西藏昌都市卡若區(qū)蔬菜主要病毒檢測及番茄斑萎病毒鑒定

鄭寬瑜 熊智琦 魏治鐳 吳闊 王茂森 蘇曉霞 巴宗 次仁措姆 王田田 張仲凱

關(guān)鍵詞：高原；番茄；辣椒；萵苣；番茄斑萎病毒

為解決農(nóng)民增收和蔬菜供應(yīng)的問題，西藏自治區(qū)將蔬菜產(chǎn)業(yè)作為重點產(chǎn)業(yè)進行扶持發(fā)展。2021年昌都市蔬菜種植面積已達4335.5hm2，其中露地蔬菜面積4057.36hm2，設(shè)施蔬菜面積達278.14hm2。種植的蔬菜種類主要有：萵苣、青椒、番茄、小白菜、大白菜、結(jié)球甘藍、黃瓜、蔥、蒜苗、香菜、蘿卜、菠菜和花菜等。昌都市卡若區(qū)主要蔬菜為溫室和大棚種植的番茄、辣椒和生菜，露地種植的主要有萵苣、白菜和辣椒。西藏大部分蔬菜種植地區(qū)處于3000m以上的高海拔地區(qū)，露地種植的蔬菜病害發(fā)生較少，溫室和大棚蔬菜近年來發(fā)展較快，病毒病和白粉病發(fā)生普遍。其中，昌都市卡若區(qū)溫室和大棚蔬菜及露地栽培的番茄、辣椒和萵苣病毒病發(fā)生普遍，引起嚴重減產(chǎn)，蔬菜質(zhì)量下降。本項目開展之前，該區(qū)域尚無對蔬菜病害開展系統(tǒng)調(diào)查和研究的工作。近年來全球番茄、辣椒和萵苣主產(chǎn)區(qū)病毒病發(fā)生普遍，其中，番茄和辣椒上主要有薊馬傳播的正番茄斑萎病毒屬Orthotospooirus病毒引起的斑萎病和菜豆金色花葉病毒屬Begornoozrus病毒引起的曲葉病，侵染番茄的病毒類致病因子（包括病毒、衛(wèi)星病毒、病毒衛(wèi)星分子和類病毒）多達312種，侵染辣椒的病毒多達62種，侵染萵苣的病毒10余種。

為明確昌都市卡若區(qū)的蔬菜主要病毒種類，本研究對昌都市卡若區(qū)溫室和大棚及露地栽培的蔬菜主要病毒病害進行系統(tǒng)調(diào)查，對侵染蔬菜的主要病毒進行檢測鑒定。通過ELISA檢測明確昌都市卡若區(qū)蔬菜主要病毒種類，進一步以電子顯微鏡制樣觀察、RT-PCR擴增及序列分析鑒定主要病毒，為西藏高原蔬菜生產(chǎn)中病毒病綠色防控提供指導(dǎo)。

1材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1材料

于2020年6月-10月在西藏自治區(qū)昌都市卡若區(qū)對溫室、大棚和露地栽培蔬菜進行病毒病調(diào)查。采集感染病毒病的番茄、辣椒和萵苣葉片和果實樣品共計42份。

1.1.2主要試劑

負染色制樣試劑為戊二醛固定液，鉬酸銨染色劑；超薄切片制樣試劑按照參考文獻中的方法配制；反轉(zhuǎn)錄試劑盒為Quick RT Master Mix（康為，中國）。

1.1.3抗體

番茄斑萎病毒（tomato spotted wilt vtrus，TSWV）、馬鈴薯Y病毒（potato virus Y，PVY）、煙草花葉病毒（tobacco mosalc virus，TMV）、番茄花葉病毒（tomato mosaic virus．ToMV）、鳳果花葉病毒（pepino mosaic virus，PepMV）、番茄黃化曲葉病毒（tomato yellow leaf curl virus，TYLCV）、煙草環(huán)斑病毒（tobacco ringspot virus，TRSV）、黃瓜花葉病毒（cucumber mosaic virus，CMV）單克隆抗體由浙江大學(xué)吳建祥教授提供，羊抗鼠二抗購自Abcom（英國）。

1.2方法

1.2.1ELISA檢測

對采集的42份樣本進行病毒種類檢測，待檢測病毒有8種，包括TSWV、PVY、TMV、ToMV、PeP-MV、TYLCV、TRSV、CMV。將待測樣品、實驗室保存的上述8種病毒陽性對照樣品、健康無病毒的番茄陰性對照樣品及空白對照加入酶標板，100uL/孔，37℃，3h，PBST洗板。加入含5%脫脂奶粉的PBST封閉板，200uL/孔，37℃，30min，待其干燥后加入多抗，100uL/孔，37℃，3h，PBST洗板。加入酶標二抗（羊抗兔），100uL/孔，37℃，3h，PBST洗板。加入底物顯色劑，100uL/孔，室溫，顯色。

1.2.2負染色制樣透射電子顯微鏡觀察

將采集樣品按照參考文獻中的方法進行負染色制樣，制備樣品置于FEI（TaicnaiG2 Spirit）透射電子顯微鏡觀察、拍照。根據(jù)負染色電子顯微鏡觀察結(jié)果，初步推測引起主要病害的病毒種類。

1.2.3超薄切片制樣透射電子顯微鏡觀察

按照參考文獻中的方法進行超薄切片制樣，制備樣品置于FEI（TaicnaiG2 Spirit）透射電子顯微鏡觀察、拍照。

1.2.4TSWV N基因擴增克隆和序列分析

根據(jù)負染色及超薄切片觀察結(jié)果，推測采集樣品受到番茄斑萎病毒感染，根據(jù)已報道的TSWVN基因序列設(shè)計特異引物TSWV N-F： 5'-AT-GTCTAAGGTTAAGCTCACTAAGG-3 7，

TSWVN-R： 5r_TTAAGCAAGTTCTGCAAGTTTTGTC_3；，擴增目的片段大小為777bp。采用TRIzoI（Thermo Fisher Scientific，美國）提取各樣品總RNA，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒Quick RT Master Mix（康為，中國）制備cDNA。PCR反應(yīng)體系（25uL）：TaqDNA mix 12.5uL，TSWV N-R（10umol/L）1uL，TSWVN-F（10umol/L）1uL，cDNA模板5uL，ddH20 5.5uL。PCR擴增程序為：94℃4min；94℃30s，55℃30 s，72℃30s，30個循環(huán)；72℃10min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后進行純化回收，并連接到pMD18-T克隆載體（TaKaRa）上，之后熱激轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a（TaKaRa）中。在含有氨芐青霉素的麥康凱培養(yǎng)基上進行篩選后，送至北京擎科生物科技有限公司昆明分公司測序。測序得到的序列在NCBI網(wǎng)站上進行在線比對，并將得到的序列與國內(nèi)外報道的TSWVN基因序列進行多序列比對及系統(tǒng)進化樹分析。使用軟件MEGA 6．0的鄰接法（neighbor-join-ing，N）構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，Bootstrap重復(fù)1000次。

2結(jié)果與分析

2.1西藏昌都市卡若區(qū)的蔬菜主要病毒病

溫室和大棚蔬菜中，番茄、辣椒和生菜病毒病發(fā)生較為嚴重。番茄植株表現(xiàn)為葉部褪綠、萎蔫，果實白化、黃化、僵硬、環(huán)斑（圖1a，b）。辣椒葉部出現(xiàn)褪綠斑或環(huán)斑，頂葉萎蔫，果實表現(xiàn)為黃化斑或褪綠斑（圖1c，d）。生菜葉部有褐色壞死斑點或壞死斑，植株矮化（圖1e）。上述癥狀特點與正番茄斑萎病毒屬Orthotospooirus病毒引起的斑萎病相似，到后期番茄和辣椒發(fā)病率超過70%以上，生菜發(fā)病率達到50%，嚴重影響蔬菜產(chǎn)量和質(zhì)量。溫室和大棚栽培的其他蔬菜如瓜果類南瓜和黃瓜等未發(fā)現(xiàn)明顯的病毒病癥狀。

露地栽培的蔬菜中，萵苣病毒病發(fā)生嚴重，根據(jù)不同發(fā)病時期葉部表現(xiàn)為褪綠（早期）、黃化（中期）和壞死斑（后期），植株嚴重矮化（圖1f），與已報道的番茄斑萎病毒侵染引起的萵苣斑萎病相似。其次為辣椒斑萎病，葉部和果實癥狀與溫室和大棚栽培的相似，發(fā)病率約30%以上。露地栽培的其他蔬菜如白菜等未見明顯的病毒病。

2.2西藏昌都市卡若區(qū)主要蔬菜病毒種類的ELISA檢測

對采集的42份樣本進行8種病毒種類檢測，檢測結(jié)果如表1所示，在42份樣本中，共檢出TSWV、PVY以及PepMV 3種病毒。TSWV檢出率為40.48%，PVY檢出率為28.57%，PepMV檢出率為21.43%。辣椒中的檢出病毒以單一侵染為主，番茄中的檢出病毒以混合侵染為主。PVY及PePMV在番茄中具有較高的檢出率，分別為45.00%和35.00%，高于在辣椒中的檢出率（PVY14. 29%，PePMV 9.52%）。混合侵染的組合類型包括TSWV+PVY+PepMV、TSWV+PVY、TSWV+PepMV、PVY+PepMV。

2.3侵染西藏昌都市卡若區(qū)番茄、辣椒和萵苣樣品的番茄斑萎病毒屬病毒形態(tài)特征

對表現(xiàn)番茄斑萎病毒病癥狀的番茄、辣椒及萵苣樣品20YV257、20YV181、20YV176進行負染色和超薄切片制樣，透射電子顯微鏡觀察。負染色樣品中均觀察到直徑約80～120nm的球形病毒粒體，與orthotospoviruses的粒體形態(tài)相似。超薄切片制樣中，番茄果實細胞的細胞質(zhì)中分布較多直徑約85nm的球形病毒粒體，聚集于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)池中，部分病毒粒體聚集于液泡內(nèi)的囊泡中，細胞內(nèi)線粒體等亞細胞結(jié)構(gòu)不完整（圖2a）；辣椒果實細胞的細胞質(zhì)內(nèi)分布較多直徑約85nm的球形病毒粒體，聚集于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)池內(nèi)，與較多線粒體相連，病毒粒體多分布于靠近細胞壁的細胞質(zhì)中，葉綠體結(jié)構(gòu)不完整（圖2b）。萵苣葉部細胞中，分布有直徑約85nm的球形病毒粒體，早期受侵染的細胞質(zhì)內(nèi)分布少量單個病毒粒體，葉綠體中嗜鋨顆粒增加，后期受侵染的細胞中，細胞質(zhì)內(nèi)多個病毒粒體聚集于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)池，葉綠體和線粒體等亞細胞結(jié)構(gòu)消失（圖2c）。根據(jù)病毒粒體形態(tài)和細胞內(nèi)病毒粒體聚集特征分析，番茄、辣椒和萵苣樣品受orthotospoviruses感染，與代表種TSWV在寄主植物細胞內(nèi)的分布特征類似。

2.4侵染西藏昌都市卡若區(qū)番茄、辣椒和萵苣的TSWV N基因擴增

用TSWV N基因引物對番茄（20YV257、20YV258）、辣椒（20YV181、20YV268、20YV270）和萵苣樣品（20YV176）進行RT-PCR擴增，同時設(shè)陽性、陰性及空白對照。1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，從番茄、辣椒和萵苣樣品中擴增出目的條帶，大小約770bp（圖3）。經(jīng)測序后得到的序列在NCBI中進行提交，得到的NCBI序列號分別：OP893535（20YVr76）;

OP893534（20YV181）、OP893536（20YV257）、OP893537（20YV258）、OP893538（20YV268）、OP893539（20YV270）。上述6條序列在NCBI進行BLAST比對，均與NCBI上注冊的TSWV一致性最高，達99%以上。

2.5侵染西藏昌都市卡若區(qū)番茄、辣椒和萵苣的TSWV N基因序列分析

將本研究得到的6條TSWVN基因序列與NCBI上國內(nèi)外其他地區(qū)TSWV-N基因序列進行比對，并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。結(jié)果如圖4所示，從西藏昌都番茄、辣椒和萵苣分離得到的6條TSWV-N基因序列與云南TSWV煙草分離物（MF193425）、云南TSWV鬼針草分離物（MF805764）、云南TSWV豌豆分離物（KY495609）、云南TSWV煙草分離物（MF193426）及云南番茄分離物（JF960235）聚在同一分支，表明TSWV西藏昌都分離物與云南TSWV分離物親緣關(guān)系最近。

3結(jié)論與討論

TSWV是目前已報道的病毒中發(fā)生分布范圍最廣和寄主植物最多的植物病毒，在全球熱帶、亞熱帶和溫帶均有發(fā)生，侵染的植物多達84科1090多種。由于溫室、大棚等設(shè)施蔬菜的普及，近10年來TSWV進一步快速蔓延。自2010年應(yīng)用N基因克隆、測序，氨基酸序列推導(dǎo)和病毒粒體在細胞內(nèi)的分布特征發(fā)現(xiàn)TSWV在我國云南番茄和煙草上發(fā)生以來，至2020年，已在我國18個省（區(qū)、市）發(fā)現(xiàn)TSWV侵染番茄和辣椒等作物，TSWV是近年來引起云南番茄、辣椒和萵苣類蔬菜（萵苣、生菜和油麥菜）病毒病的優(yōu)勢種。TSWV侵染后引起褪綠、花葉、黃化和壞死等癥狀，導(dǎo)致嚴重的產(chǎn)品質(zhì)量下降和產(chǎn)量損失。在自然條件下，TSWV主要通過西花薊馬Frankliniella occidentalis傳播，2022年又報道可通過辣椒種子傳播。西藏自治區(qū)昌都市卡若區(qū)的蔬菜生產(chǎn)區(qū)域（包括溫室、大棚和露地）平均海拔3000m以上，在2020年之前未發(fā)現(xiàn)明顯的病毒病，隨著智能化溫室的推廣普及，為病毒病發(fā)生提供了適宜的條件，而種子攜帶病毒促進了病毒的遠距離傳播。本研究發(fā)現(xiàn)卡若區(qū)溫室內(nèi)番茄、辣椒和生菜上由TSWV引起的斑萎病發(fā)病率較其他病毒高，而且在露地栽培的萵苣和辣椒上發(fā)病率也很高，說明TSWV已適應(yīng)高原缺氧和紫外線強的環(huán)境。在發(fā)病區(qū)域，未發(fā)現(xiàn)傳毒介體西花薊馬，也未發(fā)現(xiàn)其他雜草或作物有TSWV引起的癥狀，推測由種子攜帶病毒傳播的可能性較大。應(yīng)加強對蔬菜種子攜帶TSWV的檢測，在育苗期應(yīng)及時抽樣檢測，從源頭和早期開展蔬菜病毒病的預(yù)防，減少斑萎病引起的蔬菜產(chǎn)量損失和質(zhì)量下降。

本研究明確了西藏自治區(qū)昌都市卡若區(qū)溫室和大棚栽培番茄、辣椒和生菜及露地栽培辣椒和萵苣上發(fā)生的主要病毒為TSVVV、PVY及PepMV，且以TSWV的檢出率最高。進一步對檢出TSWV的樣品進行電子顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)為典型的正番茄斑萎病毒屬Orthotospooirus病毒粒體；通過RT-PCR擴增克隆和序列分析，明確西藏昌都市卡若區(qū)蔬菜感染的TSWV與TSWV云南分離物親緣關(guān)系最近。本研究首次報道了西藏自治區(qū)TSWV的發(fā)生，為該區(qū)域蔬菜斑萎病及TSWV侵染引起的其他作物病害的監(jiān)測預(yù)警與綠色防控提供了依據(jù)。