搭載吉西他濱的SiO2@Fe3O4納米材料抑制裸鼠胰腺癌移植瘤生長的實驗研究

全棋，管時偉，林泉，彭明暉，俞海波

溫州醫科大學定理臨床學院/溫州市中心醫院 肝膽胰外科，浙江 溫州 325000

胰腺癌是目前世界上高度惡性腫瘤之一，盡管近年來胰腺癌患者的5 年生存率有所上升，但仍低于10%[1-2]。在免疫治療對胰腺癌療效并不顯著的現今，化療仍是胰腺癌臨床治療的重要手段[3-4]。吉西他濱（gemcitabine，GEM）在卵巢癌、膀胱癌和非小細胞肺癌等多種腫瘤中取得了不錯的效果。但在胰腺癌中，GEM的臨床療效面臨兩個巨大的問題：GEM的毒副作用和GEM耐藥性。GEM的化療耐藥涉及多個方面，如藥物代謝途徑的改變、腫瘤微生物的影響和腫瘤微環境改變等[5-6]。如何改善GEM對胰腺癌的治療效果是一個值得深入研究的問題。其中一種有效改善GEM耐藥的策略是采用納米材料包載GEM，提高其遞送效率和選擇性[7]。而基于SiO2包被的Fe3O4復合納米顆粒在彌補Fe3O4較不穩定的缺點同時具有較好的水溶性，可作為一種具有應用潛力的材料。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

氨水（濃度為28%）、三氯化鐵（FeCl3）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、甲醇、乙二醇、乙酸銨、冰乙酸、鹽酸GEM、硅酸四乙酯（TEOS）購自阿拉丁公司。1640 培養基、胎牛血清FBS、胰酶、磷酸鹽緩沖液（PBS）、青霉素-鏈霉素購自Gibco公司。二甲苯、酒精、中性樹膠購自國藥公司。蘇木素伊紅（HE）染色試劑盒購自Solarbio公司。CCK-8試劑盒購自碧云天公司。PANC02小鼠胰腺癌細胞和PaEC小鼠胰腺上皮細胞購自普諾賽公司，Balb/c裸鼠購自斯貝福公司。實驗的實施得到溫州醫科大學實驗動物倫理委員會的批準（批號：xmsq2023-1361）。

1.2 SiO2@Fe3O4復合納米顆粒制備和表征

SiO2@Fe3O4復合納米顆粒的制備分為兩步（圖1）。（1）將1.5 g FeCl3、1 g PVP和2 g乙酸鈉加入乙二醇中，攪拌至完全溶解并加熱，洗滌烘干后得Fe3O4微球。（2）稱取0.2 g Fe3O4分散于無水乙醇∶水（5∶1）溶液中，隨后滴加TEOS與氨水的溶液，洗滌烘干后得SiO2@Fe3O4微球。透射電鏡（transmission electron microscopy，TEM）照片由美國FEI Talos F200S型高分辨透射電子顯微鏡測得；采用布魯克Tensor Ⅱ型傅立葉紅外光譜儀測試樣品的特征吸收峰及表面基團的變化，掃描范圍為4 000～400 cm-1進行分析。

圖1 SiO2@Fe3O4復合納米顆粒制備流程示意圖

1.3 搭載GEM的SiO2@Fe3O4納米復合材料的制備及載藥性能研究

取SiO2@Fe3O4復合納米顆粒分散于無水乙醇中，加入GEM，避光磁力攪拌。得到產物裝于透析袋中透析24 h。精密稱定GEM對照品，配制成1.0 mg/mL貯備液，用超純水稀釋成一系列標準溶液。將GEM-SiO2@Fe3O4溶液置于透析袋中透析24 h。取標準品溶液過濾后注入HPLC系統中進行測定，測得GEM標準工作曲線。取透析介質過濾后進行測定，測得游離GEM含量，計算包封率、載藥率。

1.4 藥物體外釋放實驗

稱定GEM對照品適量，配制成1.0 mg/mL貯備液，用超純水稀釋成一系列標準溶液。精密稱定1.0 mg GEM-SiO2@Fe3O4和0.1 mg GEM干燥粉末，分別溶于1 mL PBS緩沖液中。以恒定速率振蕩，分別在1、2、4、6、8、12、18、24、36、48 h時取出1 mL緩沖溶液，并補加相對應體積的緩沖溶液。取10 μL緩沖溶液通過0.22 μm過濾器過濾后注入HPLC系統中進行測定。測得緩沖溶液的峰面積，結合GEM標準曲線，計算出各個時間點的藥物釋放量，繪制體外藥物釋放曲線。體外藥物釋放曲線計算公式如下：

式中Q，累積釋藥百分率；Ct，各時間點緩沖溶液中的藥物濃度（μg/mL）；V0，緩沖溶液總體積（mL）；V，取出的緩沖溶液的體積（mL）；W，透析袋中的藥物含量（mg）。

1.5 SiO2@Fe3O4復合納米顆粒穩定性實驗

取SiO2@Fe3O4復合納米顆粒適量，分別用PBS（pH=7.4）緩沖液和RPMI-1640 培養基稀釋至0.1 mg/mL，使用Malvern Zetasizer納米粒度儀在1、2、3、4、5、6和7 d的時間內測量粒徑，取3個讀數的平均值作為結果。

1.6 細胞活性檢查

采用CCK-8 法。將PANC02 小鼠胰腺癌細胞和PaEC小鼠胰腺上皮細胞進行細胞培養及傳代并制備細胞懸液。在計數板每孔加入100 μL 5 000個細胞。過夜貼壁后，分別給予不同濃度的SiO2@Fe3O4復合納米顆粒溶液，并設定僅加細胞不加任何刺激的空白對照組和僅加培養液的溶劑對照組，每組設6 個復孔，分別避光培養48 和72 h。培養結束，棄去原培養液，加入100 μL含10% CCK8試劑的無血清培養液。1 h后在450 nm波長下測量吸光度值。

1.7 胰腺癌移植瘤裸鼠制備及體內抗腫瘤實驗

PANC02 細胞用胰酶消化后洗去胰酶并制備細胞懸液。選擇Balb/c雄性裸鼠皮下接種PANC02細胞。將24 只裸鼠隨機分為4 組，前三組分別經尾靜脈注射生理鹽水（空白對照組/NS組）、5 mg/kg的GEM（GEM組）和以5 mg/kg GEM計的GEM-SiO2@Fe3O4（GEM-SiO2@Fe3O4組）。最后一組注射以5 mg/kg GEM計GEM-SiO2@Fe3O4后麻醉并在體外接近靶區腫瘤部位施加磁場2 h（GEM-SiO2@Fe3O4-M組）。每次間隔3 d給藥一次并用游標卡尺測量腫瘤大小，計算相對腫瘤體積。實驗終點將動物處死，測量并計算腫瘤體積。將腫瘤制作組織切片，進行病理分析。游標卡尺測量腫瘤最長（a）和最短（b）部位。腫瘤體積（V）按以下公式計算：

1.8 藥物組織分布實驗

PANC02 細胞接種于裸鼠皮下。將36 只裸鼠按照體質量均分為3 組：尾靜脈注射5 mg/kg GEM（GEM組），以5 mg/kg GEM計的GEM-SiO2@Fe3O4（GEM-SiO2@Fe3O4組）和以5 mg/kg GEM計的GEMSiO2@Fe3O4，麻醉后在體外接近靶區部位施加磁場（GEM-SiO2@Fe3O4-M組）。于給藥或外加磁場處理后0.5、1、2、4 h各取3只裸鼠解剖并取心、肝、脾、肺、腎及腫瘤組織，稱定質量。

將GEM貯備液稀釋制備得到的對照品溶液用于計算校準曲線。吸取裸鼠各組織勻漿200 μL，加入GEM標準溶液適量，制成一系列濃度組織勻漿樣品。離心后，將有機相蒸發干燥，殘渣溶解后混合離心。取10 μL上清過濾后進行測定。各組織加入3倍量生理鹽水，用勻漿器制備組織勻漿液，用相同的方法得到上清液。利用校準曲線計算各樣品中GEM的濃度。

1.9 腫瘤組織切片制作

用生理鹽水沖洗組織后，干燥后放入10%甲醛固定。觀察形態學變化后，石蠟包埋，連續切片?？酒蠼涍^脫蠟-蒸餾水沖洗-蘇木素和2%伊紅染色-梯度酒精脫水-二甲苯透明-中性樹膠封片等過程，得到組織切片。最后在光學顯微鏡下觀察組織切片。

1.10 統計學分析

2 結果

2.1 SiO2@Fe3O4復合納米顆粒的FT-IR和TEM分析結果

采用傅里葉變換紅外光譜法（FT-IR）對Fe3O4、SiO2和Fe3O4@SiO2納米顆粒進行了鑒定，得到的FTIR如圖2A所示。FT-IR結果顯示Fe3O4中570 cm-1處有鐵氧鍵的伸縮振動峰[8]。SiO2中807 cm-1處是Si-OSi的伸縮振動峰，1 047cm-1處是Si-OH的不對稱振動峰，SiO2@Fe3O4復合納顆米粒中既有鐵氧鍵特征峰又有Si-O-Si和Si-OH特征峰，這說明SiO2成功包覆在Fe3O4納米顆粒上[9]。

圖2 Fe3O4、SiO2及SiO2@Fe3O4復合納米顆粒的FT-IR（A）和Fe3O4納米顆粒及SiO2@Fe3O4復合納米顆粒TEM結果（B）

從TEM中可見制得的Fe3O4顆粒為球形，粒徑大小均勻（200 nm）。此外，TEM示SiO2@Fe3O4粒徑220～260 nm，中間部分顏色較深，證明Fe3O4被包覆在里面，外層相對明亮的部分具有介孔SiO2結構，說明Fe3O4與SiO2復合顆粒制備成功（圖2B）。

2.2 SiO2@Fe3O4復合納米顆粒對GEM的載藥性能

載藥率是指單位質量或單位體積微球/納米顆粒所負載的藥量，其中能釋放的藥量為有效載藥量。除藥物與基質發生不可逆結合外，載藥量可看成是微球/納米顆粒的含藥量。包封率是指被包裹物質在納米顆粒懸液中占藥物總量的百分量。它是納米顆粒質量控制的一個重要的指標，反映了藥物被載體包封的程度。因此我們計算了SiO2@Fe3O4復合納米顆粒對GEM的載藥量和包封率。我們利用HPLC法，測定不同濃度的GEM標曲溶液，記錄峰面積，建立的回歸方程為：

結合相應標準曲線計算得出（圖3），GEM的包封率為84.8%，載藥率為7.8%。

圖3 GEM標準溶液在HPLC系統中測定的標準工作曲線

2.3 GEM-SiO2@Fe3O4復合納米顆粒的藥物體外釋放情況

與游離GEM相比，GEM-SiO2@Fe3O4復合納米顆粒12 h內的GEM釋放率達到30%，24 h左右達到50%左右，隨后維持在60%左右，而游離GEM在12 h內釋放率即達約75%（圖4）。

圖4 GEM-SiO2@Fe3O4復合納米顆粒和GEM的藥物體外釋放曲線

2.4 SiO2@Fe3O4復合納米顆的穩定性及生物相容性

SiO2@Fe3O4復合納米顆粒穩定性實驗顯示，隨著時間的變化，該納米材料的徑粒在PBS 或RPMI-1640 培養基中均無明顯變化，說明制備的納米顆粒具有一定的穩定性（圖5A）。為了進一步評估空載體SiO2@Fe3O4復合納米顆粒對PANC02胰腺癌細胞和PaEC小鼠胰腺上皮細胞的增殖影響，我們使用CCK8 檢測了細胞活性。結果顯示，兩種細胞的活性均高于80%（圖5B）。這表明細胞的生長狀態和數量未受到SiO2@Fe3O4復合納米顆粒本身材料的影響。這表明制備的納米復合顆粒無明顯的細胞毒性，生物相容性良好。

圖5 SiO2@Fe3O4復合納米顆粒的穩定性及生物相容性

2.5 GEM-SiO2@Fe3O4聯合磁場治療對裸鼠胰腺癌移植瘤的作用及安全性

從裸鼠胰腺癌移植瘤組織大體標本上看，GEM組和GEM-SiO2@Fe3O4組的裸鼠胰腺癌移植瘤體積均小于NS組，但與GEM組相比，GEM-SiO2@Fe3O4組的胰腺癌腫瘤體積更?。▓D6A）。此外，比較裸鼠胰腺癌組織質量和體積時，GEM組和GEM-SiO2@Fe3O4組之間差異無統計學意義（均P＞0.05，圖6B、6C）。外加磁場作用下的GEM-SiO2@Fe3O4與GEM組相比，顯示GEM-SiO2@Fe3O4組的胰腺癌腫瘤組織的質量和體積更少（均P＜0.05）。這表明，SiO2@Fe3O4能將GEM富集在附加磁場附近釋放，并產生顯著療效。各組心、肝、脾、肺和腎HE染色沒有顯示明顯的器官損傷跡象，表明該材料具有良好的生物相容性。與NS組相比，GEM組和GEM-SiO2@Fe3O4組腫瘤組織出現局部壞死，而GEM-SiO2@Fe3O4-M組的腫瘤組織壞死更廣泛（圖7）。

圖6 不同實驗條件下的裸鼠胰腺癌移植瘤的大小、生長曲線及質量

圖7 不同實驗條件下裸鼠心、肝、脾、肺、腎和腫瘤組織病理圖片（HE，×200）

2.6 GEM、GEM-SiO2@Fe3O4 和GEM-SiO2@Fe3O4-M的藥代動力學及組織分布

GEM-SiO2@Fe3O4的從0時到最終可定量時間點的血藥濃度-時間曲線下面積（AUC0-t）、從0到無窮大時間的血藥濃度-時間曲線下面積（AUC0-∞）升高（均P＜0.01），平均駐留時間（MRT0-∞）、末端消除半衰期（t1/2β）延長（均P＜0.05），清除率（CL）顯著降低（P＜0.001），表明該材料可延長GEM的半衰期并延長其在體內的作用時間。表觀分布容積（Vd）顯著升高（P＜0.01），說明藥物在全身分布且有可能在某臟器濃集（表1）。游離GEM在裸鼠肝、腎組織內分布較多，GEM-SiO2@Fe3O4除在肝腎中分布外，在腫瘤組織中的分布有增加，且消除較慢（圖8）。在外加磁場的作用下，GEM在腫瘤組織中富集更明顯。

表1 GEM組、GEM-SiO2@Fe3O4組和GEM-SiO2@Fe3O4-M組的藥代動力學結果

圖8 GEM組、GEM-SiO2@Fe3O4組和GEM-SiO2@Fe3O4-M組中的GEM在不同時間下心、肝、脾、肺、腎和腫瘤中的分布濃度

3 討論

在本研究中，我們通過TEM和FT-IR對SiO2@Fe3O4的結構進行表征，結果顯示SiO2成功實現了對Fe3O4顆粒的包被。既往研究已表明裸露的Fe3O4顆粒結構在有氧環境中極不穩定，而SiO2具有低毒性、高親水性等特點[10-11]。基于SiO2包被的Fe3O4納米顆粒具有較好的水溶性，并且部分彌補了Fe3O4較不穩定的缺點，為改善GEM的化療耐藥提供了實踐基礎[12]。

此前研究表明，SiO2@Fe3O4可與藥物聯合治療腫瘤。Shahabadi等[9]的研究表明，Fe3O4@SiO2復合納米顆?？勺鳛橐环N有效載體，提高阿糖胞苷的生物利用度，增強其對早幼粒細胞白血病的療效。此外，GEM-SiO2@Fe3O4復合納米顆粒的維持時間較游離GEM長。這表明我們設計的GEM-SiO2@Fe3O4可以持久地釋放。這可以減少突釋效應的同時起到藥物緩釋的作用。為了降低GEM的毒性，提高其治療效果，其中一種方法是通過納米載體包載GEM，提高其遞送效率和選擇性[7]。本研究初步證明SiO2@Fe3O4納米顆粒在體外具有一定的穩定性及組織相容性。并且相較于游離GEM，有附加磁場下的GEMSiO2@Fe3O4有更好的抗腫瘤效果，并且不會損傷正常組織。但附加磁場下的GEM-SiO2@Fe3O4抗腫瘤效果與游離GEM相比未顯示出統計學意義上的差異。部分原因可能是由于納米顆粒粒度小，使得納米顆粒易穿出血管而滯留于腫瘤組織，因此藥物相對富集，但被動靶向的作用有限。此外，藥代動力學結果顯示，SiO2@Fe3O4可延長GEM在體內的作用時間，并增加GEM在腫瘤組織中的濃度。但關于SiO2@Fe3O4納米材料在體內的副反應和毒性仍需后續實驗進一步驗證。此外，搭載GEM的SiO2@Fe3O4在裸鼠內的毒副反應也需進一步實驗明確。本研究中，我們依據SiO2@Fe3O4復合納米顆粒設計了一種全新的GEM藥物遞送材料，初步證實其在胰腺癌移植瘤裸鼠中發揮GEM的治療效果的同時，也展示了良好的生物安全性。本研究結果為后續胰腺癌的治療提供一定的實驗基礎，也為將來胰腺癌治療的策略提供借鑒。