基于Wnt/β-catenin信號通路探討膝痹康方在兔膝骨性關節炎模型中的作用機制

宋坤玉 張偉冬 李宗洋 于斌 李裕柳 尹宏兵 莊世偉

(1長春中醫藥大學,吉林 長春 130000 ;2長春中醫藥大學附屬第三臨床醫院)

膝骨性關節炎(KOA)是一種關節退行性疾病,其最顯著的特征是關節軟骨的破損和碎裂,包括滑膜、軟骨成分(尤其是Ⅱ型膠原和聚集蛋白)、軟骨下骨和周圍軟組織的破壞,同時伴隨著關節功能障礙〔1〕。KOA在60歲以上的老年人中發生率為30%～50%〔2〕,KOA的發病機制錯綜復雜,包括遺傳、肥胖、創傷和年齡等多種因素,均可能導致其發生。據相關研究表明〔3〕,Wnt/β-連環蛋白(catenin)信號通路在調控細胞增殖和分化方面扮演著至關重要的角色,該通路的異常會對軟骨細胞的正常代謝產生影響,導致軟骨及軟骨下骨的細胞表型和分子功能失衡,同時也會影響細胞外基質的合成,這在KOA的發病過程中具有重要意義。近年來研究表明,中藥方劑對于治療KOA有顯著效果。膝痹康方(XBKF)由蒼術、黃柏、熟地、雞血藤、肉蓯蓉、大黃、牛膝、赤芍、莪術等藥物組成,具有清熱除濕、補腎活血、消腫止痛的功效。在KOA的長期臨床治療中,XBKF顯著改善KOA的癥狀,改善患者健康和生活質量〔4〕。然而,XBKF治療KOA的具體機制尚未明確。本實驗觀察XBKF對KOA兔Wnt/β-catenin信號通路及細胞凋亡相關蛋白表達水平及炎性因子的影響,進一步探討XBKF對KOA軟骨的保護作用及機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 清潔級新西蘭大白兔30只,平均體質量2.5～3.0 kg,雌雄各半。實驗動物公司:長生生物科技有限公司,許可證號SCXK(黑)2017-008。實驗動物環境:長春中醫藥大學動物實驗中心(許可證號SYXK(吉)2018-0013)。每只單獨分籠喂養,每日定時更換飼料、飲用水及清理大小便。實驗動物觀察室為開放式,溫度、照明、通風、噪音等條件控制在所規定范圍內。實驗方案經長春中醫藥大學動物醫學倫理委員會審核通過(倫理批號:2022-644)。

1.2實驗藥物 主要藥物:XBKF(配比如下薏苡仁50 g、蒼術、黃柏、熟地各25 g,雞血藤、肉蓯蓉各20 g,牛膝、赤芍、莪術、蘇木各15 g,大黃、木通、地龍、茯苓、甘草各10 g、蜈蚣2條、全蝎3 g)上述中藥選自長春中醫藥大學附屬第三臨床醫院中藥房,將所購各位藥材加水后,兩次煎煮合并提取液,減壓濃縮為含生藥1 g/ml,于4 ℃冰箱中儲存備用。塞來昔布膠囊(輝瑞制藥有限公司;規格:0.2 g/粒,批號:J20140072)。

1.3主要試劑 木瓜蛋白酶(公司:Biosharp,批號:BS190-25g),L-半胱氨酸(公司:Biosharp,批號:BS181-25g),速眠新Ⅱ(公司:圣達動物藥品有限公司,批號:070031582,),舒泰50(公司:Virbac China,批號:外獸藥證號43號),蘇木素-伊紅(HE)高清恒染、Wnt3a兔抗體、β-catenin兔抗體、Bcl-2兔抗體、Bax兔抗體(公司Servicebio,批號:G1076、GB113750、GB12015、GB112495、GB11247-1),兔IL-1β、IL-6、TNF-α酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(MM-0305O1,MM-0302O1,MM-0240O1,均購買于江蘇酶免實業有限公司)。

1.4主要儀器 動物跑步機(宇晟YS-J100)、酶標儀(公司:Rayto,型號:RT-6100)、超聲波細胞破碎儀(公司:寧波新芝生物,型號:JY92-11N)、臺式高速冷凍離心機(公司:DRAGONLAB,型號:D3024R)、烤箱(公司:天津市萊玻瑞儀器設備有限公司,型號:GFL-230)、化學發光儀(公司:CLINX,型號:6100)正置光學顯微鏡(公司:日本尼康,型號:Nikon Eclipse E100)等。

1.5實驗動物分組 將30只新西蘭健康大耳白兔采用隨機數字表法,分為空白組、模型組、塞來昔布組、膝痹康方低劑量(XBKF-L)組、膝痹康方高劑量(XBKF-H)組,每組6只。

1.6KOA模型制備 適應性喂養1 w后,除空白組外,其余4組參照文獻方法〔5〕進行造模:精確稱取木瓜蛋白酶0.4 g、L-半胱氨酸 36 mg,共同置于離心管中,加入生理鹽水 10 ml,均勻混合后4 ℃低溫冷藏保存。以兔子右膝建立模型:推去右腿兔毛,以髕骨下極髕韌帶外緣為進針點。分別于第1、4、7天注入配置好的溶液,并每日定時強迫大白兔在動物跑步機活動15 min。連續驅趕14 d后,空白組和造模組分別隨機抽取1只大白兔進行X光拍照觀察兔右膝關節,建立穩定的 KOA 兔模型。

1.7藥物干預 藥物治療于造模成功后第1天開始,各組兔連續灌胃4 w,給藥劑量按照徐叔云等〔6〕主編的《藥理實驗方法學》算出大白兔的等效劑量。每只兔每天灌胃液體量20 ml。空白組、模型組每只每日等量生理鹽水灌胃;塞來昔布組每只每日給予24 mg/(kg·d)塞來昔布灌胃;XBKF-L組每只每日給予8.7 g/(kg·d)膝痹康濃縮液灌胃;XBKF-H組每只每日給予17.4 g/(kg·d)膝痹康濃縮液灌胃;(分別相當于臨床等效劑量1、2 倍)。

1.8觀察兔一般情況 觀察實驗兔造模與給藥期間膝關節形態,活動度和色澤等改變,及有無發熱現象,并對其精神狀態、進食狀況、毛發光澤及疏密程度,實驗兔步態和大小便色澤性狀進行觀察。

1.9觀察指標及方法 連續灌胃4 w,末次給藥后稱量每只兔的體重,右后肢肌肉注射進行麻醉,麻醉劑(舒泰50和速眠新Ⅱ,配比 6∶1),0.35 ml/kg,腹主動脈采血,4 ℃、1 500 r/min分離血清;在二氧化碳下安樂死后,無菌條件下分離膝關節,將部分膝關節放入含4%多聚甲醛的EP管中,用于后續組織形態學觀察;部分膝關節放入凍存管中,置于-80 ℃冰箱中保存,用于后續蛋白檢測。

1.10HE染色觀察KOA兔關節軟骨的病理變化及Makin評分 取各組兔右側股骨頂點鈣化層以上軟骨制作標本,使用10%的乙二胺四乙酸(EDTA)脫鈣液進行脫鈣,接著進行脫水、浸蠟、矢狀位包埋、切片(3 μm)。通過使用HE染技術色,在顯微鏡下觀察,并以Mankin評分進行評估〔7〕。

1.11ELISA檢測兔血清中炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α表達 取各組兔血清樣品,按照ELISA試劑盒說明書操作,終止反應后測定每孔450 nm最大吸收波長的OD值,并繪制標準曲線,計算出樣品中IL-1β、IL-6、TNF-α的濃度。

1.12Western印跡檢測兔關節軟骨組織中Wnt3a、β-catenin 、Bcl-2及Bax蛋白表達 取各組兔右膝關節軟骨組織標本,進行勻漿、離心處理后收集上清液,依次經測定蛋白濃度、上樣及電泳、轉膜、封閉和孵育抗體、滴加發光液后檢測膜上蛋白,獲取目的蛋白顯色條帶并讀取灰度值。以β-actin作為內參,分析各組兔關節軟骨組織中Wnt3a、β-catenin、Bcl-2及Bax蛋白相對表達水平。

1.13統計學方法 采用SPSS25.0軟件進行方差分析、t檢驗。

2 結 果

2.1各組大白兔一般情況觀察 空白組大白兔未觀察到明顯異常,毛發茂密順滑,飲水攝食正常、大小便正常。各組造模的大白兔經造模后出現膝關節紅腫明顯,輕微發熱、伴有不同程度跛行、飲水攝食量下降,精神萎靡及體質量減輕;灌胃開始后的2 w,模型組、XBKF-L組膝關節腫脹程度較膝XBKF-H組及塞來昔布組更明顯,各藥物組兔活動量較前改善、精神萎靡好轉、飲水攝食量增加。造模結束后,經X線掃描:與空白組大白兔相比較,模型組大白兔右膝關節后可見骨間隙明顯變窄,骨質增生有骨贅生成,說明模型構建成功。見圖1。

圖1 空白組與模型組右膝關節X線

2.2各組大白兔關節軟骨組織病理觀察結果及Mankin評分 空白組軟骨表面光滑,細胞排列整齊,未見裂隙,各層組織完好均未見破壞,潮線清晰完整;與空白組相比,模型組軟骨表面膜樣結構破壞,軟骨細胞變少,甚者軟骨層出現裂隙樣破壞,Mankin評分明顯升高(P<0.05);經藥物治療后,與模型組相比,塞來昔布組軟骨表面較為光滑,軟骨細胞增多,部分軟骨核皺縮;XBKF-L組軟骨表面較為粗糙,細胞排列不齊,軟骨厚薄不均;XBKF-H組軟骨表面較光滑,有少量毛刺,細胞排列較為整齊,接近于空白組;塞來昔布組、XBKF-L組、XBKF-H組Mankin評分均明顯降低(P<0.05)。見圖2、表1。

表1 各組軟骨組織Mankin評分、血清中IL-1β、IL-6和TNF-α含量、Wnt3a、β-catenin 、Bcl-2及Bax 蛋白表達比較

箭頭所指為軟骨損傷處圖2 各組軟骨組織病理(HE染色)

2.3各組血清中IL-1β、IL-6和TNF-α含量比較 與空白組比較,模型組IL-1β、IL-6和TNF-α含量均顯著升高(P<0.05);與模型組比較,經各藥物組治療后兔血清中IL-1β、IL-6和TNF-α含量均顯著降低(P<0.05)。見表1。

2.4各組膝軟骨組織中Wnt /β-catenin信號通路蛋白及凋亡蛋白表達 與空白組比較,模型組軟骨組織中Wnt3a、β-catenin、Bax蛋白表達量顯著升高,Bcl-2蛋白表達量顯著降低(P<0.05);經各藥物組治療后,與模型組比較,各藥物治療組 Wnt3a、β-catenin 、Bax蛋白表達量顯著降低,Bcl-2蛋白表達量顯著升高(P<0.05)。見表1、圖3。

1～5:空白組,模型組,塞來昔布組,XBKF-L組,XBKF-H組圖3 各組軟骨組織中Wnt3a、β-catenin 、Bcl-2及Bax蛋白表達

3 討 論

KOA導致活動嚴重受限甚至無法移動〔8〕。KOA的確切發病機制至今仍未被完全闡明。XBKF是臨床治療KOA等疾病常用方,其在臨床應用中表現出顯著的療效,具有除濕止痛的功效。XBKF中重用北蒼術、黃柏為君,以清熱解毒、祛風除濕,二藥合而為君,具有利濕、瀉火、止痛、解毒的功效,清熱燥濕力強,標本兼顧,北蒼術辛甘祛濕,脾胃最喜,故亦入之;臣以牛膝、薏苡仁、熟地黃、雞血藤、赤芍、莪術、蘇木以滋陰補血,舒筋活絡,益精填髓,具有補肝腎,強筋骨的功效;佐以大黃、木通、地龍、茯苓、蜈蚣及全蝎,大黃瀉下攻積,清熱逐瘀,涼血解毒,滌蕩濕熱瘀結之毒,木通利尿通淋,通經除煩,地龍、蜈蚣、全蝎走竄性強,破血通絡,以息風鎮痙,通絡止痛,攻毒散結,茯苓利水滲濕,健脾寧心,共為佐藥;使以甘草,以清熱益氣,調和諸藥,避免清熱消腫之力過盛而傷及正氣。通過本實驗研究發現,XBKF在治療膝骨關節炎中發揮的作用與非甾體抗炎藥基本一致,鑒于中藥復方具有副作用較小、不良反應發生率低,適合長期服用的優點,這對KOA疾病治療藥物的選擇有一定意義。

Wnt/β-catenin信號通路在KOA的進展中扮演著重要的調控角色,對于關節軟骨的形成、分化及軟骨細胞的凋亡和增殖具有至關重要的影響〔9〕。該信號通路不僅參與了多種組織病理過程如炎癥反應及退行性改變,還影響著骨關節炎和骨性關節炎患者體內細胞因子表達水平及基質金屬蛋白酶(MMPs)活性〔10〕。在軟骨增生期間,Wnt信號對軟骨細胞分化起重要的調節作用,根據研究結果,Wnt3a被認為是關節軟骨領域中最具代表性的Wnt之一〔11〕。在KOA中,Wnt3a被激活,從而促進了MMPs的表達,導致軟骨組織的退化和炎癥反應的發生〔12〕。目前認為它參與了多種炎癥反應及退變機制,并通過影響細胞因子和黏附分子等起著調節作用。而在Wnt/β-catenin信號通路中,β-catenin則扮演著不可或缺的角色〔13〕。本研究說明,XBKF可能通過抑制Wnt/β-catenin信號通路激活,從而抑制細胞凋亡,延緩疾病進程。

膝骨關節炎的主要特征在于軟骨組織中IL-1β、IL-6、TNF-α等細胞因子的增加,炎癥在骨關節炎的發生發展中起核心作用〔14〕。IL-1β通過抑制Ⅱ型膠原和聚集蛋白聚糖的分泌,誘導MMP-1、MMP-3、MMP13的表達上調,從而阻斷軟骨細胞的合成并破壞軟骨組織〔15〕。此外,還可引起滑膜增生及關節腔積液。IL-6的作用在于刺激成纖維細胞的生成,同時促進了OA中IL-1β和TNF-α等細胞因子的破壞能力,從而促進了軟骨基質的快速降解〔16〕。因此認為,骨關節炎的發病機制可能與其炎性介質及相關因子的過度釋放密切相關。在骨關節炎的進展過程中,炎癥反應持續存在,而由于炎性刺激所引起的疼痛則是其主要表現之一。因此,減輕炎癥損傷已成為治療該病的關鍵。近年來,許多學者對緩解及預防KOA進行了深入研究。大量研究表明,改善KOA的機制與降低關節液或血清中的IL-1β、IL-6和TNF-α水平有關〔8,17～20〕。目前臨床上對于膝骨關節炎患者常采用抗炎、鎮痛及改善關節功能的系統治療方案來控制病情的發展。本研究說明XBKF對于膝關節骨性關節炎有較好的抗炎效果,且未發現對胃腸道等副作用。