基于ITS 序列PCR-RFLP 鑒別大薊藥材及飲片中摻偽飛廉、魁薊的方法研究*

張?jiān)娙A，賴(lài)晶，倪琳，宋平順，李辰荃，郭朝暉

（1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，蘭州 730030；2.甘肅省藥品檢驗(yàn)研究院，蘭州 730070）

大薊作為常用中藥材，2020 年版《中國(guó)藥典》一部中規(guī)定其為菊科植物薊（Cirsium japonicum Fisch.ex DC.）的干燥地上部分，具有涼血、止血，化瘀解毒、消癰的功效，在臨床上常用于衄血，吐血，尿血，便血，崩漏，外傷出血，癰腫瘡毒[1]。飛廉（Carduus crispus L.）是菊科飛廉屬二年生或多年生草本植物，收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)藏藥》第一冊(cè)，具催吐，常用于消化不良，培根病，瘡癤，癰疽等癥[2]。魁薊（Cirsium leo Nakai et Kitag.）是菊科薊屬植物，又名刺兒菜。大薊作為市場(chǎng)主流商品，在商品流通中常常被混淆。三者均為菊科植物，因親緣關(guān)系較近，性狀、顯微組織十分相似，化學(xué)成分的特異性不強(qiáng)，采用傳統(tǒng)的鑒別方法難以鑒別，現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中缺乏專(zhuān)屬性的檢驗(yàn)方法。在中藥市場(chǎng)中可能會(huì)存在以飛廉、魁薊冒充大薊或摻入到大薊中進(jìn)行買(mǎi)賣(mài)，這嚴(yán)重影響到臨床用藥安全。因此，建立一種將大薊、飛廉、魁薊等易混品種區(qū)分開(kāi)的分子遺傳標(biāo)記鑒別方法顯得尤為重要[3]。PCR-RFLP 即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性，這種方法是在聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）的基礎(chǔ)上，對(duì)特異性片段進(jìn)行切割，然后通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳法進(jìn)行檢測(cè)，其具直觀、靈敏、重現(xiàn)性好、專(zhuān)屬性高等特點(diǎn)。近些年來(lái)，PCR-RFLP 運(yùn)用于石斛[4]、川貝母[5]的鑒別研究，快速篩選高純合度天麻[6]，木香[7]、當(dāng)歸[8]、羅布麻[9]、覆盆子[10]等中藥材的真?zhèn)舞b別中得到應(yīng)用。但將PCR-RFLP 技術(shù)應(yīng)用在大薊真?zhèn)舞b別方面的研究較少，因此亟需建立一種鑒別大薊及易混品的檢測(cè)方法。本研究利用PCRRFLP 技術(shù)，篩選出飛廉和魁薊的酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)引物后對(duì)PCR-RFLP 方法優(yōu)化，建立了鑒別大薊易混品飛廉、魁薊的專(zhuān)屬性檢測(cè)方法。

1 材料與儀器

1.1 材料 大薊對(duì)照藥材（批號(hào)：121411-201903）小薊對(duì)照藥材（批號(hào)：121436-201803）均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院。本研究中的大薊、小薊、飛廉、魁薊、絲路薊、花葉滇苦菜樣品均由甘肅省藥品檢驗(yàn)研究院宋平順主任藥師收集并鑒定。具體信息見(jiàn)表1。

表1 樣品來(lái)源信息表

1.2 試劑 Plant Genomic DNA Kit 2000 preps 植物DNA 提取試劑盒、2 ×Taq PCR MasterMix、D200 DNA Marker （天根生化科技北京有限公司）；2×Taq PCR StarMix（北京康潤(rùn)生物科技有限公司）；2×Easy Taq PCR SuperMix （北京全式金生物技術(shù)股份有限公司）；瓊脂糖（Invitrogen 公司）；GelRed TM 核酸凝膠染料（Biotium 公司）；限制性?xún)?nèi)切酶ApalI、限制性?xún)?nèi)切酶ZraI（NEB 北京有限公司）。

1.3 儀器 5424 R 型高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)艾本德公司）；Dry Block Heater 2 型恒溫金屬水浴鍋（德國(guó)艾卡公司）；VeritiTM 96-Well 型PCR 儀、Nano Drop one C 型微量核酸定量?jī)x（美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司）；Sub-cell GT 型瓊脂糖凝膠電泳儀（美國(guó)伯樂(lè)公司）；GelDoc-IT 315 凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)斯柏貿(mào)易北京有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 基因DNA 的提取 取藥材細(xì)粉30 mg 置于2 mL 離心管中，按照Plant Genomic DNA Kit 2000 preps 植物DNA 提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取樣品的DNA（離心半徑13 cm），另取大薊對(duì)照藥材、小薊對(duì)照藥材各30 mg，同法制成對(duì)照藥材模板DNA 溶液。將提取好的DNA 模板于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 ITS 片段擴(kuò)增與測(cè)序樣品 采用ITS 通用引物進(jìn)行擴(kuò)增，引物序列為ITS 2（F）：5’-ATGCGATACT TGGTGTGAAT-3’；ITS3（R）：5’-GACGCTTCTCCAG ACTACAAT-3’反應(yīng)體系總體積為50 μL，其中包含2×Taq PCR MasterMix 25 μL，正反引物各1 μL，DNA 模板2 μL，用無(wú)菌水補(bǔ)足至50 μL。ITS 擴(kuò)增反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性5 min，30 個(gè)循環(huán)（94 ℃30 s，56 ℃30 s，72 ℃30 s），72 ℃5 min。PCR 產(chǎn)物由上海生工有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序，以保證結(jié)果的有效性與準(zhǔn)確性。

2.3 PCR-RFLP 引物設(shè)計(jì) 利用DNAMAN 軟件對(duì)測(cè)序得到的大薊、飛廉和魁薊ITS 序列進(jìn)行比對(duì)，查找合適穩(wěn)定的變異位點(diǎn)，篩選出飛廉的酶切位點(diǎn)（GACGTC CTGCAG），魁薊的酶切位點(diǎn)（GTGCAC CACGTG），通過(guò)Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)含此酶切位點(diǎn)的鑒別引物3F-3R，送上海生工有限公司合成。引物序列為3F：5’-GGTGAACCTGCGGAAG-3’，3R：5’-GATGGTTCACGGGATTCT-3’。

2.4 瓊脂糖凝膠電泳 按照瓊脂糖凝膠電泳法（四部通則0541），膠濃度為1.5%，膠中加入核酸凝膠染色劑GelRed；供試品、對(duì)照藥材酶切反應(yīng)溶液的上樣量分別為8 μL，DNA 分子量標(biāo)記上樣量為5 μL（0.5 μg/μL）。電泳結(jié)束后，取凝膠片在凝膠成像儀上或紫外透射儀上檢視。

2.5 PCR 擴(kuò)增條件的優(yōu)化 分別選大薊、小薊、飛廉、魁薊、絲路薊、花葉滇苦菜一份樣品對(duì)特異性鑒別引物進(jìn)行PCR 反應(yīng)條件進(jìn)行考察。

2.5.1 退火溫度考察 如圖1 所示，在退火溫度52、54、56 ℃時(shí)，樣品非特異性擴(kuò)增明顯；退火溫度58、60 ℃時(shí)，樣品均在250～500 bp 范圍內(nèi)檢測(cè)到單一DNA 條帶；退火溫度升至62 ℃時(shí)，樣品擴(kuò)增率降低；為了保證良好的重復(fù)性，因此選用58～60 ℃作為退火溫度。

圖1 不同溫度PCR 擴(kuò)增電泳圖

2.5.2 循環(huán)次數(shù)考察 如圖2 所示，當(dāng)循環(huán)次數(shù)為25 時(shí)，樣品擴(kuò)增率低；循環(huán)次數(shù)為35 時(shí)，樣品出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，不利于PCR-RFLP 檢測(cè)，為保證擴(kuò)增的穩(wěn)定性，選用30 個(gè)循環(huán)。

圖2 不同循環(huán)數(shù)PCR 擴(kuò)增電泳圖

2.5.3 不同DNA 聚合酶考察 如圖3 所示，不同類(lèi)型的聚合酶均在250～500 bp 檢測(cè)出單一DNA 條帶，表明所建立的PCR 方法不受聚合酶類(lèi)型的影響，本方法以2×Taq PCR MasterMix 聚合酶作為該方法PCR 反應(yīng)的擴(kuò)增酶。

圖3 不同DNA 聚合酶PCR 擴(kuò)增電泳圖

綜上所述，PCR 反應(yīng)總體積為25 μL，其中包括正反引物各0.5 μL，2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL，DNA 模板1 μL，無(wú)菌水補(bǔ)足至25 μL。反應(yīng)條件為94 ℃5 min，30 個(gè)循環(huán)（94 ℃30 s，58 ℃30 s，72 ℃30 s），72 ℃5 min。

2.6 酶切體系條件優(yōu)化 根據(jù)《中國(guó)藥典》2020 年版四部通則1001 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法4 測(cè)定法[11]中，反應(yīng)產(chǎn)物檢測(cè)中酶切反應(yīng)總體積一般為20 μL，加入PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物一般為5～10 μL，由此可見(jiàn)底物量不同也會(huì)影響酶切后的結(jié)果，因此考察了5、8 和10 μL 3 種不同的底物量。依據(jù)限制性?xún)?nèi)切酶種類(lèi)選擇適宜反應(yīng)溫度進(jìn)行酶切，酶切反應(yīng)時(shí)間通常為2～4 h，快速限制性?xún)?nèi)切酶的反應(yīng)時(shí)間不超過(guò)1 h，所以同時(shí)對(duì)酶切時(shí)間也進(jìn)行了考察。

2.6.1 ZraI 限制性?xún)?nèi)切酶酶切條件優(yōu)化 如圖4AC 所示，酶切時(shí)間依次設(shè)置為60、90、120 min，飛廉均被ZraI 酶酶切成120 bp 和259 bp 兩條DNA 條帶，從酶切后兩條DNA 的亮度和清晰度判斷，酶切時(shí)間選為120 min。如圖4D-F 所示，當(dāng)?shù)孜锪繛? μL 時(shí)，底物量過(guò)低，影響結(jié)果判斷；隨著底物量的增大，酶切后的兩條帶DNA 條帶變亮，因此底物量選為8 μL。綜上所述，ZraI 限制性?xún)?nèi)切酶的酶切反應(yīng)體系為：ZraI 酶0.5 μL、NEBuffer 2 μL、擴(kuò)增產(chǎn)物8 μL，無(wú)菌水補(bǔ)足至20 μL；反應(yīng)條件為：37 ℃酶切120 min。

圖4 ZraI 酶不同酶切時(shí)間及底物量電泳圖

2.6.2 ApaLI 限制性?xún)?nèi)切酶酶切條件優(yōu)化 如圖5A-C 所示，酶切時(shí)間依次設(shè)置為30、60、90 min，魁薊均被ApaLI 酶酶切成126 bp 和253 bp 兩條DNA條帶，隨著酶切時(shí)間的增長(zhǎng)，酶切后的兩條DNA 條帶變亮，考慮條帶的亮度和清晰度，酶切時(shí)間選為60 min。如圖5D-F 所示，當(dāng)?shù)孜锪繛? μL 時(shí)，底物過(guò)低，影響結(jié)果判斷；底物量為10 μL 時(shí)，底物過(guò)高，酶切效果不佳；當(dāng)?shù)孜锪窟x擇為8 μL 時(shí)，酶切效果最好。綜上所述，ApaLI 限制性?xún)?nèi)切酶反應(yīng)體系：ApaLI 酶0.5 μL、NEBuffer 2 μL、擴(kuò)增產(chǎn)物8 μL，無(wú)菌水補(bǔ)足至20 μL；酶切反應(yīng)條件為：37 ℃酶切60 min。

圖5 ApalI 酶不同酶切時(shí)間和底物量電泳圖

2.7 適應(yīng)性考察 對(duì)不同產(chǎn)地的大薊、飛廉、魁薊等藥材進(jìn)行上述PCR-RFLP 反應(yīng)鑒別。結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有樣品均能擴(kuò)增出一條379 bp 的DNA 條帶。飛廉均被ZraI 酶酶切成120 bp 和259 bp 兩條DNA 條帶（結(jié)果見(jiàn)圖6）；魁薊均被ApaLI 酶酶切成126 bp和253 bp 兩條DNA 條帶（結(jié)果見(jiàn)圖7）。由此可見(jiàn)該P(yáng)CR-RFLP 方法可以對(duì)大薊的混偽品飛廉、魁薊進(jìn)行快速鑒別。

圖6 飛廉適應(yīng)性考察電泳圖

圖7 魁薊適應(yīng)性考察電泳圖

2.8 摻偽比例考察 將易混品飛廉、魁薊分別依次按照0%、1%、3%、5%、10%、25%、50%、75%、100%的質(zhì)量百分比比例摻入大薊藥材中，混合均勻后提取DNA，用PCR-RFLP 方法鑒別。摻入比例為0%的樣品，檢出一條379 bp 的DNA 條帶，均未檢出酶切后的兩條DNA 條帶；大薊中摻入1%飛廉時(shí)，檢出很淡的兩條DNA 條帶，但大薊中摻入3% 以上的飛廉時(shí)，所有樣品均檢出120 bp 和259 bp 兩條DNA 條帶（結(jié)果見(jiàn)圖8）。大薊中摻入1%魁薊時(shí)，也檢出很淡的兩條DNA 條帶，但大薊中摻入3% 以上的魁薊時(shí)，所有樣品均檢出126 bp 和253 bp 兩條DNA 條帶（結(jié)果見(jiàn)圖9）。酶切條帶的亮度與摻偽樣品含量呈正相關(guān)，說(shuō)明摻偽樣品比例越高，酶切后條帶越顯著。

圖8 飛廉摻偽比例考察電泳結(jié)果圖

圖9 魁薊摻偽比例考察電泳結(jié)果圖

3 討論

目前對(duì)大薊、飛廉和魁薊的研究多集中在藥理藥效和化學(xué)成分方面，對(duì)物種基原的鑒別研究甚少。李治昊等[12]對(duì)大薊和魁薊的含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大薊和魁薊中均能檢出蒙花苷和綠原酸。大薊和魁薊在藥用方面具有極大相似性。此外還有研究發(fā)現(xiàn)，飛廉和魁薊雖同屬菊科植物，但不具有上述功效，所以不能代替大薊藥用。大薊可抑制結(jié)核桿菌的生長(zhǎng)[13]。萬(wàn)成杰[14]采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)，研究大薊中單體化合物HP01 干預(yù)結(jié)核桿菌Kat G 基因的轉(zhuǎn)錄。張景景等[15]研究表明ITS2 序列可以作為鑒定大薊藥材及其近緣混偽品，但對(duì)于大薊中摻入飛廉或者魁薊并未有直接方法來(lái)鑒別。張峻銓等[16]對(duì)大薊進(jìn)行RAPD 反應(yīng)，采用SAS 統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)樣品的PCR 結(jié)果進(jìn)行了UPGMA（非加權(quán)類(lèi)平均法）聚類(lèi)分析表明，分子標(biāo)記在薊柄銹菌的劃分與鑒定上具有很高的靈敏度與準(zhǔn)確性。且來(lái)源地越靠近、孢子類(lèi)型相同、采集時(shí)間越接近的樣品親緣關(guān)系越相近。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)大薊、飛廉和魁薊三者的ITS 序列對(duì)比分析，分別篩選出飛廉和魁薊的特異性限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)，設(shè)計(jì)PCR 擴(kuò)增引物，建立了大薊混偽品飛廉和魁薊的PCR-RFLP 快速鑒別方法。同時(shí)進(jìn)行了摻偽實(shí)驗(yàn)，將不同比例的飛廉與魁薊分別摻入到大薊樣品中，該P(yáng)CR-RFLP 方法可以檢測(cè)出摻入1%的混偽品飛廉和魁薊。因此本試驗(yàn)建立的PCR-RFLP 方法穩(wěn)定可行，專(zhuān)屬性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單和反應(yīng)靈敏等優(yōu)點(diǎn)[5]，可作為鑒別日常大薊混偽品飛廉和魁薊的方法。

PCR-RFLP 方法雖已在生物鑒定中廣泛應(yīng)用，但其在一定方面存在局限性，只是用目標(biāo)序列進(jìn)行體外循環(huán)，如序列有替換、單點(diǎn)突變或者缺失都可能會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)誤結(jié)論[17]。同時(shí)本試驗(yàn)也存在一定局限性，例如樣本量較少，在今后的研究中可收集更多的樣本來(lái)驗(yàn)證結(jié)論。