大麥條紋病菌基因Pgr03902致病功能研究

祁天濤 司二靜 郭銘 孟亞雄 姚立蓉 汪軍成 馬小樂 李葆春 楊軻 尚勛武 王化俊

關鍵詞：大麥條紋病菌；RNA干擾；遺傳轉化；致病性

大麥病害種類多樣，其中由真菌麥類核腔菌Pyrenophora grarnznea侵染導致的條紋病（barleyleaf stripe）是大麥的主要病害之一，嚴重影響大麥的產量和品質。病原菌侵染后，大麥葉片上產生和葉脈平行的條紋狀病斑并不斷延展，最終引發葉片枯死，穗部發生畸變不結實或種子帶菌。發病嚴重年份可造成70%以上的產量損失。目前，大麥條紋病的主要防治措施為建立無病種子田、化學藥劑防治、栽培管理防治及選育推廣抗條紋病品種。無論是非生物防治措施還是生物防治措施，其前提是要充分了解大麥條紋病菌的致病機理。

病原菌侵染植物的過程中會分泌一些效應蛋白，這些蛋白可通過多種方式抑制植物產生免疫反應，從而促進病原菌侵染，最終導致植物品種的抗病性喪失。同時，植物病原微生物在與寄主植物互作過程中會促使致病相關基因過量表達，其編碼的蛋白在被植物抗病基因編碼的蛋白識別后可引起植物的免疫反應，在不被植物識別的情況下則表現為毒性功能。到目前為止，研究人員已對不同病原菌效應蛋白的功能進行了研究，如Joe等發現基因RXLR編碼的蛋白AVR3a與信號肽和半胱氨酸的分泌有關；張茜茜等發現稻瘟病菌Pyriculariaorzae效應蛋白MoIEEP1分泌到胞外引起寄主細胞死亡，并證明了該蛋白通過與寄主植物線粒體或過氧化物酶體上的蛋白受體互作表現出致病性；Liu等和Singh等分別構建了產黃青霉Penicilliumchrysogenum、長孢輪枝菌Verticilliurn longispo-rum等真菌致病基因的RNA干擾（RNA interfer-ence，RNAi）載體，用于研究致病相關基因的功能；郭銘運用RNAi技術研究大麥條紋病菌效應子基因Pgr07060的功能，結果表明該基因與大麥條紋病菌的致病性密切相關，Pgr07060下調表達后，干擾菌株的生長速率和致病力均顯著降低。

目前，大麥條紋病菌基因組測序已完成，加速了其致病相關基因的功能研究進程。本課題組前期通過大麥條紋病菌與大麥互作的轉錄組分析篩選出在侵染早期高效表達的效應蛋白編碼基因pgFr03902，本研究通過生物學信息分析、表達模式分析、亞細胞定位和RNAi菌株在生長速率、菌絲形態和致病性差異上的研究，初步解析大麥條紋病菌基因Pgr03902的功能，為進一步研究大麥條紋病菌致病機制及防治奠定基礎。

1材料與方法

1.1試驗材料

植物材料包括大麥‘Alexis’和本氏煙Nicoti-ana bentharniana。供試大麥條紋病菌為野生型菌株QWC。用于遺傳轉化的菌株包括農桿菌Agrobacteriurn turn.efaciens GV3101和大腸桿菌E.schrichia coli DH5a。pSilent-l干擾載體由河北農業大學曹志艷教授惠贈；亞細胞定位載體PCAM-BIA1300-35S-EGFP及pMD-19 simple vector T載體由本實驗室保存。用于大麥條紋病菌菌株QWC生長的LB（Luria-Bertani）培養基、馬鈴薯葡萄糖（potato dextrose，PD）培養基、馬鈴薯葡萄糖再生（potato dextrose regeneration，rPD）培養基及原生質體轉化所使用的試劑配方均參考文獻的方法。

1.2生物信息學分析

測序得到的序列利用NCBI ORF finder尋找基因Pgr03902開放閱讀框（ORF，https：∥WWW．nc-bi．nlm. nih. gov/orffinder/）并進行序列翻譯。分別登錄ProtParam（https：//web. expasy. org/prot-param/）、SOPMA（ https：∥npsa-prabi. ibcp. fr/cgi-bin/npsa_automat. pl？

page-npsa_sopma. html）、ProtScale（ https：∥web. expasy. org/protparam/）、SignaIP-5.0（http：∥www. detaibio. com/tools/in-dex. php？r=signal-peptide% 2Findex）和Gen-Script（https：∥www. genscript. com/tools/psort），預測該基因編碼蛋白的理化性質、二級結構、親疏水性、信號肽和亞細胞定位。

1.3基因Pgr03902在大麥條紋病菌與大麥互作時的表達量分析

將大麥條紋病菌菌株QWC接種于PDA培養基中，于（25±1）℃的真菌培養箱里培養7d，備用；同時，選取粒大飽滿的大麥品種‘Aleixs’種子90粒，用70%乙醇和5%次氯酸鈉分別處理30s、5min，然后用滅菌超純水沖洗多次后，將種子徹底晾干，備用。采用“三明治法”用培養7d的QWC菌餅處理‘Aleixs’種子，分別在處理后第0、7、14、18天收集種胚，設置3次重復。收集的樣品在廣州基迪奧生物科技有限公司進行轉錄組學分析，獲得Pgr03902基因表達情況。

1.4Pgr03902基因亞細胞定位載體的構建及遺傳轉化

1.4.1Pgr03902基因的PCR擴增

根據亞細胞定位載體PCAIVIBIA1300-35S-EGFP質粒上的多克隆位點及Pgr03902基因中CDS序列設計亞細胞定位引物EGFP-Pgr03902-F和EG-FP-Pgr03902-R（表1），以菌株QWC的cDNA為模板擴增Pgr03902全長序列。PCR反應體系與程序參照2×TransTaq HiFi PCR SuperMixⅡ聚合酶說明書（天根生化科技有限公司）。擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，符合預期產物大小的條帶用DNA膠回收試劑盒（天根生化科技有限公司）回收，與pMD19-T載體連接并轉化大腸桿菌DH5a感受態細胞，篩選的陽性克隆由北京擎科生物科技有限公司完成測序，測序結果正確的菌液提取質粒備用。

1.4.2Pgr03902基因亞細胞定位載體的構建

大麥條紋病菌基因Pgr03902和PCAM-BIA1300-35S-EGFP載體質粒分別用Kpn1和Xba1雙酶切并回收酶切產物，16℃恒溫水浴過夜連接酶切產物。反應體系：Pgr03902 4uL，PCAM-BIA1300-35S-EGFP 1uL，Solution5uL。連接液轉化大腸桿菌DH5a感受態細胞，通過亞細胞定位引物M13-R和Primer4（表1）對菌液進行PCR擴增，提取陽性質粒并保存菌液，獲得亞細胞定位載體PCAMBIA1300-35S-EGFP-Pgr03902.

1.4.3Pgr03902基因的遺傳轉化

采用熱激法將亞細胞定位載體PCAM-BIA1300-35S-EGFP-Pgr03902導入到農桿菌GV3101中，取處于生長期的本氏煙葉片，利用注射法轉染煙草，通過激光共聚焦顯微鏡觀察熒光信號檢測Pgr03902在細胞內的表達位置。

1.5Pgr03902基因干擾載體的構建及遺傳轉化

1.5.1Pgr03902基因干擾片段的PCR擴增

根據載體質粒上的多克隆位點及Pgr03902基因中CDS全長序列設計Pgyr03902的干擾片段引物Pgr03902-Xho1-F/Pgr03902-HindⅢ-R和Pgr03902-Kpn1-F/Pgr03902-Bg/Ⅱ-R（表1），以菌株QWC的cDNA為模板擴增干擾片段Pgr03902-1和Pgr03902-2。PCR反應體系與程序以及載體構建方法同1.4.1。

1.5.2Pgr03902基因干擾載體的構建

取干擾片段Pgr03902-1和含載體pSilent-1的質粒，分別進行Kpn1和BglⅡ雙酶切（10×MBuffer），瓊脂糖凝膠電泳檢測雙酶切產物，符合預期產物大小的條帶切膠純化后與載體過夜連接，用Pgr03902-1的引物，對篩選出的pSilent-1-Pgr03902-1進行菌液PCR和雙酶切驗證；再取干擾片段Pgr03902-2和構建的pSilent-1- Pgr03902-1載體進行雙酶切，方法同上，最終獲得pSilent-1-Pgr03902干擾載體。

1.5.3Pgr03902基因干擾片段的遺傳轉化

使用酶解液（10mg/ml。溶壁酶+20mg/ml。纖維素酶R-10）裂解大麥條紋病菌菌株QWC菌絲細胞壁，制備新鮮的原生質體，再取pSilent-1-Pgr03902干擾載體質粒（1～5mg）與原生質體混合，室溫孵育20min后逐滴加入PTC溶液（60%PEG4000，10mmol/L CaCl，10mmol/L Tris-HC1，pH7.5）脅迫，之后將該混合物倒入含潮霉素B（hy-gromycin B．Hyg B）的PDA培養基中培養，對菌落進行3代抗性篩選，至篩選出Pgr03902干擾菌株Pgr03902。

1.6干擾菌株的Hyg B鑒定及RT-qPCR檢測

采用特異性引物Hyg B-F、Hyg B-R（表1）對干擾菌株△Pgr03902的Hyg B抗性基因進行PCR檢測，對鑒定正確的干擾菌株提取RNA合成cD-NA，對干擾菌株進行實時熒光定量PCR分析（引物見表1）。獲得干擾菌株Pgr03902基因的循環閾值（Ct），以大麥條紋病菌的Actin為內參基因，將野生菌株QWC的Pgr03902基因表達量設為1，計算得出各干擾菌株的基因相對表達量，干擾率=100%一表達量%，試驗設置3次重復。

1.7基因功能初步分析

1.7.1營養生長分析

使用打孔器在野生型菌株QWC和干擾菌株菌落邊緣各打取5 mm菌餅，分別接種于PDA培養基上，并置于22℃黑暗環境下培養，試驗設置3次重復。在第7天時測量菌落直徑并觀察菌落形態，拍照。

1.7.2致病性測定

采用“三明治法”進行人工接種試驗。將滅菌處理后的‘Aleixs’種子擺放在長滿菌絲的PDA培養基上，用另一長滿菌絲的PDA培養基的皿覆蓋在種子上，密封后置于6℃黑暗條件下侵染種子21d。分別用野生型菌株QWC和干擾菌株△Pgr03902進行接種，以空白PDA培養基為對照，設置3次重復。然后將種子種植于長×寬×高=10cm×10cm×10cm的小花盆中，于人工氣候室中光暗各12h交替（黑暗溫度12℃和光照溫度20℃）生長。參照劉海穎等的研究方法，于大麥三葉期對條紋病原菌處理后的大麥統計病情指數。

病情指數（DI）=∑（各級病株數×發病級值）／（最高病級值×調查總株數）×100。

利用Excel 2016對試驗數據進行匯總和處理，通過單因素方差分析（One-way ANOVA）比較大麥植株接種野生型菌株QWC和干擾菌株APgr03902的差異，結果用Excel 2016作圖。

2結果分析

2.1Pgr03902基因編碼產物的生物信息學分析

Pgr03902基因全長348 bp，編碼116個氨基酸，對該基因編碼蛋白的理化性質的預測結果表明：該蛋白是酸性蛋白，等電點約為6.53，分子量29.25kD，組成氨基酸中甘氨酸（Gly）占比最多，為14.3%。Pgr03902編碼蛋白的二級結構中無規則卷曲占比最多，為39.66%，其次是延伸鏈和a螺旋，占比分別為27.59%和23.28%，轉角最少，為9.48%。該基因編碼蛋白脂溶系數為26.15，分子式是C553 H862 N148 0165，S5，不穩定性指數為41.95，并且親疏水性評分峰值主要在0以上，因此預測該蛋白為不穩定的疏水性蛋白。軟件預測該蛋白無可識別的信號肽區域。亞細胞定位預測該蛋白存在于細胞膜。

2.2大麥條紋病菌效應蛋白編碼基因Pgr03902表達特性分析

通過轉錄組學分析大麥條紋病菌侵染種子過程中Pgr03902的表達特性，結果表明，Pgr03902在接種后第0、7、14、18天時的基因表達量分別為113. 46、610. 59、715. 10、1193. 95 FPKM，較對照分別增加了5. 38、6.30、10. 52倍，隨著侵染時間的延長，Pgr03902的表達量顯著上調（圖1），說明其可能在大麥條紋病菌侵染大麥及在大麥體內生長繁殖過程中發揮重要作用。

2.3Pgr03902基因亞細胞定位載體的構建與農桿菌轉化

由Pgr03902基因亞細胞定位引物M13-R和Primer 4對大腸桿菌轉化子進行Pgr03902基因的菌落PCR，發現部分轉化子的擴增產物為1000bp（圖2），表明成功構建Pgr03902基因的亞細胞定位載體EGFP-Pgr03902。最后，利用目的基因擴增引物EGFP-Pgr03902-F和EGFP-Pgr03902-R，對農桿菌轉化子再進行Pgr03902基因PCR擴增驗證，擴增片段大小為546bp（圖3），進一步對轉化子進行測序驗證，結果表明Pgr03902基因已成功轉化到農桿菌中。

2.4Pgr03902基因在本氏煙中的亞細胞定位

用含PCAMBIA1300-35S-EGFP-Pgr03902和空載體PCAMBIA1300-35S-EGFP的質粒分別轉染煙草，熒光顯微鏡下均能觀察到綠色熒光，亞細胞定位結果顯示，Pgr03902在細胞核和細胞膜中均有表達（圖4）。

2.5Pgr03902基因干擾菌株的篩選與驗證

采用PCR從干擾菌株中獲得Pgr03902基因的干擾片段長度為271bp，對干擾載體進行雙酶切，得到的條帶大小與Pgr03902干擾片段和pSilent-1載體一致，表明成功構建Pgr03902基因的干擾載體pSilent-1-Pgr03902。

本試驗共篩選出1個干擾菌株，通過Hyg B的特異性引物進行PCR驗證，獲得1026bp的HygB基因（圖5a）。RT-qPCR結果表明，與大麥條紋病菌野生型菌株QWC相比，干擾菌株△Pgr03902的Pgr03902基因相對表達量顯著降低了60.79%（P<0.05）（圖5b）。

2.6突變菌株的營養生長分析

分別于PDA平板上接種野生型菌株QWC和干擾菌株△Pgr03902（圖6），發現它們的菌落均為白色，平坦，邊緣有微小的鋸齒，但干擾菌株菌絲較野生型菌株稀疏。于接種第7天測量各菌株的菌落直徑，干擾菌株的菌落直徑為（2. 32±0.14）cm，小于野生型菌株[（4.72±0.11）cm]，表明干擾菌株生長減緩。

2.7干擾菌株的致病性分析

分別用野生型菌株QWC和干擾菌株△Pgr03902浸染大麥‘Alexis7的種子，于大麥三葉期觀察發病癥狀（圖7a）并統計病情指數（圖7b），結果顯示，QWC和干擾菌株APgr03902浸染引起的病情指數分別為（51.53±4.23）和（37.86±3.36），APgr03902侵染后病情指數顯著低于QWC，說明APgr03902的致病性明顯減弱，Pgr03902基因可能參與調控大麥條紋病菌的致病性。

3結論與討論

病原菌基因功能的研究結果有助于闡明其致病機理的遺傳背景，也可以為防控植物病害提供新的策略和抗性育種信息。大量研究表明，病原菌致病相關基因在侵染寄主時表達量較高。本研究通過轉錄組學分析了Pgr03902基因在大麥條紋病菌與大麥互作時的表達量，發現Pgr03902基因的表達量在侵染過程中隨侵染時間延長而升高，表明Pgr03902基因可能在大麥條紋病菌對大麥的致病過程中起到關鍵作用。研究表明，絲狀真菌入侵寄主日寸，疏水蛋白參與了這一復雜的過程。疏水蛋白可以在親水一疏水界面自我組裝成膜，形成較穩定的多聚體膜，使絲狀真菌菌絲避開水環境，誘導某些特化結構及毒素產生等。本研究通過生物信息學分析預測該基因編碼的蛋白為不穩定的疏水性蛋白，說明該基因可能參與調控病原菌致病性。細胞核作為植物和動物細胞中的最重要的細胞器之一，在寄主的免疫反應過程中起著非常重要的作用，生物信息學預測該基因只位于細胞膜部位，但采用農桿菌介導的瞬時表達對基因Pgr03902進行亞細胞定位分析顯示，其在細胞核和細胞膜上均有表達，兩者結果不一致，有待進一步驗證。

病原菌與寄主間能否建立親和互作關系，往往是由于病原菌中能夠干擾寄主正常生理代謝功能的致病基因發揮重要的作用，該基因會調控病原菌對寄主的吸附、感染、定殖等過程；有些致病基因的表達產物具有雙重作用，一方面可以致毒，另一方面也可以充當激發子。目前，RNAi技術已經在多數真核生物病原菌基因功能驗證方面有大量應用，利用RNAi技術能夠有效地抑制基因表達，對基因的功能研究具有重要意義。夏楊等對膠孢炭疽菌Colletotrichum. gZoeosporioides

CgCDC2基因沉默突變株的PG、PL基因的表達進行分析，結果顯示，突變體菌株的PG、PL基因表達量均顯著下調，并且與蛋白定量分析結果一致，說明CgCDC2參與調控PG、PL基因的表達；蘇初連等通過PEG介導法成功獲得膠孢炭疽菌泛素結合酶基因CgUBC2的RNAi沉默突變體，研究結果顯示該基因參與調控膠孢炭疽菌的致病過程；侯靜靜通過營養生長、毒素試驗及致病性試驗研究大麥條紋病菌致病性候選基因Pgrnior的功能，發現干擾菌株生長速度和致病力均明顯低于野生型菌株，說明該基因參與調控大麥條紋病菌的致病性。在本研究中，基因Pgr03902的干擾突變顯著影響了大麥條紋病菌的營養生長，并且干擾菌株侵染大麥后引起的發病率較QWC菌株降低，表明Pgr03902基因參與調控大麥條紋病菌致病性。