旱作果園土壤促生菌的篩選與鑒定

王琦 王媛媛 李陽 李夏媛 田鑫 武艷霞 史高川

收稿日期：2023-07-20中文收稿日期

基金項目：國家重點研發(fā)計劃（2021YFD1901105）；山西省科技重大專項計劃“揭榜掛帥”（202101140601026）；山西省基礎研究計劃項目（202203021212445）；山西農業(yè)大學博士人才引進科研啟動項目（2022BQ15）；山西省博士畢業(yè)生、博士后研究人員來晉工作獎勵經費科研項目（SKBYKY2022085）。

第一作者簡介：王? 琦（1990-），女，助理研究員，主要從事果園地力提升及微生物群落結構研究工作。電話：13070126381；E-mail：wq210509@sxau.edu.cn

*通信作者：史高川（1976-），男，副研究員，主要從事梨果栽培及有害生物防控的研究。

摘? 要：【目的】為促進旱作果園有機培肥過程中土壤養(yǎng)分高效利用。【方法】通過實驗室平板培養(yǎng)和高通量測序等方法，對有機果園根際土壤微生物進行篩選。【結果】結果表明，果園土壤微生物的最適篩選濃度為10-2和10-3，在所得菌株中經鑒定，熱羧基鏈霉菌和枯草芽孢桿菌這兩株同時具有纖維素分解、固氮、解磷和解鉀等功能。【結論】熱羧基鏈霉菌和枯草芽孢桿菌能激發(fā)旱作果園的培肥效果。

關鍵詞：菌劑；培肥；果園；有機旱作；土壤養(yǎng)分

文章編號：2096-8108（2023）06-0034-04? 中圖分類號：S606+.1中圖分類號? 文獻標識碼：A文獻標志碼

Screening and Identification the Growth-promoting Bacteria in Upland Orchard Soil

WANG? Qi1，WANG? Yuanyuan2，LI? Yang1，LI? Xiayuan1，TIAN? Xin1，WU? Yanxia1，SHI? Gaochuan1*

（1.Pomology Institute， Shanxi Agricultural University， Taiyuan Shanxi 030031，China;

2.Shennong Seed Industry（Shanxi）Co.， Ltd，Taiyuan Shanxi 030012，China）

Abstract：【Objective】 To promote the efficient utilization of soil nutrients in the process of organic fertilization in dry orchards. 【Methods】 The soil microorganisms in the rhizosphere of organic orchards were screened by laboratory plate culture and high-throughput sequencing. 【Results】 The results showed that the optimal screening concentrations of soil microorganisms in orchards were 10-2 and 10-3， and the two strains of Streptomyces thermocarboxydusand Bacillus subtilis were identified as having the functions of cellulose decomposition， nitrogen fixation， phosphorus and potassium removal. 【Conclusion】Streptomyces thermocarboxydus and Bacillus subtilis can stimulate the fertilization effect of dry orchards.

Keywords：fungicide; fertilizer; orchard; organic dry farming; soil nutrient

在干旱條件下，長期施用化肥造成果園土壤質量變差、肥力降低，有益微生物多樣性低、群落結構差，直接導致果樹產量低、果品品質差，制約著果園的可持續(xù)發(fā)展。隨著人們環(huán)保意識和對綠色農業(yè)發(fā)展的重視，有益微生物特別是植物促生菌（plant growth-promoting bacteria，PGPB）的應用被認為是提高農業(yè)生產率、改善土壤及環(huán)境健康的有效措施［1］。然而，在山西干旱的背景下，通過添加植物促生菌改善有機農業(yè)生產過程中土壤養(yǎng)分循環(huán)利用、果樹養(yǎng)分高效利用的研究缺乏系統(tǒng)性。基于此，本文對果園促生菌種的篩選與鑒定展開研究。

植物促生菌可通過固氮、解磷解鉀等直接或間接促進植物生長及發(fā)育，從而抵御植物受到干旱脅迫而引發(fā)的生長限制［2-3］。此外，促生菌還可改善土壤微生物群落結構，進而促進植物的生長發(fā)育［4-5］。有研究表明，熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）可通過固氮作用，促進小麥［6］（Triticum aestivum）等作物的生長發(fā)育。此外，接種嗜根鏈霉菌（Streptomyces rhizophilus）、球形芽孢桿菌（Bacillus sphaericus）和解淀粉芽孢桿菌后，通過氨化作用促進土壤中有機氮轉化為無機氮，從而提高油菜（Brassica napus）中總氮含量［7］。同樣的，膠質芽孢桿菌和巨大芽孢桿菌則能促進蔬菜等對鉀的吸收利用，在提高作物產量和品質的同時，緩解了植物所受鹽漬化的脅迫［8］。因此，篩選土壤中的植物促生菌能夠有效增加植物對養(yǎng)分的利用效率，改善有機培肥果園中土壤養(yǎng)分供需不匹配的狀況。

鑒于此，本研究從果樹根際促生菌入手，通過篩選山西旱區(qū)有機培肥果園中具有促生功能的微生物，然后對其不同促生功能進行測定與驗證，同時對不同菌株的形態(tài)和分子學水平進行鑒定，為進一步研制旱作果園田間促生菌劑提供微生物材料。

1? 材料與方法

1.1? 試驗材料

試驗用土壤樣品采集于山西農業(yè)大學果樹研究所核桃園、梨園和櫻桃園中，共計5個土壤樣品，其中有機培肥果園3個，分別為核桃園（SM1）、梨園（SM2）和櫻桃園（SM3）；常規(guī)施肥果園2個，分別為核桃園（EM1）、梨園（EM2）。供試土壤于2022年5月20日采集于不同果園，土壤采集后立即裝入自封袋，液氮保存并迅速轉移至實驗室，保存于-30℃冰箱用于后續(xù)微生物分離。

1.2? 試驗方法

分別采用牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基、馬丁培養(yǎng)基和高氏Ⅰ號培養(yǎng)基對土壤中細菌、真菌和放線菌進行微生物最佳濃度確定及篩選。然后利用纖維素分解培養(yǎng)基對纖維素分解菌進行分離、純化，并通過阿須貝無氮培養(yǎng)基、亞歷山大硅酸鹽培養(yǎng)基、NBRIP（溶解無機磷）和NBRIPY（溶解有機磷）培養(yǎng)基對分離所得菌株的養(yǎng)分活化能力進行進一步驗證［9］。并通過高通量測序對目標菌株進行菌種鑒定（委托上海派森諾生物科技有限公司測定），并利用顯微鏡對菌落結構進行鏡檢。

1.3? 數據處理

數據整理及統(tǒng)計分離使用Excel 2019和Minitab 18.0進行分析處理。纖維素分解能力（R）等于菌落透明圈直徑（D，cm）除以菌落直徑（d，cm），

即R=Dd。

2? 結果與分析

2.1? 土壤微生物最佳篩選濃度

通過對不同果園土壤中細菌、真菌和放線菌的培養(yǎng)最佳土壤浸提液稀釋濃度篩選發(fā)現（見表1），施用有機肥之后，土壤微生物豐富度提高，顯著提高了土壤中可培養(yǎng)細菌和真菌的數量。其中，對土壤中可培養(yǎng)微生物篩選的土壤浸提液濃度可低至10-7。有機培肥果園土壤中細菌的最佳篩選濃度為10-6和10-7，真菌的最佳篩選濃度為10-4和10-5。有機培肥對土壤中可培養(yǎng)放線菌的數量影響不顯著。

2.2? 果園土壤纖維素分解菌的篩選

以土壤懸濁液10-3濃度浸提液對纖維素分解菌進行篩選（見圖1），通過篩選初步獲得10余株具有纖維素分解能力的菌株。通過對各菌株纖維素分解能力進行測定（見表2），結果表明SM3-1和SM3-2兩菌株的纖維素分解能力最強，顯著高于其他菌株的分解能力，分別為3.83和3.55；其次為EM2-1、EM1-1和SM1-2，對纖維素的分解能力分別為2.43、2.33和2.06。

a：SM1土壤纖維素分解菌的篩選群落；b：SM3土壤纖維素分解菌的篩選群落；c：菌種SM3-1對纖維素的分解能力分析；d：菌種SM3-2對纖維素的分解能力分析。

2.3? 菌種的土壤養(yǎng)分活化能力鑒定

為進一步驗證各菌株的其他養(yǎng)分分解功能，通過固氮、無機磷溶解、有機磷溶解和解鉀培養(yǎng)基對已篩得菌株的進行平板培養(yǎng)。結果表明（見表3），菌株SM1-1、SM1-2和EM2-2在無氮培養(yǎng)基上的生長勢顯著強于其他菌株，其具有較強的固氮能力。對于菌株對無機磷的溶解能力，則表現為除EM1-2、EM2-1和EM2-3之外，其他菌株的溶解無機磷能力均較強。而篩選出的菌株對有機磷的溶解能力均較強，其中EM2-3的溶解能力最弱。對于解鉀能力，菌株SM1-1、SM1-2、EM1-1、EM1-3和EM2-2的溶解能力較強，其他菌株的溶解能力均較為微弱。綜上可知，菌株SM1-1和SM1-2能夠有效溶解土壤中難溶性的養(yǎng)分，同時具有較強的固氮能力，是果園中優(yōu)質的促生菌株。

2.4? 優(yōu)勢菌種的生物鑒定及形態(tài)觀察

通過革蘭氏染色法對SM1-1和SM1-2進行顯微鏡觀察（見圖2），結果表明，SM1-1和SM1-2均為革蘭氏陽性菌，且均呈現桿狀。為了進一步判定菌種的種屬，通過高通量測序后對菌種的DNA序列進行比對，結果表明SM1-1屬于熱羧基鏈霉菌屬（Streptomyces thermocarboxydus），SM1-2屬于枯草芽孢桿菌屬（Bacillus subtilis）。

3? 討論及結論

自由生活在植物根部或植物體內的一系列能夠促進植物生長發(fā)育的有益微生物為植物促生菌［10］。因此，選擇果園根際土壤進行植物促生菌的提取是可取的。通過對不同果園根際土壤微生物進行室內培養(yǎng)，結果發(fā)現，不同處理條件對果園根際土壤可培養(yǎng)微生物的數量及培養(yǎng)的稀釋濃度不盡相同。有機培肥能夠增加土壤中微生物的豐富度，但是減少了可培養(yǎng)微生物的數量，因此，有機培肥果園根際土壤的可培養(yǎng)微生物最佳篩選濃度為10-2、10-3。

在旱作條件下，增施有機肥、果園生草覆蓋或秸稈還田等措施能有效提高土壤有機質含量，增加土壤中養(yǎng)分的儲蓄［11］，改善土壤蓄水能力［12］。但是，生草覆蓋或秸稈還田后，在旱作條件下纖維素、半纖維素和木質素等的降解緩慢，是造成有機培肥后旱作土壤養(yǎng)分提高減慢的主要原因［13-14］，而纖維素分解菌則能有效促進纖維素的分解與養(yǎng)分的釋放。因此，本研究從纖維素分解菌的分離純化入手，分別從5個處理的土壤中篩選出10株具有纖維素分解能力的菌體。而纖維素分解菌在纖維素培養(yǎng)基上產生水解圈的大小可以代表纖維素分解菌的分解能力，進一步通過分解圈的測定發(fā)現，SM3-1和SM3-2菌株的纖維素分解能力最佳，分別為3.83和3.55。

在旱作條件的果園中，土壤養(yǎng)分的匱乏同樣是制約果樹產量與果實品質的重要因素［15］。因而，具有固氮、解磷解鉀能力的菌株在有機培肥果園中則能發(fā)揮出更大的養(yǎng)分提升作用。通過進一步對篩得菌株固氮、解磷和解鉀功能的分析，發(fā)現菌株SM1-2和SM1-1不僅具有纖維素分解能力，且同時具有良好的固氮、解磷和解鉀功能。因而，SM1-1和SM1-2是旱作果園有機培肥過程中友好的菌株。通過顯微鏡觀察發(fā)現，SM1-1和SM1-2均為革蘭氏陽性菌，進而通過高通量測序鑒定兩菌分別為熱羧基鏈霉菌和枯草芽孢桿菌。

通過本試驗得到兩株適合山西旱區(qū)果園有機培肥過程中，既能高效分解還田的纖維素物質，同時能夠起到固氮、溶解土壤及有機肥中固定態(tài)無機磷、有機磷和鉀元素的菌株。本研究結果為山西有機旱作果園發(fā)展提供了微生物菌劑研發(fā)的原材料，能夠促進旱作條件下有機果園的高效利用。

中文致謝

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