犀角地黃湯治療ITP的療效及其作用機制

胡哲 胡輝 楊舟 趙早云 王躍

(湖南中醫藥大學第一附屬醫院 1血液腫瘤科,湖南 長沙 410007;2消毒供應室)

原發免疫性血小板減少癥(ITP)是臨床上常見的血液系統免疫性疾病,主要表現為血小板(PLT)計數明顯減少,并伴有皮膚黏膜、內臟等出血,嚴重的損害患者的生命健康〔1〕。目前,臨床上ITP治療多以西藥為主,主要包括激素、血小板生成刺激素、單克隆抗體及免疫抑制劑等,但是上述治療藥物存在不良反應多、價格昂貴等缺點〔2,3〕。中醫辯證法在治療ITP患者中具有一定優勢,能夠明顯改善臨床癥狀,且具有不良反應少、療效顯著等優點,已經成為ITP治療藥物選取的新方向〔4〕。犀角地黃湯出自《備急千金要方》,具有增強免疫功能、清心涼血及清熱止血等功效,已在臨床及實驗研究中得到廣泛證實〔5〕。研究顯示,犀角地黃湯能夠通過維持ITP大鼠外周血輔助性T細胞17/調節性T細胞(Th17/Treg)免疫細胞平衡,調節白細胞介素(IL)-17、IL-35細胞因子表達,增加PLT計數,從而達到改善ITP作用〔6〕。但是,有關犀角地黃湯通過何種機制調節Th17/Treg免疫細胞平衡,并最終參與ITP的分子機制尚不完全清楚。Toll樣受體(TLR)4/骨髓樣分化因子(MyD88)/核因子(NF)-κB信號通路參與調控炎癥反應、氧化應激及細胞免疫功能等〔7,8〕。研究發現,抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號通路能夠明顯抑制Th17細胞分化,促進Treg細胞分化,從而改善Th17/Treg細胞失衡,并最終抑制機體炎癥反應〔9〕。但是,有關TLR4/MyD88/NF-κB信號通路介導的Th17/Treg細胞失衡在ITP中研究尚無相關報道。本研究探究犀角地黃湯對ITP的療效及其作用機制。

1 材料與方法

1.1動物 雄性,SPF級,SD大鼠,周齡6～8 w,體質量(200±15)g,購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司〔生產許可證號:SCXK(滬)2020-0008〕,實驗大鼠置于(25±2)℃,相對濕度45%～55%的動物房內適應性喂養1 w,期間正常飲食、飲水,晝/夜12 h交替光照。

1.2藥物與主要試劑 犀角地黃湯由水牛角(替代犀牛角)45 g、白芍12 g、丹皮9 g、生地黃30 g組成,藥材均購自北京同仁堂藥店。犀角地黃湯組方藥材均經冷水浸泡30 min,其中水牛角預先煎煮30 min,而后與其余藥材共同繼續煎煮60 min,制備并濃縮為水剪劑1 g/ml;醋酸潑尼松pain(浙江仙居制藥股份有限公司,規格:5 mg/片,國藥準字H33021207);完全弗氏佐劑(Sigma公司,批號:Lot#SLBZ9884);IL-6、IL-17、轉化生長因子(TGF)-β1、IL-10、IL-35檢測試劑盒(上海酶聯生物科技有限公司,批號:ml063160、ml063129、ml022522-2、ml037888、ml063154);蘇木素-伊紅(HE)檢測試劑盒、蛋白濃度測定試劑盒、山羊抗兔二抗、山羊抗小鼠二抗、β-actin抗體(碧云天生物技術,批號:C0105S、P0009、A0239、A0258、AF0003);TLR4抗體、MyD88抗體、NF-κB抗體、p-NF-κB抗體(Cell Signaling Technology公司,批號:14358、4283、8242、3033)。

1.3儀器 全自動血細胞分析儀(美國Abbott公司,型號:CELL-DYN1700);酶標儀(山東恒美科技,型號:HM-SY96S);熒光倒置顯微鏡(日本/奧林巴斯Olympus,型號:CKX53);離心機(湖南湘儀離心機有限公司,型號:HT165R);凝膠成像系統(美國Bio-Rad伯樂公司,型號:Gel Doc XR+)。

1.4兔抗大鼠血小板血清制備 腹腔注射1%戊巴比妥鈉40 mg/kg麻醉SD大鼠,腹主動脈取血,放入EDTA抗凝管內,1 000 r/min,離心10 min,收集血小板,使用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌血小板并調整濃度為1×109個/L,之后與完全弗氏佐劑充分混合制備成佐劑抗原。將上述佐劑抗原于新西蘭兔后肢足墊、背部多處進行皮下注射。佐劑抗原于首次注射后的7、14、28 d進行重復上述步驟。末次注射后3 d后新西蘭兔心臟采血,3 000 r/min,離心10 min,收集上清液,即為兔抗大鼠血小板血清(APS)〔6〕,并將其放置于-80 ℃冰箱內待用。

1.5ITP模型構建、分組及給藥干預 將50只SD大鼠隨機分為正常對照組、模型組、犀角地黃湯低劑量組、犀角地黃湯高劑量組、潑尼松組,每組10只。除正常對照組外,其余各組均采用腹腔注射APS構建ITP模型(采用生理鹽水稀釋APS,稀釋比例為1∶4,濃度為0.7 ml/200 g,連續注射3 d)。于造模后7 d,正常對照組和模型組生理鹽水灌胃;依據文獻〔6〕及大鼠與人體表面積等效劑量換算,犀角地黃湯低、高劑量組分別給予0.012 5 g/kg、0.050 0 g/kg犀角地黃湯灌胃;潑尼松組給予9.1 mg/kg潑尼松灌胃,1次/d,連續灌胃14 d,各組灌胃體積均為10 ml/kg。

1.6外周血象檢測 各組于造模前、給藥前(腹腔注射APS造模后7 d)及給藥后(各組大鼠連續藥物干預14 d),大鼠尾靜脈取血,全自動血細胞計數儀檢測各組PLT計數。于連續給藥14 d時進行血紅蛋白(Hb)含量檢測。

1.7脾臟及胸腺指數檢測 各組連續給藥14 d后稱量體質量,腹腔注射1%戊巴比妥鈉40 mg/kg麻醉大鼠并頸椎脫臼處死,解剖分離脾臟及胸腺,取出血液及筋膜組織,稱量脾臟及胸腺質量,計算脾臟和胸腺指數。脾臟指數=脾臟重量(mg)/大鼠體質量(g);胸腺指數=胸腺質量(mg)/大鼠體質量(g)。

1.8血清IL-6、IL-17、TGF-β1、IL-10、IL-35含量檢測 各組大鼠連續灌胃給藥干預14 d后,腹腔注射1%戊巴比妥鈉40 mg/kg麻醉大鼠后,腹主動脈取血,放置于抗凝離心管內,4 ℃,3 000 r/min,離心10 min,收集上層血清。參照ELISA檢測試劑盒說明書進行血清IL-6、IL-17、TGF-β1、IL-10、IL-35含量檢測。

1.9Th17和Treg細胞占比測定 各組大鼠末次給藥結束后24 h,腹腔注射1%戊巴比妥鈉40 mg/kg麻醉大鼠,腹主動脈取血,分離外周血中單核細胞,向重懸細胞中加入適量異硫氰酸熒光素(FITC)標記的CD4抗體,30 min后加入FITC標記的IL-17A抗體及PE標記的Foxp3抗體,4 ℃條件下,避光孵育30 min,流式細胞儀對上述細胞信號進行采集,并通過軟件分析Th17/Treg細胞比例。

1.10脾臟和胸腺組織病理學檢測 各組大鼠連續給藥14 d后,腹腔注射1%戊巴比妥鈉40 mg/kg麻醉大鼠并頸椎脫臼處死,解剖分離脾臟及胸腺,剪去部分組織放置于10 %多聚甲醛固定液中進行組織固定24 h,切片后行HE染色觀察各組脾臟和胸腺組織病理學變化。

1.11脾臟組織TLR4/MyD88/NF-κB通路蛋白表達檢測 各組干預14 d后,立即將大鼠處死,剪取大鼠脾臟組織并提取總蛋白;二喹啉甲酸(BCA)法測定各組脾臟組織蛋白質濃度;蛋白上樣;凝膠電泳;濕轉法轉膜;5%BSA室溫封閉2 h;分別賦予TLR4抗體(1∶1 000)、MyD88抗體(1∶500)、p-NF-κB抗體(1∶1 000)、NF-κB抗體(1∶1 000)及β-actin抗體(1∶2 000),4 ℃ 條件下孵育16 h;37 ℃條件下二抗孵育60 min;去除二抗后TBST洗膜15 min;滴加顯影液于Gel Doc XR+成像系統中顯影拍照,并通過ImageJ軟件分析蛋白相對表達量。

1.12統計學分析 采用SPSS20.0軟件進行多因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1犀角地黃湯對ITP大鼠一般情況的影響 正常對照組反應靈敏、精神狀態良好,飲食、飲水均正常;其余各組造模7 d后出現活動能力明顯減弱,飲食、飲水下降,皮膚出血,精神狀態較差等現象。與模型組相比,各藥物干預組活動能力明顯增強,皮膚出血點減少,精神狀態得到明顯改善。

2.2犀角地黃湯對ITP大鼠外周血PLT數目的影響 造模前,各組外周血PLT計數無顯著差異(P>0.05)。給藥前,與正常對照組相比,各造模組外周血PLT計數均顯著降低(P<0.05)。連續給藥14 d后,與正常對照組相比,模型組外周血PLT計數顯著降低(P<0.05)。與模型組相比,犀角地黃湯低、高劑量組及潑尼松組外周血PLT計數顯著升高(P<0.05)。見表1。

表1 各組外周血PLT數目比較

2.3犀角地黃湯對ITP大鼠Hb濃度、脾臟及胸腺指數的影響 連續給藥14 d后,與正常對照組相比,模型組外周血Hb濃度顯著降低,脾臟和胸腺指數均顯著升高(P<0.05)。與模型組相比,犀角地黃湯低劑量組、高劑量組及潑尼松組外周血Hb濃度顯著升高,脾臟和胸腺指數均顯著降低(P<0.05)。見表2。

表2 各組Hb濃度、脾臟、胸腺指數、血清IL-6、IL-17、TGF-β1、IL-10、IL-35水平比較

2.4犀角地黃湯對ITP大鼠血清炎性因子及外周血Th17/Treg細胞比例的影響 與正常對照組相比,模型組血清IL-6、IL-17水平顯著升高,TGF-β1、IL-10、IL-35水平均顯著降低(P<0.05)。與模型組相比,犀角地黃湯低劑量組、高劑量組及潑尼松組血清IL-6、IL-17水平顯著降低,TGF-β1、IL-10、IL-35水平均顯著升高(P<0.05)。見表2。流式細胞術檢測顯示,與正常對照組相比,模型組外周血中Th17細胞百分含量明顯增加,Treg細胞百分含量明顯降低(P<0.05)。與模型組相比,犀角地黃湯低劑量組、高劑量組及潑尼松組外周血中Th17細胞百分含量明顯降低,Treg細胞百分含量明顯增加(P<0.05)。見表3。

表3 各組外周血中Th17、Treg細胞比例比較

2.5犀角地黃湯對ITP大鼠臟器病理形態學的影響 脾臟組病例染色顯示,正常對照組脾臟結構清晰、紅髓、白髓相見分布,可見紅髓充血,可見髓樣生化;模型組脾臟組織結構模糊,脾臟小體部分萎縮,可見紅髓明顯充血,巨噬細胞明顯增多。與模型組相比,犀角地黃湯低劑量組、高劑量組及潑尼松組骨髓外造血減輕,脾臟結構得到改善,巨噬細胞浸潤程度減輕。胸腺病理性染色顯示,正常對照組胸腺組織結構清晰,皮質及髓質分解清晰,且皮質區域淋巴細胞排列規整,髓質區域可見胸小小體,淋巴細胞減少;模型組大鼠胸腺組織結構疏松,淋巴細胞明顯減少,皮質髓質分界模糊。與模型組相比,犀角地黃湯低劑量組、高劑量組及潑尼松組胸腺組織病理形態學得到不同程度改善。見圖1。

圖1 各組脾臟及胸腺組織病理學(HE染色,×400)

2.6犀角地黃湯對ITP大鼠脾臟TLR4/MyD88/NF-κB信號通路蛋白表達的影響 與正常對照組相比,模型組脾臟組織TLR4、MyD88、p-NF-κB/NF-κB蛋白表達均顯著升高(P<0.05)。與模型組相比,犀角地黃湯低、高劑量組及潑尼松組脾臟組織TLR4、MyD88、p-NF-κB/NF-κB蛋白表達均顯著降低(P<0.05)。見圖2、表4。

1～5:正常對照組、模型組、犀角地黃湯低劑量組、犀角地黃湯高劑量組、潑尼松組圖2 Western印跡檢測脾臟組織TLR4/MyD88/NF-κB信號通路蛋白

表4 各組脾臟組織TLR4、MyD88、p-NF-κB蛋白相對表達水平

3 討 論

ITP約占出血性疾病的1/3〔10〕。ITP發病機制較為復雜,至今尚未完全闡明。研究表明,以T淋巴細胞免疫失衡及相關細胞因子分泌異常在ITP疾病進展中發揮關鍵作用〔11〕,但其具體致病機制尚未完全闡明。Th細胞在機體免疫系統中發揮重要作用,其可以分化成為Th1、Th2、Th17及Treg細胞等,而以Th17/Treg細胞平衡是維持機體免疫穩態的關鍵〔12〕。Th17是介導炎癥和自身免疫性疾病的重要調節因子,主要通過產生特異性炎癥細胞因子IL-6、IL-17、IL-21及IL-22等介導機體炎癥反應及免疫功能異常激活。而Treg是介導免疫穩態及免疫耐受的關鍵,主要通過分泌IL-10、IL-35及TGF-β1等抑制性細胞因子,從而抑制T細胞介導的免疫耐受,維持免疫功能平衡及抑制炎癥反應的發生,兩者功能相反且處于動態平衡〔13〕。既往研究顯示,當機體存在炎癥、感染及自身免疫性疾病時,會導致機體免疫系統異常激活,從而導致Th17/Treg細胞平衡被打破〔14〕。研究證實,Th17/Treg失衡參與了ITP的發生發展〔15〕。因此,以Th17/Treg細胞失衡及相關細胞因子分泌異常為靶標可能是治療ITP的關鍵。

祖國醫學認為,ITP屬“血證”“紫斑”等范疇,病機為氣不攝血、陰虛火旺及血熱妄行等〔16〕,其中以血熱妄行為ITP主要病機,治療多宜涼血止血、清熱解毒。犀角地黃湯以犀牛角、丹皮、生地黃、白芍四味中藥組成,組方中犀角具有清心解毒止血;芍藥,丹皮具有清熱涼血、活血化瘀之效;生地黃具有滋陰生津,輔助犀牛角涼血止血。既往研究顯示,犀角地黃湯能夠用于治療系統性紅斑〔17〕、ITP〔6〕及小兒過敏性紫癜〔18〕等中醫辨證為血熱患者。以上研究表明犀角地黃湯具有治療ITP作用。王躍等〔6〕研究顯示,犀角地黃湯能夠通過維持Th17/Treg細胞平衡,從而改善ITP大鼠PLT計數。本研究結果進一步證實,犀角地黃湯具有治療ITP作用,與維持Th17/Treg細胞平衡,抑制炎癥細胞因子釋放相關。但是,有關Th17/Treg細胞平衡的調節機制尚不清楚。

TLR4/MyD88/NF-κB信號通路參與介導炎癥反應及免疫功能的重要調節機制。研究顯示,下調TLR4表達能夠抑制NF-κB向核內轉移,從而參與調控Th17/Treg免疫平衡,抑制結直腸炎小鼠炎癥因子表達,從而緩解結腸炎小鼠臨床癥狀〔19〕。徐化雪等〔20〕研究顯示,右美托咪定能夠通過抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號通路介導的免疫功能紊亂,從而改善原位肝癌切除術大鼠術后免疫功能抑制。以上研究提示,TLR4/MyD88/NF-κB信號通路可能通過調節Th17/Treg免疫平衡,參與ITP發生發展。本研究結果表明,TLR4/MyD88/NF-κB信號通路激活可能與ITP時Th17/Treg免疫細胞失衡相關;犀角地黃湯能夠通過抑制TLR4/MyD88/NF-κB信號通路活化,改善Th17/Treg免疫細胞失衡。