白藜蘆醇調控TLR4/NF-κB信號通路對潰瘍性結腸炎大鼠炎癥反應的影響

劉景鴻 萬云 劉曉龍 葉鵬 顧秋平 (贛州市人民醫院消化內科,江西 贛州 341000)

潰瘍性結腸炎是一種反復發作的自發性炎癥性腸道疾病,其病因不明,且病情輕重不等〔1〕。大多數患者發病時多以腹瀉、黏液膿血便、腹痛等為主要表現〔2,3〕。近年來該病的發病率逐年上升,且極易復發。目前為止該病的治療方法仍舊是以藥物治療為主,但是許多免疫抑制類藥物多存在不可耐受的副作用,并且會引發一系列并發癥〔4〕,因此,尋找安全性及療效較好的新型藥物至關重要。白藜蘆醇是一種存在于花生或植物中的酚類化合物,有研究已證實其具有抵抗炎癥、免疫調節、抵抗腫瘤增殖等作用〔5,6〕。近年來有研究指出,該藥材還具有抵抗癌細胞的能力,可以通過調控mTOR來抑制肝癌細胞的增殖;還可以抑制肺癌細胞的發生發展〔7,8〕。研究發現Toll樣受體(TLR)4/核轉錄因子(NF)-κB是潰瘍性結腸炎的重要信號通路之一,與炎癥和免疫息息相關,其激活后在機體的炎癥、免疫反應、細胞凋亡等過程中起樞紐作用〔9〕。但是白藜蘆醇是否可以通過調控TLR4/NF-κB通路對潰瘍性結腸炎大鼠的炎癥反應有一定的作用,還不夠明確,因此,本文觀察白藜蘆醇對潰瘍性結腸炎大鼠炎癥反應的影響,并探討其相關機制。

1 資料與方法

1.1實驗動物與分組 選取50只9周齡左右的SD雄性大鼠,體質量260 g左右,購自北京科宇動物養殖中心,飼養與無菌環境中,溫度27 ℃左右;濕度:55%左右,自由進食,適應性喂養1 w后進行實驗。將其隨機分為:空白組、模型組、白藜蘆醇低、中、高劑量組,每組各10只。

1.2儀器與試劑 白藜蘆醇(純度≥99%,美國Sigma公司)、磷酸鹽緩沖液(PBS,成都中仕石化有限公司)、石蠟(瑞沃德生命科技有限公司)、乙醇、生理鹽水(南京化學試劑有限公司)、所需試劑盒(上海酶聯生物科技有限公司)、離心機、凝膠成像儀(上海無陌光學儀器有限公司)、酶標儀、PCR儀、電泳儀(大龍興創實驗儀器有限公司)、組織勻漿機(深圳欣博盛生物科技有限公司)、所需抗體(美國Thermo公司)。

1.3模型制備 采用2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)灌腸法制備模型〔10〕,大鼠適應性飼養7 d,禁食不禁水24 h后開始造模,首先對除空白組外的大鼠進行麻醉,仰臥位置于鼠臺上,然后快速將0.65 ml的TNBS結合乙醇溶液灌入,空白組則灌入等體積生理鹽水,大鼠均快速注入后捏緊肛門,提取大鼠尾巴數分鐘,以防注倒流。大鼠清醒后開始常規飼養,自由飲食。第2天開始除空白組和模型組外,白藜蘆醇低、中、高劑量組分別腹腔注射白藜蘆醇(10、50、100 mg/kg),連續給藥7 d,而空白組和模型組則不處理。

1.4蘇木素-伊紅(HE)染色觀察大鼠組織病理變化 先將大鼠麻醉,仰臥固定,打開腹部暴露臟器,小心摘取肝臟、肺臟后,用生理鹽水充分沖洗后再固定,流水沖洗并采用酒精脫水,再將組織塊置于既溶于酒精又溶于石蠟的透明劑中,放入保溫箱中。待石蠟完全浸入組織塊后包埋,連續5 μm切片,進行染色,然后觀察各組大鼠結腸組織的病理學變化,并進行評分,評分=炎癥分數+潰瘍深度分數+腸壁增厚分數+隱窩破壞情況分數。

1.5酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測各組大鼠血清炎性細胞因子 將大鼠頸部的皮向后擼,使大鼠的眼睛突出后采集血液,離心后置于-80 ℃環境中待檢,采用ELISA檢測大鼠血清腫瘤壞死因子(TNF)-α、白細胞介素(IL)-6、IL-1β、IL-10的表達,嚴格按照說明書操作。

1.6Western印跡檢測各組組織TLR4/NF-κB信號通路的相關蛋白表達 取組織總蛋白進行測定,行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),分離后進行轉膜用牛血清白蛋白(BSA)封閉聚偏氟乙烯(PVDF)膜1 h,脫脂封閉后加入TLR4、NF-κB抗體;吸盡一抗孵育時的洗滌液后加入稀釋好的二抗慢慢搖動;再次搖動洗滌,進行化學發光反應,然后浸入顯影液中顯色、最后凝膠成像,計算蛋白表達。

1.7PCR檢測各組組織中TLR4、NF-κB mRNA表達 提取血清總RNA,按逆轉錄試劑盒說明書要求,將提取的總RNA反轉錄成cDNA,然后再進行擴增,以GAPDH為內參,檢測相對表達:ΔCt=目的基因Ct-內參基因Ct,引物序列:TLR4正向5′-CCTGTGGACAAGGTCAGCAACTC-3′,反向5′-CACTCAGACTCGGCACTTAGCAC-3′;NF-κB正向5′-TGAG-TCCCGCCCCTTCTAAA-3′,反向5′-CCTGGATCACTTCAATGGCCT-3′;GAPDH正向5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′,反向5′-GGCTGTTGTCATACTTC-TCATGG-3′。

1.8分子對接 運用YASARA分子模擬軟件進行結構優化,運用軟件AutoDock4.0進行剛性分子對接,白藜蘆醇構象的搜索使用 Lamarchian遺傳算法,能量匹配通過半經驗自由能的計算。驗證白藜蘆醇與TLR4/NF-κB的相互作用。

1.9統計學方法 采用SPSS21.0軟件進行單因素方差分析、LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1各組結腸組織病理結果比較 空白組結腸結構清晰,黏膜上皮結構較好,細胞排列整齊均勻,無浸潤。模型組結腸黏膜、黏膜下層見大量炎性細胞浸潤,且結構紊亂,潰瘍已達到肌層,固有層結構破壞嚴重。白藜蘆醇各劑量組結腸黏膜、黏膜下層炎性胞浸潤明顯減少,結構開始逐漸清晰,水腫、糜爛現明顯減輕,且隨著劑量增加,潰瘍明顯減少。且與空白組相比,模型組及白藜蘆醇高、中、低劑量組病理評分顯著升高,而白藜蘆醇各劑量組病理評分顯著下降,且呈劑量依賴性(P<0.05),見圖1、表1。

表1 各組病理組織評分、炎性細胞因子水平

圖1 各組結腸組織病理學(HE染色,×100)

2.2各組血清炎性細胞因子 與空白組相比,模型組及白藜蘆醇各組TNF-α、IL-6、IL-1β水平顯著較高,IL-10水平顯著較低;與模型組相比,白藜蘆醇各組TNF-α、IL-6、IL-1β水平顯著較低,IL-10水平顯著較高,且隨著劑量的增加而變化(P<0.05),見表1。

2.3各組TLR4/NF-κB信號通路相關蛋白和mRNA表達 與空白組相比,模型組TLR4、NF-κB蛋白和mRNA表達顯著較高(P<0.05),白藜蘆醇用藥后,TLR4、NF-κB蛋白和mRNA表達顯著下降,且隨著劑量的增加而顯著降低(P<0.05),見表2、圖2。

表2 各組結腸組織中TLR4、NF-κB蛋白和mRNA表達比較

1～5:空白組、模型組、白藜蘆醇低劑量組、白藜蘆醇中劑量組、白藜蘆醇高劑量組圖2 各組TLR4、NF-κB蛋白表達

2.4分子對接結果 分子對接時Grid Box分子對接格點包含整個模型,分子對接格點為94×86×113,格點間距為0.375 nm。分別選擇O00206TLR4、P19838NF-κB的晶體結構從uniprot中下載,序列號分別為4G8A、3GUT,分辨率分別為2.40?、3.59?,結合能分別為-6.37、-5.31;結合模式見圖3、圖4。

圖3 白藜蘆醇和TLR4/NF-κB作用的3D圖

圖4 白藜蘆醇和TLR4/NF-κB作用的2D圖

3 討 論

研究認為潰瘍性結腸炎有關,病因與免疫炎癥通路密切相關〔11〕。目前為止,普遍接受的機制是在易感人群中腸道免疫的平衡被破壞,從而產生許多促炎因子,導致免疫紊亂〔3〕。且該病極易發展為結腸癌,因此,早期的治療顯得至關重要。但目前的常規化療藥物有極其嚴重的耐藥反應,并且長時間使用,還會伴有副作用,嚴重影響患者的生存質量〔12〕。白藜蘆醇具有吸收快、代謝迅速的特點,排泄方式通過尿液排出,所以其副作用較低〔13〕。Ruan等〔14〕指出,白藜蘆醇通過調節產生炎癥的酶和途徑表現出抗感染活性,并提到其可以抑制許多癌癥和腫瘤發生和轉移。NF-κB是潰瘍性結腸炎發病時關鍵的調控因子,其可以調控促炎因子的表達,影響炎癥,也有研究發現TLR4在該病發生發展中起到了樞紐的作用〔15,16〕。

本研究首先證實了大鼠造模成功;其次說明了白藜蘆醇對潰瘍性大鼠有較好的保護作用。趙承滿等〔17〕認為抗炎癥類藥物可通過調控炎癥介質對該病有一定的治療作用。本研究結果說明白藜蘆醇可能是調節TNF-α、IL-6、IL-1β因子的水平對淋巴細胞進行抑制,避免大鼠發生免疫反應;白藜蘆醇可以通過對TLR4介導的信號通路調控TLR4及NF-κB蛋白及基因表達,減少促炎因子的釋放,從而抑制免疫反應,減輕大鼠結腸組織的炎癥損傷。這與顧怡康等〔18〕的研究結論也基本一致。

姚君等〔19〕研究指出,白藜蘆醇可提高潰瘍性結腸炎大鼠腸道的IL-10的水平,從而下調T細胞和巨噬細胞轉錄分泌的致炎因子的作用,最終抑制細胞免疫反應,使腸道免疫炎癥反應得到了一定的控制。但是其具體調控通路并未指出。王堅衡等〔20〕研究表明白藜蘆醇可以改善潰瘍性結腸炎大鼠的病理學改變,是通過調控通過抑制TLR4活性,以阻止其下游的核轉錄因子NF-κB的激活,阻礙其信號傳遞而實現的,但對其炎癥介質的研究并不深入。在本研究分子對接實驗中表明白藜蘆醇具備抵抗潰瘍性結腸炎的作用,其機制可能與炎癥通路及炎癥介質密切相關。

綜上,白藜蘆醇可以減輕潰瘍性結腸炎大鼠的腸道炎癥反應,對大鼠具有保護作用,其機制可能是通過調控TLR4/NF-κB信號通路,從而調節炎癥因子實現的,但本文只是初步探討,還需后續研究進一步驗證。