞、淋巴細胞、嗜酸性粒細胞增加,腺體排列不規則;藥物對照組、針刺組胃黏膜表面光滑,炎性浸潤減輕,中性粒細胞、淋巴細胞、嗜酸性粒細胞減少,腺體較為規則,且針刺組改善程度>藥物對照組。

圖1 各組胃黏膜組織病理特征(HE染色,×100)

2.3各組飲水量、進食量對比 如表1所示,與對照組相比,模型組、藥物對照組、針刺組飲水量、進食量明顯下降(P<0.05);與模型組相比,藥物對照組、針刺組飲水量、進食量明顯增加(P<0.05);與藥物對照組相比,針刺組飲水量、進食量明顯增加(P<0.05)。

表1 各組飲水量、進食量胃腸動力、炎癥因子水平對比

2.4各組胃腸動力對比 如表1所示,與對照組相比,模型組、藥物對照組、針刺組胃排空率、小腸推進率明顯下降(P<0.05);與模型組相比,藥物對照組、針刺組胃排空率、小腸推進率明顯增加(P<0.05);與藥物對照組相比,針刺組胃排空率、小腸推進率明顯增加(P<0.05)。

2.5各組炎癥因子水平對比 如表1所示,與對照組相比,模型組、藥物對照組、針刺組IL-6、IL-1β、TNF-α明顯升高(P<0.05);與模型組相比,藥物對照組、針刺組IL-6、IL-1β、TNF-α明顯降低(P<0.05);與藥物對照組相比,針刺組IL-6、IL-1β、TNF-α明顯降低(P<0.05)。

2.6各組線粒體自噬對比 如表2所示,與對照組相比,模型組、藥物對照組、針刺組細胞色素(CYT)-C、微管結合蛋白1A/1B-輕鏈(LC)3B表達明顯升高(P<0.05);與模型組相比,藥物對照組、針刺組CYT-C、LC3B表達明顯降低(P<0.05);與藥物對照組相比,針刺組CYT-C、LC3B表達明顯降低(P<0.05)。

表2 各組線粒體自噬、膜電位變化、ATP、ROS水平及p38MAPK/NF-κB通路蛋白表達對比

2.7各組線粒體膜電位變化比例、ATP、ROS對比 如表2所示,與對照組相比,模型組、藥物對照組、針刺組線粒體膜電位變化比例、ROS水平明顯升高,ATP水平明顯降低(P<0.05);與模型組相比,藥物對照組、針刺組線粒體膜電位變化比例、ROS水平明顯降低,ATP水平明顯升高(P<0.05);與藥物對照組相比,針刺組線粒體膜電位變化比例、ROS水平明顯降低,ATP水平明顯升高(P<0.05)。

2.8各組p38MAPK/NF-κB通路蛋白表達量對比 如表2、圖2所示,與對照組相比,模型組、藥物對照組、針刺組p38MAPK、NF-κB蛋白表達量明顯升高(P<0.05);與模型組相比,藥物對照組、針刺組p38MAPK、NF-κB蛋白表達量明顯降低(P<0.05);與藥物對照組相比,針刺組p38MAPK、NF-κB表達量明顯降低(P<0.05)。

圖2 各組p38MAPK/NF-κB信號通路蛋白表達

3 討 論

功能性消化不良為臨床常見功能性胃腸病,該病的發生與內臟敏感性增高、胃腸激素、神經遞質變化、胃腸動力障礙、自主神經功能紊亂、遺傳基因等有關〔7〕。功能性消化不良反復發作,可對患者生理、身體健康造成影響,臨床常用治療藥物,可導致神經系統、消化道不良反應,故尋找新的治療方式較為重要〔8,9〕。

中醫學認為〔10〕,功能性消化不良屬于“胃脘痛”“痞滿”范疇,主要為脾胃受損、肝氣不達導致的,臨床應以治療脾胃、肝為主。中醫針灸為非藥物治療方式,采用針灸對足三里、太沖穴進行刺激,可對胃腸功能進行調節,使大鼠胃腸動力得到改善,機體內炎癥反應降低,修復黏膜屏障,臨床使用效果較好〔11〕。本研提顯示,采用針刺對功能性消化不良大鼠進行治療,可提高大鼠的飲水、進食量,促進大鼠的線粒體自噬,使大鼠胃腸動力得到改善,臨床使用效果較好。

臨床研究顯示〔12〕,在功能性消化不良發病過程中,多為胃動力障礙,機體發病后,可降低胃腸道平滑肌細胞的能量代謝。細胞內重要的能力代謝主要發生于線粒體,線粒體氧化磷酸化可合成ATP,并在ROS的產生中具有重要作用,線粒體自噬后,可對細胞內線粒體數量進行調節,使線粒體功能保持正?！?3〕。機體內ATP的合成下降,ROS生成過多后,可促進機體內氧化應激損傷,使線粒體過度自噬,減弱胃腸動力,使胃腸節律發生紊亂〔14〕。本研究結果表明,針刺可減少線粒體自噬,減輕線粒體功能損傷,改善胃腸動力障礙。

功能性消化不良臨床發病機制復雜,主要為內臟超敏導致的胃腸道功能下降,使胃腸道運動、感覺功能發生異常,增加胃腸道黏膜的通透性,并引發胃腸道局部炎癥反應〔15〕。機體內胃腸道黏膜下神經,多發生炎癥反應,引發胃腸道平滑肌異常,導致機體的消化不良,且黏膜出現炎癥反應,可使胃黏膜組織肥大細胞密度增加,促進機體內炎癥介質的釋放,使胃電節律發生紊亂,造成胃排空發生異?！?6〕。IL-6為炎癥細胞因子,其表達水平與胃腸道功能障礙呈正相關,IL-6表達水平降低后,患者胃腸動力逐漸恢復,IL-1β可對機體內炎癥反應進行反應,并可對炎癥細胞、免疫細胞造成刺激,促進機體內炎癥介質的釋放,使炎癥反應加重,IL-1β可對機體的水、鈉吸收能力下降,導致患者腹瀉,使胃腸功能發生紊亂,TNF-α在炎癥過程中具有重要作用,可使中性粒細胞的吞噬能力提高,并促使其黏附能力,使細胞的炎癥反應加重,可誘發腸黏膜炎癥反應〔17〕。本研究顯示,采用針刺治療,可使功能性消化不良大鼠的機體免疫功能增強,降低炎癥反應,改善大鼠胃黏膜炎癥反應。

胃腸道功能障礙可導致功能性消化不良的發生,胃腸道功能障礙包括胃排空延遲、餐后胃運動障礙、胃肌電異常〔18〕。p38MAPK為MAPK家族成員,p38MAPK激活后,可轉移至機體內細胞核。研究顯示,p38MAPK可使蛋白質發生磷酸化,其蛋白質底物包括磷酸酶、生長因子受體、蛋白激酶、細胞骨架蛋白,且底物可介導p38信號在細胞周期調節、存活、增殖、死亡等多種功能〔19〕。NF-κB可對免疫應答、炎癥反應進行調節,在機體胃腸系統中,NF-κB可使受損腸上皮再生,抑制腸損傷、壞死〔20〕。本研究顯示,采用針刺治療,可抑制p38MAPK/NF-κB通路的激活,改善胃黏膜炎癥反應。

綜上,功能性消化不良可引發線粒體自噬,促進炎癥因子表達,對患者胃黏膜造成損傷,經針刺治療后,功能性消化不良大鼠線粒體自噬、胃腸動力改善,炎癥因子水平降低,其機制可能與調控p38MAPK/NF-κB通路有關。