安徽省首次發現腎形腎狀線蟲危害瓜蔞

方圓 朱衎衙 吳慧平 彭德良 王行軍 嚴麗 潘月敏 鞠玉亮

關鍵詞：瓜蔞；腎形腎狀線蟲；形態學特征；系統發育；生活史瓜蔞Trichosanthes kirilowzii Maxim.屬葫蘆科栝樓屬多年生草質藤本植物，其果實、種皮、種子、根均可入藥，兼具藥用、食用、保健功能，經濟價值較高。目前，瓜蔞是當前農業結構調整中重要的特色經濟作物之一，在安徽、山東、江蘇等地有大規模種植。植物線蟲病害是嚴重制約瓜蔞生產的主要土傳病害，且隨著瓜蔞種植年限的增加危害愈發嚴重。腎形腎狀線蟲Rotylenchulus re-niforrnisLinford&Oliveira，1940是作物根部半內寄生植物線蟲，通常在熱帶和亞熱帶地區發生危害，與根結線蟲等并稱為危害最嚴重的世界十大植物線蟲。腎形腎狀線蟲寄主范圍廣泛，可危害豆科、葫蘆科、茄科、十字花科、旋花科、菊科、禾本科、天南星科、大戟科、錦葵科、棕櫚科、莧科、番荔枝科、罌粟科等科的300多種植物。腎形腎狀線蟲生活史較特別，在卵內發育成2齡幼蟲后進入土壤，在不取食的狀態下經3次蛻皮發育為未成熟雌蟲（蠕蟲形雌蟲）和雄蟲，蠕蟲形雌蟲蟲體前部1/3處侵入植株根內取食并建立類似孢囊線蟲的取食位點，根外部蟲體逐漸膨大，經7～9d最終發育為成熟的腎形雌蟲。腎形腎狀線蟲侵染根系，導致根系壞死、萎縮、須根減少，植株地上部分表現矮小、黃化等癥狀，可導致作物減產40%_60%。

目前，腎形腎狀線蟲已在我國廣東、上海、湖北、海南、四川、廣西、福建、山東和浙江等地的蔬菜或園林植物上發生危害。吳慧平等1994年-1996年開展了安徽省盆景花卉根際植物線蟲類群調查工作，在銅陵市南天竹Nandina dornestzca根際土壤中分離到腎形線蟲屬線蟲，但未鑒定到具體種，隨后在安徽省農作物上一直未發現腎形腎狀線蟲發生危害。筆者于2020年和2021年對安徽省部分瓜蔞產區植物線蟲病害進行調查，發現除南方根結線蟲Meloidogyne zncognita外，部分瓜蔞產區有腎形線蟲病發生，且危害嚴重。基于此，本研究在前期調查的基礎上，利用形態學和分子生物學手段對安徽省瓜蔞腎形線蟲病的病原進行種類鑒定，并對其遺傳進化進行分析，利用室內接種的方法對其生活史進行初步研究。

1材料與方法

1.1田間調查與樣品采集

分別于2020年和2021年對安徽省部分瓜蔞產區腎形線蟲病害進行調查。采用田間五點取樣法，并有針對性地選擇長勢較弱的瓜蔞，剪去瓜蔞植株地上部分，挖取瓜蔞根系，同時取根際15cm深的土壤1kg，將瓜蔞根系和根際土壤帶回實驗室進行線蟲的分離鑒定。

1.2線蟲分離及形態學鑒定

將瓜蔞根際土壤充分混勻，取100mL土壤，利用貝曼漏斗法分離線蟲各齡期幼蟲、蠕蟲形雌蟲及雄蟲，并統計蟲口密度。線蟲的形態學鑒定主要基于蠕蟲形雌蟲及雄蟲的形態，臨時玻片制作及形態測計參考張燕等的方法并稍作改動。

1.3分子生物學鑒定

單條雌蟲DNA提取參考鄧艷鳳等的方法并稍作改動：在體視顯微鏡下從瓜蔞根部挑取單條雌蟲，置于載玻片上用ddH20清洗2次，置于含16uLddH20的PCR管中；液氮處理5min后65℃水浴5min，該步驟重復3次；加入4uL 5×Lysis Buffer，65℃處理1h，95℃處理10min，-20℃保存備用。

利用已報道的rDNA-D2D3區特異性引物Rr-F3/Rr-B3對本研究所采集的7份樣品進行分子生物學鑒定，陽性對照為南京農業大學植物線蟲實驗室惠贈的腎形腎狀線蟲，陰性對照分別為南方根結線蟲Meloidogyne zncognita、北方根結線蟲M．hapla、爪哇根結線蟲M．jauoanzca和擬禾本科根結線蟲M．grauminicola，以ddH20為空白對照。PCR反應體系：DNA模板2uL，10umol/L引物Rr-F3/Rr-B3各0.5uL，2×Taq PCR MasterMix12.5uL，超純水補足至25uL。PCR反應程序：94℃預變性3min；94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，35個循環；72℃延伸10min。擴增產物在2%瓊脂糖凝膠上電泳檢測。

1.4系統發育分析

分別選擇腎形腎狀線蟲ITS、18S、28S、mtDNA-CO工基因引物18S/26S、18S-A/18S-S3、D2A/D3B、JB3/JB5進行PCR擴增。PCR產物電泳檢測后，將條帶亮且與目標基因大小一致的產物送至南京擎科生物科技有限公司測序。測序結果在NCBI數據庫中進行BLAST比對，并從NCBI數據庫中下載相關線蟲序列。利用MEGA11的鄰接法（neighbor-joining method）構建系統進化發育樹，Boostrap值設置為1000，分析分支聚類的可靠性。

1.5室內接種試驗

在體視顯微鏡下從瓜蔞根部挑取腎形腎狀線蟲卵塊，于26℃培養箱中孵化，3d后收集2齡幼蟲并配制2000條/mL的線蟲液，用于室內接種試驗。取瓜蔞種子機械破殼后于溫水中催芽，5d后播種于滅菌土壤（黏土和沙土按2：1混合）中，置于27℃溫室中培養。瓜蔞苗培養10 d后每盆接種2 000條/mL的線蟲液2.5mL，即5000條腎形腎狀線蟲2齡幼蟲，接種后繼續置于溫室中培養，定期澆水。接種線蟲30d后，統計根部卵塊數量、每個卵塊含卵量、根部腎形腎狀線蟲數量、土壤中腎形腎狀線蟲數量，計算繁殖系數（R）。R=Pf./Pi式中P.f為接種后30 d線蟲數量（含卵量），Pi為初始接種線蟲數量。另外，接種腎形腎狀線蟲后，每2d取1次樣，每次取5棵瓜蔞，用清水輕輕洗去根部泥沙，用次氯酸鈉一酸性品紅染色，觀察線蟲侵染及發育情況。

2結果與分析

2.1瓜蔞腎形腎狀線蟲病危害癥狀

通過對安徽省部分瓜蔞產區腎形線蟲病調查發現，該病害主要在巢湖市瓜蔞種植區發生。部分發生嚴重的田塊，每100mL土壤中腎狀屬線蟲數量高達1050條，導致瓜蔞大面積枯萎死亡，嚴重威脅瓜蔞產量和品質（圖1a）。感染線蟲的瓜蔞地上部生長緩慢、植株矮小，且在瓜蔞生長后期出現明顯的早衰現象，高溫、干旱條件下瓜蔞易枯死。被線蟲侵染的根系，老根畸形、腫大，嚴重時出現壞死癥狀（圖1b）；新生根須根減少，根部有明顯的成熟雌蟲和膠質卵塊，根系局部出現壞死癥狀（圖1c～e）。

2.2形態學鑒定

未成熟雌蟲：蠕蟲形，加熱殺死后蟲體呈“C”形，唇區隆起、圓錐形、無縊縮；頭架、口針強壯，口針基部球圓形；食道腺長，覆蓋腸端，口針基部球距食道腺開口距離與口針長度基本相等；中食道球卵圓形，瓣門清楚，排泄孔位于食道峽基部；雙生殖管對生，卵巢不成熟；尾長圓錐形，具透明尾端（圖2）。

成熟雌蟲：蟲體腹彎，膨大呈腎形；頸區彎曲不規則；陰門突起，受精囊圓形至不規則形，通常有精子；肛門后蟲體呈半球形，具細長尾尖突；產卵于膠質卵囊內（圖2）。

雄蟲：食道退化，中食道球不發達；口針纖弱；交合刺纖長，向腹面彎曲呈弓狀，交合傘不明顯（圖2）。

基于形態學鑒定，本研究所獲得的腎狀屬線蟲主要形態測量值（表2）與海南省已報道的腎形腎狀線蟲群體RRLC1基本吻合，確定引起瓜蔞腎形線蟲病的病原為腎形腎狀線蟲Rotylenchulus

reni-rorrnis Linford&Oliveira，1940.

2.3特異性引物驗證

以單條雌蟲DNA為模板進行PCR擴增，結果顯示，采自安徽省巢湖市中廟鎮和柘皋鎮瓜蔞田的7份樣品均擴增出190bp大小的條帶，與陽性對照一致，而對照組無擴增條帶，進一步確定其為腎形腎狀線蟲（圖3）。

2.4系統發育分析

將本研究所測腎形腎狀線蟲（ah-Rr）的ITS、28S、COI基因序列分別在NCBI與已有的腎形腎狀線蟲數據進行BLAST比對，ITS序列種內一致性為88.05%～99.66%，28S種內一致性為94.95%～100%，COI種內一致性為99.18%～100%，可見腎形腎狀線蟲ITS區遺傳變異較大，與已報道結果一致。基于ITS、28S、COI的系統發育分析（圖4～6），本研究腎形腎狀線蟲ITS和28S均與A型（type A）群體遺傳距離較近，而與B型（type B）群體遺傳距離較遠，表明本研究腎形腎狀線蟲屬于A型。此外，本研究腎形腎狀線蟲ITS與孤雌生殖群體（AY335190）遺傳距離較遠，而與兩性生殖群體（AY335191、FJ374686）遺傳距離較近。

2.5腎形腎狀線蟲生活史

腎形腎狀線蟲接種瓜蔞后，每2d取瓜蔞根系用次氯酸鈉一酸性品紅染色，觀察線蟲發育情況。結果發現，接種2齡幼蟲6d后可在瓜蔞根部發現未成熟雌蟲侵染根系（圖7a），接種8d后未成熟雌蟲在根外的蟲體部分逐漸膨大（圖7b～e），接種16d后在根部可見成熟雌蟲（圖7f～g），接種20d時成熟雌蟲周圍可見膠質卵塊（圖7h～i），每個卵塊平均含64個卵，接種24d后卵塊內可見2齡幼蟲游出。該結果表明，在27℃室內條件下，腎形腎狀線蟲寄生瓜蔞根部的生活史周期為24d。此外，將5000條腎形腎狀線蟲2齡幼蟲接種瓜蔞30d后，根據根部卵塊數量、每個卵塊含卵量、根部腎形腎狀線蟲數量、土壤中腎形腎狀線蟲數量，計算得到繁殖系數（R）為（11.12±0.62）（表3）。通過室內接種試驗，首次證實瓜蔞為腎形腎狀線蟲的新寄主。

3結論與討論

植物線蟲是引起我國農作物病害的重要病原物之一，對大田作物造成的經濟損失約為10%～20%，嚴重時可達30%～50%，部分地區可超80%。隨著全球氣候變化、種植制度改革、高值農業迅速發展等因素，植物線蟲病害發生趨勢愈發嚴重，將成為我國重要的植物病害。腎形腎狀線蟲作為一種危害嚴重的植物線蟲，近年來在蔬菜、果樹、園林植物上相繼被發現和報道。腎形腎狀線蟲形態學鑒定主要基于未成熟雌蟲、成熟雌蟲及雄蟲的形態特征。本研究中的腎形腎狀線蟲主要形態測量值與國內已報道的腎形腎狀線蟲群體基本吻合，個別特征略有差別。不同形態測量值的差異可能與腎形腎狀線蟲所處溫濕度、土壤環境、寄主種類等因素相關。腎形腎狀線蟲rDNA-ITS區在不同群體甚至同一群體內遺傳變異較大，Vovlas等和Palomares-Rius等利用ITS、28S對腎形腎狀線蟲進行系統發育分析，對A型（type A）和B型（tybe B）進行有效區分，并將腎形腎狀線蟲與腎狀屬其他線蟲進行有效區分。基于ITS、28S、COI基因進行的遺傳進化分析表明，本研究所采集腎形腎狀線蟲屬于A型，且與兩性生殖腎形腎狀線蟲（AY335191，FJ374686）遺傳距離較近，無A型和B型同時發生的現象。

腎狀屬線蟲生活史較特別，2齡幼蟲在土壤中不取食的狀態下經過3次蛻皮發育成未成熟雌蟲，未成熟雌蟲為取食蟲態。幼蟲蛻皮過程通常會保留前一齡期的角質層，且每次蛻皮后蟲體較前一齡期短小。筆者對分離自土壤的腎形腎狀線蟲鏡檢時，發現土壤中存在各齡期幼蟲，且大量線蟲處于蛻皮階段，前一齡期的角質層覆蓋蟲體的現象較普遍。對腎形腎狀線蟲在瓜蔞根上的生活史研究發現，瓜蔞根系上卵塊較密集，但每個卵塊含卵量較少，約為64粒，單個雌蟲產卵量明顯少于根結線蟲的產卵量。前人研究表明，腎形腎狀線蟲在缺乏寄主或干燥條件下，線蟲可在土壤中保持某一蠕蟲階段而不生長，其生活史可在兩年內完成。田間調查時也發現，在部分黏質土且略板結的土質較差的田塊，土壤中腎形腎狀線蟲數量超過1000條/100mL土壤，表明腎形腎狀線蟲對逆境的適應能力相對較強。此外，5000條2齡幼蟲接種瓜蔞30d后，繁殖系數為11. 12，高于腎形腎狀線蟲在大豆根部的繁殖能力，本文推測瓜蔞是腎形腎狀線蟲的合適寄主。

綜上所述，本文首次報道腎形腎狀線蟲在安徽省發生危害，對其形態特征、遺傳進化、生活史等進行初步描述和研究，且首次報道瓜蔞為腎形腎狀線蟲的新寄主。本研究為進一步掌握腎形腎狀線蟲的分布區域及潛在寄主，為采取有效的防治措施提供理論依據。