吡非尼酮對慢性阻塞性肺疾病合并肺間質纖維化大鼠肺組織BMP7/Smad1/5通路的影響

王凱 王佳 李偉偉 (延安大學附屬醫院 胸外科,陜西 延安 76000;腫瘤科)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一種全球流行性疾病,也是全球疾病相關死亡的主要原因之一,其主要特征是持續的呼吸道癥狀和進行性氣流阻塞〔1,2〕。隨著COPD的進展,患者會發生肺間質纖維化(PIF),引發低氧血癥或呼吸衰竭,嚴重威脅患者的生命健康,但至今仍缺乏特效藥物,因此有必要對COPD-PIF的發生及治療機制深入探究〔3〕。吡非尼酮是一種常用于治療肺纖維化的有效藥物,最近有研究表明吡非尼酮在COPD并發肺纖維化中具有很好的臨床療效,能有效改善患者肺功能及氣道炎癥,但其在COPD-PIF中的詳細治療機制還未得到明確〔4〕。骨形態發生蛋白(BMP)7/Smad1/5信號通路參與調控慢性支氣管哮喘、肺纖維化等慢性進行性肺部疾病的發生〔5,6〕。吡非尼酮在COPD-PIF中的療效機制是否可能與BMP7/Smad1/5信號通路有關值得探究,由于煙熏法聯合脂多糖(LPS)構建的COPD-PIF大鼠模型病理過程與人類COPD-PIF極為相似,因此本研究通過該方法構建COPD-PIF大鼠模型,探究吡非尼酮對COPD-PIF大鼠肺組織BMP7/Smad1/5通路的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物 將從百奧賽圖江蘇基因生物技術有限公司購買的75只SPF級SD大鼠(體質量245～290 g)適應性飼養1 w(55%的相對濕度環境、12 h明暗交替),許可證:SCXK(蘇)2016-0004,期間自由采食、飲水,于實驗前禁食12 h。

1.2主要試劑 吡非尼酮(北京康蒂尼藥業有限公司,批準文號:國藥準字H20133375);蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(上海信帆生物科技有限公司,貨號:G1120-100);二喹啉甲酸(BCA)蛋白檢測試劑盒(上海恒斐生物科技有限公司,貨號:23227);總蛋白提取試劑盒〔晨學生物科技(廣州)有限公司,貨號:SD-001〕;標記的山羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G二抗抗體、兔抗β-actin抗體、p-Smad1/5抗體(Cell Signaling Technology,貨號:7074、4970、9516);兔抗Smad1/5抗體(AF0614,貨號:Affinity Biosciences);兔抗BMP7抗體(Proteintech,貨號:12221-1-AP);實時熒光定量-聚合酶鏈反應(qRT-PCR)試劑盒、反轉錄試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司,貨號:WE0149-UFL、BTN170403-RFS);白細胞介素(IL)-1β、腫瘤壞死因子(TNF)-α酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司,貨號:E-EL-R0012c、E-EL-R0019c);IL-8 ELISA試劑盒(上海雅吉生物科技有限公司,貨號:YS04227B);層黏連蛋白(LN)、透明質酸(HA,江西艾博因生物科技有限公司,貨號:IB-E14153、IB-E12044);羥脯氨酸(HYP,上海瑞楚生物科技有限公司,貨號:R200796)。BioSpectrum Imaging System購自上海書俊儀器設備有限公司;SpectraMax iD5-多功能酶標儀購自美谷分子儀器(上海)有限公司。

1.3分組與模型構建 SD大鼠隨機取10只為對照組,其余60只進行模型構建。采用煙熏法聯合脂多糖(LPS)構建COPD-PIF模型構建〔7〕:將大鼠置于自制密閉玻璃箱內,內部點燃10支香煙進行煙熏實驗(2次/d、30 min/次),每天煙熏結束后移入正常環境中飼養,于1 d及14 d對大鼠進行水合氯醛麻醉、仰臥固定后將注射器于聲門插入氣道注射LPS(200 μl、1 mg/ml),注射結束后將大鼠直立使LPS均勻流向肺部,為期28 d,對照組于第1天及14天向氣道注射等劑量生理鹽水,未進行煙熏實驗〔7〕。造模結束后以每組15只分為COPD-PIF組、低劑量組(50 mg/kg吡非尼酮)、中劑量組(100 mg/kg吡非尼酮)、高劑量組(200 mg/kg吡非尼酮)〔8〕,于造模結束后低、中、高劑量組分別灌胃50、100、200 mg/kg吡非尼酮,對照組、COPD-PIF組灌胃等量生理鹽水,為時2 w,觀察大鼠一般情況。

1.4大鼠肺功能情況檢測 實驗結束后將所有大鼠麻醉后切開皮膚暴露氣管,進行氣管插管后一側連接小動物呼吸機,另一側連接肺功能檢測儀記錄大鼠第0.1秒用力呼氣容積(FEV0.1),用力肺活量(FVC)及呼氣峰流速(PEF)。

1.5HE及Masson染色觀察大鼠肺組織情況 每組選5只大鼠進行頸椎脫臼處死,取肺組織在甲醛溶液中固定、乙醇脫水后石蠟包埋后進行4 μm連續切片,左肺組織切片通過HE染色、乙醇脫水后進行封片觀察(n=5),右肺組織切片用麗春紅酸性品紅液中孵育2 min后依次添加磷酸鋁水溶液酶染及甲基綠染色2 min經乙醇脫水后透明、封片觀察,即Masson染色。

1.6ELISA檢測大鼠肺組織中炎癥因子及LN、HA水平情況 另取5只大鼠肺組織(左肺組織用于檢測炎癥因子水平,右肺組織用于后續HYP含量檢測)進行勻漿后根據試劑盒說明書在450 nm處檢測組織中IL-1β、TNF-α、IL-8、LN、HA含量(設5個復孔)。

1.7堿水解法檢測大鼠肺組織HYP含量 取1.6所得肺組織勻漿液,使用HYP含量檢測試劑盒測定大鼠肺組織中HYP含量(設5個復孔)。

1.8Western印跡檢測肺組織BMP7/Smad1/5通路蛋白表達 取剩余5只大鼠右肺組織經勻漿添加裂解液裂解后離心取上清、提取總蛋白,按照BCA試劑盒說明書步驟檢測蛋白含量,按40 μg/孔進行凝膠電泳十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白,經低溫轉膜、封閉液封閉后添加兔抗p-Smad1/5、Smad1/5、β-actin、BMP7(1∶1 000)一抗于4 ℃冰箱中孵育過夜后經磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗,添加辣根過氧化物酶(HRP)標記的IgG二抗(1∶3 000)孵育,清洗后使用電化學發光試劑(ECL)顯色,在蛋白凝膠成像儀中觀察,使用Image-J軟件定量分析蛋白含量(重復5次)。

1.9統計學分析 采用SPSS18.0軟件進行方差分析、多組間進一步兩兩比較采用SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1大鼠一般情況觀察 實驗結束后,對照組狀況良好、行動敏捷;COPD-PIF組皮毛暗淡無光澤、飲食減少、大便干燥、行動緩慢、精神不濟,出現哮喘、呼吸急促困難、氣喘癥狀;與COPD-PIF組相比,低劑量組、中劑量組及高劑量組上述癥狀均得到不同程度減輕。

2.2吡非尼酮對大鼠肺功能的影響 與對照組相比,COPD-PIF組PEF、FVC和FEV0.1值顯著降低(P<0.05);與COPD-PIF組相比,低、中、高劑量組PEF、FVC和FEV0.1值顯著增加(P<0.05);與低劑量組相比,中、高劑量組PEF、FVC和FEV0.1值顯著增加(P<0.05);與中劑量組細胞,高劑量組PEF、FVC和FEV0.1值顯著增加(P<0.05),見表1。

表1 各組肺功能及肺組織炎癥因子水平

2.3吡非尼酮對大鼠肺組織炎癥因子水平的影響 與對照組相比,COPD-PIF組肺組織IL-1β、TNF-α及IL-8水平顯著增加(P<0.05);與COPD-PIF組相比,低、中、高劑量組IL-1β、TNF-α及IL-8水平顯著降低(P<0.05);與低劑量組相比,中、高劑量組IL-1β、TNF-α及IL-8水平顯著降低(P<0.05);與中劑量組相比,高劑量組IL-1β、TNF-α及IL-8水平顯著降低(P<0.05),見表1。

2.4吡非尼酮對大鼠肺組織病理學的影響 對照組肺組織肺泡及支氣管結構正常完整,上皮細胞整齊排列、結構完整,未出現炎性細胞浸潤;COPD-PIF組肺組織結構發生改變,肺泡壁斷裂、支氣管壁及肺泡壁增厚,氣道平滑肌、杯狀細胞及結締組織增生、氣道管狹窄、管壁水腫、充血,黏膜上皮細胞脫落壞死、出現炎性細胞浸潤現象;與COPD-PIF組相比,低、中、高劑量組上述現象得到不同程度改善,見圖1。

圖1 各組肺組織病理學(HE染色,×200)

2.5吡非尼酮對大鼠肺組織纖維化的影響 對照組肺組織結構正常,未出現纖維組織沉積現象;COPD-PIF組肺組織中出現成纖維細胞增生、膠原纖維成片聚集現象,肺泡結構受到損壞;與COPD-PIF組相比,低、中、高劑量組肺組織纖維組織沉積現象得到不同程度改善,見圖2。

圖2 各組肺組織纖維化(Masson染色,×200)

2.6吡非尼酮對大鼠肺組織HA、LN及HYP水平的影響 與對照組相比,COPD-PIF組肺組織HA、LN及HYP水平顯著增加(P<0.05);與COPD-PIF組相比,低、中、高劑量組HA、LN及HYP水平顯著降低(P<0.05);與低劑量組相比,中、高劑量組HA、LN及HYP水平顯著降低(P<0.05);與中劑量組相比,高劑量組HA、LN及HYP水平顯著降低(P<0.05),見表2。

表2 各組肝功能及纖維化指標、肺組織中BMP7/Smad1/5通路蛋白表達

2.7吡非尼酮對大鼠肺組織中BMP7/Smad1/5通路蛋白表達的影響 與對照組相比,COPD-PIF組肺組織中BMP7及p-Smad1/5/Smad1/5水平顯著降低(P<0.05);與COPD-PIF組相比,低、中、高劑量組BMP7及p-Smad1/5/Smad1/5水平顯著增加(P<0.05);與低劑量組相比,中、高劑量組BMP7及p-Smad1/5/Smad1/5水平顯著增加(P<0.05);與中劑量組比較,高劑量組BMP7及p-Smad1/5/Smad1/5水平顯著增加(P<0.05),見表2、圖3。

1～5:對照組,COPD-PIF組,低劑量組,中劑量組,高劑量組圖3 各組肺組織中BMP7/Smad1/5通路蛋白表達

3 討 論

COPD被認定為不完全可逆氣流受限的慢性肺病,其特征在于由遺傳和環境危險因素相互作用造成的肺部過度炎癥反應所誘發的慢性支氣管炎和肺氣腫,這將導致免疫功能紊亂和肺組織破壞〔9,10〕。COPD造成的長期炎癥反應可最終PIF的發生,COPD-PIF作為COPD進程中的一大常見病理改變,會加重患者肺功能損傷,加速疾病的進程,然而,COPD-PIF的發病機制及治療機制尚未闡明,并且缺乏特效藥,因此深入探究其治療機制迫在眉睫〔3,4〕。

吡非尼酮具有抗纖維化和抗發炎的特性,已在多種體外系統和肺纖維化動物模型中測試發現其在抗炎及抗氧化劑方面具有高效性〔11〕。PEF、FVC和FEV0.1是體現肺功能狀況的有效指標〔12〕。有研究表明吡非尼酮對COPD并發肺纖維化患者呼吸癥狀、炎癥反應具有有效治療作用,可顯著改善肺功能〔4〕。吡非尼酮可通過抑制老年COPD-PIF患者血漿中轉化生長因子(TGF)-β1誘導的NOX4表達而發揮疾病治療作用〔13〕。本研究結果表明,吡非尼酮可有效改善COPD-PIF大鼠肺功能。HYP為膠原蛋白所特有,可間接用于反映纖維化的程度〔14〕。間質細胞所產生的HA,其生成在纖維化發生時顯著上升〔14〕。當LN大量生成時可導致過度的炎癥反應,而其進一步造成的過度修復則是纖維化發生的主要成因之一〔14〕。本研究結果表明,吡非尼酮可有效降低COPD-PIF大鼠氣道炎癥反應,抑制肺損傷及纖維化程度,從而對COPD-PIF具有有效治療作用。

BMP7作為TGF-β超家族成員之一,最先發現于骨組織中,與骨及軟骨形成有關,但現今已有報道稱,其可表達于肺和腎臟等器官中,在肺發育和氣管上皮干細胞再生中發揮作用,參與氣道炎癥、支氣管肺發育不良、肺癌等肺部疾病的發生〔15～19〕。TGF-β1已被證明是促纖維化因子,而BMP7可作為天然拮抗劑抑制TGF-β1誘導的人肺成纖維細胞分化及細胞外基質積累,除此之外,還可抑制TGF-β誘導的成纖維細胞中Ⅰ型膠原α鏈mRNA表達,從而具有潛在的抗纖維化作用〔15,20〕。支氣管肺發育不良(BMD)模型大鼠肺組織中BMP7表達異常降低,其在BMD大鼠肺泡發育中具有重要作用,是預防異常肺泡發育的保護性細胞因子〔15〕。重組BMP-7鼻內治療可減少哮喘小鼠肺部炎癥和Ⅰ型膠原沉積,對肺過敏性炎癥具有保護作用〔21〕。Smads蛋白中受體型蛋白包括Smad1、5,參與BMP7/Smad信號通路〔22〕。BMP參與并刺激BMP R-Smad蛋白Smad1/5的磷酸化〔23〕。有研究發現,積雪草苷可通過促進BMP7/Smad1/5信號通路激活來抑制博來霉素誘導的小鼠肺纖維化程度〔5〕。本研究結果表明,吡非尼酮可顯著激活COPD-PIF大鼠BMP7/Smad1/5信號通路。