番茄褐色皺果病毒TaqMan熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用

李獻(xiàn)鋒 于璇 馮黎霞 于翠 丁鈿 徐強(qiáng) 趙菊鵬 馬駿 武目濤 魏霜

關(guān)鍵詞：番茄褐色皺果病毒；RNA依賴的RNA聚合酶；TaqMan探針；熒光定量RT-PCR;檢測(cè)

番茄褐色皺果病毒（tomato brown rugose fruitvlrus，ToBRFV）是近年新發(fā)的一種正單鏈RNA（+ssRNA）病毒，屬于帚狀病毒科Virga'-oiridae，煙草花葉病毒屬Tobarnoroz rus，基因組全長(zhǎng)6.2～6.4kb，含有4個(gè)開(kāi)放閱讀框（open reading frame，ORF），其中ORFI和ORF2分別編碼病毒復(fù)制相關(guān)的酶和RNA依賴的RNA聚合酶（RNA-depend-ent RNA polymerase，RdRP），ORF3編碼運(yùn)動(dòng)蛋白（movement protein，MP），ORF4編碼外殼蛋白（coat protein，CP）。ToBRFV的寄主主要為番茄和辣椒。植株感病后嫩葉和頂芽表現(xiàn)為斑駁、斑點(diǎn)和黃化等花葉癥狀，葉片變窄、畸形；花和果實(shí)大量減少，葉柄、花梗和花萼逐漸壞死；果實(shí)變形，出現(xiàn)黃、棕或綠色斑點(diǎn)、斑塊或條紋，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致畸形、變褐、壞死，嚴(yán)重影響食用價(jià)值和產(chǎn)量。ToBRFV最早于2015年由約旦科學(xué)家首次鑒定和報(bào)道，此后，該病毒在世界范圍內(nèi)迅速蔓延，陸續(xù)在30余個(gè)國(guó)家或地區(qū)被檢出，橫跨歐洲、美洲、非洲和亞洲，呈現(xiàn)出種子帶毒傳播，傳播速度快和檢出率高的特點(diǎn)。2019年我國(guó)山東溫室栽培的番茄首次檢出ToBRFV，此后在云南和北京等地區(qū)也發(fā)現(xiàn)該病毒為害番茄。鑒于ToBRFV潛在的危害及影響，我國(guó)于2021年4月9日將To-BRFV增補(bǔ)列入《中華人民共和國(guó)進(jìn)境植物檢疫性有害生物名錄》。此外，2020年1月至2022年4月，歐盟及瑞士從中國(guó)出口的番茄種子和辣椒種子中共檢出ToBRFV多達(dá)62批次，涉疫種子均被退貨或銷毀，對(duì)我國(guó)蔬菜種子的出口貿(mào)易造成了極大影響。

目前，ToBRFV的檢測(cè)方法有高通量測(cè)序（next-generation sequencing，NGS）、酶聯(lián)免疫（enzyme-linked immunosorbent assay， ELISA）、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）、RT_PCR和熒光定量RT-PCR方法。NGS受限于檢測(cè)時(shí)效和檢測(cè)成本，無(wú)法適用于田間和口岸快速檢測(cè)和鑒定；ELISA檢測(cè)靈敏度較低且特異性較差；LAMP檢測(cè)成本較高、容易產(chǎn)生假陽(yáng)性；而RT-PCR方法雖使用最為普遍，但其無(wú)法滿足當(dāng)前快速、精準(zhǔn)檢測(cè)鑒定的需求，尤其是對(duì)于病毒載量較低的種子類樣品。熒光定量RT-PCR技術(shù)具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、用時(shí)短和操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，已成為當(dāng)前植物病害檢測(cè)的重要手段之一。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于ToBRFV的熒光定量RT-PCR的檢測(cè)方法已有一些研究報(bào)道，筆者前期建立了SYBR Green工熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法，對(duì)番茄種子總RNA和重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的檢測(cè)限分別低至0.2ng/uL和50.0拷貝／uL，均為常規(guī)RT-PCR檢測(cè)靈敏度的100倍；田沂民等、Klap等和Sarkes等也分別建立了ToBRFV的SYBR Green熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法。相較于SYBR Green熒光定量RT-PCR技術(shù)，TaqMan熒光定量RT-PCR技術(shù)具有更高的靈敏度、準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。目前TaqMan熒光定量RT-PCR技術(shù)在ToBRFV檢測(cè)方面也有一些研究成果，F(xiàn)idan等和Panno等分別建立了ToBRFV的TaqMan熒光定量RT-PCR方法，EPPOPM 7/146（1）推薦了3組特異性引物和探針CaTa28、CSP1325和ToBRFVqs用于檢測(cè)ToBRFV，但尚無(wú)應(yīng)用于實(shí)際樣本檢測(cè)的研究報(bào)道。已建立的ToBRFV TaqMan熒光定量RT-PCR方法主要以CP和MP基因?yàn)榘袠?biāo)序列，而針對(duì)RdRP基因的檢測(cè)方法相對(duì)較少。同時(shí)，國(guó)內(nèi)還沒(méi)有關(guān)于ToBRFV的TaqMan熒光定量RT-PCR方法的研究報(bào)道，亟須建立該病毒的快速、穩(wěn)定和高效的檢測(cè)方法。本研究根據(jù)ToBRFVRdRP基因序列設(shè)計(jì)特異性引物和探針，建立TaqMan熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法，并對(duì)其檢測(cè)靈敏度、特異性和實(shí)際樣品的檢測(cè)進(jìn)行了驗(yàn)證，以期豐富ToBRFV的檢測(cè)手段，為T(mén)oBRFV的檢疫和防控提供技術(shù)支撐。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

供試ToBRFV陽(yáng)性番茄和辣椒葉片樣品分別購(gòu)自美國(guó)Agdia公司和德國(guó)DSMZ公司；ToBRFV陽(yáng)性番茄和辣椒種子樣品于2019年在廣州口岸截獲，來(lái)源國(guó)為以色列；10份番茄新鮮葉片和10份辣椒新鮮葉片為2021年在廣東省廣州市番茄和辣椒主要種植區(qū)隨機(jī)采樣；20份番茄種子和20份辣椒種子樣品為2019年至2022年期間收集，分別來(lái)源于以色列、約旦、秘魯、法國(guó)和中國(guó)等國(guó)家。所有植物材料收集后于-80℃保存、備用。

其他供試病毒包括番茄花葉病毒（tomato mo-salc virus，ToMV）、番茄斑駁花葉病毒（tomatomottle mosaic virus，ToMMV）、煙草花葉病毒（to-bacco mosaic virus，TMV）、黃瓜綠斑駁花葉病毒（cucumber green mottle mosaic virus， CGMMV）、番茄環(huán)斑病毒（tomato ringspot virus，ToRSV）、番茄黑環(huán)病毒（tomato black ring virus，TBRV）、辣椒輕斑駁病毒（pepper mild mottle virus，PMMoV）、煙草環(huán)斑病毒（tobacco rtngspot virus，TRSV）和風(fēng)果花葉病毒（pepino mosaic vlrus，PepMV），這9種病毒RNA樣品，健康的番茄和辣椒種子樣品均為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1引物和探針的設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank已公布的ToBRFV（OM718706.1、MN013187.1、MT018320.1、MK648157.1、MW349655.1和KX619418.1）、ToMV（NC_002692.1）、PMMoV（NC_003630.1）和TMV （NC_001367.1）的RdRP基因序列，設(shè)計(jì)了4組特異性引物和探針（S1、S2、S3和S4），引物和探針由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物和探針序列見(jiàn)表1。

1.2.2總RNA提取

種子樣品：取250粒番茄或辣椒種子研磨成粉末狀，加入5mL PBS緩沖液（0.01%，pH 7.4），充分混勻后置于4℃靜置24h，10000g、4℃離心3min，吸取200uL上清液用于總RNA提取。葉片樣品：取30mg的番茄或辣椒葉片在研缽中研磨，加入1mL PBS緩沖液（0.01%，pH7.4），混勻，10000g、4℃離心5min后，吸取200uL上清液用于總RNA提取。提取步驟參照植物總RNA提取試劑盒（TaKaRa公司）說(shuō)明書(shū)，最后用50uLRNase Free ddH20洗脫，使用NanoDrop-1000核酸濃度測(cè)定儀（Thermo Fisher Scientific公司）測(cè)定總RNA濃度和純度，分裝后置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3RT-PCR檢測(cè)

一步法RT-PCR反應(yīng)在PTC-200 PCR儀（Bio-Rad公司）上進(jìn)行，反應(yīng)體系為：2×One StepBuffer 12.5uL，10umol/L的正向引物ToBRFV-5506-F和反向引物ToBRFV-6186-R各0.8uL，PrimeScript One Step Enzyme Mix （TaKaRa公司）0.8uL，RNA模板2.0uL，RNase Free ddH20補(bǔ)足至25uL。反應(yīng)程序?yàn)椋?0℃逆轉(zhuǎn)錄30min; 94℃預(yù)變性3min；94℃變性30s，57℃退火30s，72℃延伸60s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad公司）分析結(jié)果。

1.2.4TaqMan熒光定量RT-PCR反應(yīng)引物和探針的篩選

一步法TaqMan熒光定量RT-PCR在ThermoQuantStudio 6.0熒光定量PCR儀（Thermo FisherScientific公司）中進(jìn)行。分別采用本研究設(shè)計(jì)的4組特異性引物和探針，以提取的ToBRFV陽(yáng)性番茄種子總RNA為模板，RNase Free ddH20作為空白對(duì)照進(jìn)行TaqMan熒光定量RT-PCR，篩選出最優(yōu)的引物和探針組合。每次反應(yīng)設(shè)置2個(gè)重復(fù)孔，反應(yīng)體系為：One Step PrimeScriptⅢRT-qPCR Mix（TaKaRa公司）12.5uL，10umol/L的正、反向引物各0.6uL，10umol/L的探針0.4uL，RNA模板2.0uL，RNase Free ddH20補(bǔ)足至25uL。反應(yīng)程序?yàn)椋?2℃逆轉(zhuǎn)錄5min；95℃預(yù)變性10s；95℃變性5s，60℃退火60s（收集熒光信號(hào)），40個(gè)循環(huán)。

1.2.5特異性分析

分別以感染ToBRFV的番茄和辣椒種子樣品總RNA為陽(yáng)性對(duì)照，以感染ToMV、ToMMV、TMV、CGMMV、ToRSV、TBRV、PMMoV、TRSV和PepMV等9種病毒的植物總RNA為試驗(yàn)材料，以健康的番茄和辣椒種子作為陰性對(duì)照，同時(shí)以RNase Free ddH90作為空白對(duì)照，采用篩選出的引物和探針進(jìn)行TaqMan熒光定量RT-PCR檢測(cè)分析，評(píng)估其特異性。

1.2.6靈敏度分析

分別以感染ToBRFV的番茄種子樣品總RNA為試驗(yàn)材料（濃度約為10fg/uL），用EASY Dilu-tion buffer（TaKaRa公司）進(jìn)行10倍梯度稀釋，得到濃度依次為107、106、105、104、103、102、101fg/uL和10fg/uL的樣品，以不同濃度的RNA樣品為模板，用篩選的最優(yōu)引物和探針進(jìn)行TaqMan熒光定量RT-PCR反應(yīng)，同時(shí)用EPPO PM7/146（1）推薦的2組特異性引物和探針CaTa28和CSP1325作為對(duì)照，比較針對(duì)不同靶標(biāo)基因序列的3組引物和探針的檢測(cè)靈敏度。選擇熒光值穩(wěn)定且線性比例良好的濃度范圍，以模板濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)、Ct值為縱坐標(biāo)，構(gòu)建熒光定量RT-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)、斜率和擴(kuò)增效率等，比較和驗(yàn)證方法的有效性。

此外，以上述稀釋的總RNA為模板，采用筆者前期設(shè)計(jì)的特異性引物ToBRFV-5506-F和To-BRFV-6186-R進(jìn)行常規(guī)RT-PCR反應(yīng)，比較常規(guī)RT-PCR方法和TaqMan熒光定量RT-PCR方法的檢測(cè)靈敏度。

1.2.7樣品檢測(cè)

以廣東省廣州市田間采集的番茄葉片樣品10份、辣椒葉片樣品10份和廣州口岸收集的進(jìn)出境番茄種子樣品20份、辣椒種子樣品20份，共60份樣品作為試驗(yàn)材料（表2），分別以感染ToBRFV的番茄和辣椒葉片、種子樣品作為陽(yáng)性對(duì)照，健康番茄和辣椒葉片、種子樣品作為陰性對(duì)照，同時(shí)以RNaseFree ddH2O作為空白對(duì)照，運(yùn)用本研究建立的TaqMan熒光定量RT-PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)擴(kuò)增曲線、Ct值確定其病毒攜帶情況。同時(shí)，將檢為陽(yáng)性的熒光定量RT-PCR反應(yīng)液委托廣州天一輝遠(yuǎn)公司測(cè)序分析，將獲得的序列在NCBI上進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，進(jìn)一步復(fù)核陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果。

2結(jié)果與分析

2.1引物和探針篩選結(jié)果

采用TaqMan熒光定量RT-PCR評(píng)估本研究設(shè)計(jì)的4組引物和探針對(duì)ToBRFV的檢測(cè)效率。S1組、S2組引物和探針產(chǎn)生的熒光信號(hào)最快，且約在22個(gè)循環(huán)達(dá)到了平臺(tái)期，但是陰性對(duì)照樣品在32個(gè)循環(huán)后均出現(xiàn)熒光信號(hào)，表明S1組、S2組引物和探針有非特異性擴(kuò)增，特異性不強(qiáng)；S3組、S4組引物和探針在14個(gè)循環(huán)后出現(xiàn)熒光信號(hào)，約在24個(gè)循環(huán)后達(dá)到平臺(tái)期，無(wú)非特異性擴(kuò)增信號(hào)，但是S3組在平臺(tái)期的熒光信號(hào)遠(yuǎn)低于S4組，表明S4組引物和探針的擴(kuò)增效率要高于S3組（圖1）。因此，選擇S4組引物和探針進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2特異性檢測(cè)結(jié)果

采用TaqMan熒光定量RT-PCR對(duì)S4組引物ToBRFV-709-F/ToBRFV-828-R和探針ToBRFV-753-P進(jìn)行特異性評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示，感染ToBRFV的番茄、辣椒陽(yáng)性種子樣品均有特異性擴(kuò)增，而ToMV、ToMMV、TMV、CGMMV、ToRSV、TBRV、PMMoV、TRSV和PepMV等9種番茄和辣椒的主要病毒、健康的番茄和辣椒種子樣品和空白對(duì)照均無(wú)擴(kuò)增反應(yīng)，表明以S4組引物ToBRFV-709-F/To-BRFV-828-R和探針ToBRFV-753-P建立的Taq Man熒光定量RT-PCR方法對(duì)ToBRFV具有良好的特異性。

2.3靈敏度檢測(cè)結(jié)果

以10倍梯度稀釋的感染ToBRFV的番茄種子總RNA為模板，對(duì)S4組引物和探針進(jìn)行靈敏度測(cè)試，并分別與CaTa28、CSP1325進(jìn)行比較分析。結(jié)果顯示，3組引物和探針對(duì)濃度為10fg/uL時(shí)Ct值分別為38.22、36.40和36.99，RNA濃度為1fg/uL時(shí)均無(wú)熒光信號(hào)或Ct值為40.0（圖3a、3c和3e），表明3組引物和探針對(duì)ToBRFV的最低檢測(cè)濃度均為10fg/uL。3組引物和探針對(duì)不同濃度總RNA檢測(cè)的Ct值較為接近，S4組引物和探針檢測(cè)ToBRFV的Ct值略低于CaTa28和CSP1325。由建立的3種標(biāo)準(zhǔn)曲線可知（圖3b、3d和3f），隨著模板濃度降低，Ct值均出現(xiàn)遞增趨勢(shì)，且在模板總RNA濃度為10～10fg/uL范圍內(nèi)，Ct值與模板總RNA濃度的對(duì)數(shù)值之間均呈良好的線性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率分別為-3.273、-3.288和-3.409，擴(kuò)增效率為102.096%、101.423%和96.506%，R2分別為0.999、0.998和0.999，表明S4組引物和探針與Ca-Ta28、CSP1325對(duì)ToBRFV均具有較高的檢測(cè)效率。常規(guī)RT-PCR方法對(duì)總RNA濃度為10fg/uL的樣品擴(kuò)增時(shí)具有清晰的條帶（圖4），即最低檢測(cè)濃度為10fg/uL，表明TaqMan熒光定量RT-PCR方法檢測(cè)ToBRFV的靈敏度是常規(guī)RT-PCR方法的100倍。

2.4樣品檢測(cè)結(jié)果

運(yùn)用本研究建立的TaqMan熒光定量RT-PCR方法對(duì)收集的60份番茄和辣椒葉片、種子樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果（表2）表明，10份番茄葉片和10份辣椒葉片樣品檢測(cè)結(jié)果均為陰性；種子樣品中有10份檢測(cè)出攜帶ToBRFV，其中番茄種子樣品檢出5份，分別來(lái)自約旦、以色列、秘魯、法國(guó)和泰國(guó)；辣椒種子樣品檢出5份，分別來(lái)自約旦、以色列、泰國(guó)、日本和中國(guó)山東省。為進(jìn)一步驗(yàn)證檢測(cè)結(jié)果，將上述所有陽(yáng)性檢出樣品的熒光定量RT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，將獲得的序列在NCBI上進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，結(jié)果顯示，10份樣品測(cè)序序列與ToBRFV（登錄號(hào)：NC_028478.1）的對(duì)應(yīng)區(qū)域序列的相似性均為100%。

3結(jié)論與討論

目前檢測(cè)ToBRFV的TaqMan熒光定量RT-PCR方法，其檢測(cè)靶標(biāo)多集中于CP和MP基因。EPPO PM7/146（1）中推薦的3組引物及特異性探針中，CaTa28以MP基因序列作為檢測(cè)靶標(biāo)，CSP1325和ToBRFV均以CP基因序列作為檢測(cè)靶標(biāo)；Panno等建立的TaqMan熒光定量RT-PCR方法亦是以MP基因序列作為檢測(cè)靶標(biāo)。目前僅有Fidan等以RdRP基因序列為檢測(cè)靶標(biāo)構(gòu)建了ToBRFV的TaqMan熒光定量RT-PCR方法，但是該研究沒(méi)有進(jìn)行特異性和靈敏度分析，且其試驗(yàn)材料為植株葉片。因此，本研究以RdRP基因作為檢測(cè)靶標(biāo)，并以種子為試驗(yàn)材料，建立了To-BRFV的熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法。

ToBRFV可與ToMV、TMV、PepMV等同屬病毒同時(shí)侵染同一寄主并表現(xiàn)相似的癥狀，因此，建立ToBRFV熒光定量RT-PCR方法的關(guān)鍵步驟是進(jìn)行特異性驗(yàn)證。本研究中選取了口岸重點(diǎn)關(guān)注且檢出頻次較高的ToMV、ToMMV、TMV、CGMIVIV、ToRSV、TBRV、PMMoV、TRSV和PepMV等9種番茄和辣椒的主要病毒進(jìn)行特異性試驗(yàn)，且檢測(cè)結(jié)果均為陰性，表明本方法具有良好的特異性。

種子的植物病毒載量通常較低，因此，建立檢測(cè)方法的靈敏度尤為關(guān)鍵。Panno等建立的Taq Man熒光定量RT-PCR方法以體外轉(zhuǎn)錄合成RNA為模板，檢測(cè)靈敏度可達(dá)到10拷貝／反應(yīng)；Bernabe-Orts等建立的Taq Man熒光定量RT-PCR方法以番茄葉片總RNA為模板，檢測(cè)靈敏度可達(dá)到10-1 fg/uL。本方法對(duì)感染ToBRFV的番茄種子RNA的檢測(cè)靈敏度為10fg/uL，靈敏度是常規(guī)RT-PCR方法的100倍。通過(guò)構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線分析表明，分別以RdRP、CP和MP基因?yàn)榘袠?biāo)的3組引物和探針建立的熒光定量RT-PCR方法對(duì)ToBRFV的檢測(cè)靈敏度和擴(kuò)增效率均相當(dāng)，本方法可以與CaTa28、CSP1325互為補(bǔ)充用于ToBRFV檢測(cè)和復(fù)核。

此外，前人研究較多采用單一國(guó)家的ToBRFV分離物樣品進(jìn)行方法驗(yàn)證，本研究收集了9個(gè)國(guó)家的番茄和辣椒的樣品進(jìn)行驗(yàn)證，并分別從中國(guó)山東省、約旦、以色列、秘魯、泰國(guó)、日本和法國(guó)的種子樣品中檢測(cè)出ToBRFV，說(shuō)明本方法對(duì)來(lái)源于不同國(guó)家的ToBRFV均具有較好的特異性。當(dāng)然，這些來(lái)源于不同國(guó)家的陽(yáng)性樣品是否屬于不同的ToBRFV分離物，需要后續(xù)進(jìn)一步深入研究。此外，本研究從國(guó)內(nèi)收集的30份樣品中僅檢出1份辣椒種子ToBRFV陽(yáng)性，國(guó)內(nèi)檢出率并不高，這可能與本研究收集的樣品數(shù)量有限相關(guān)。從近2年來(lái)歐盟通報(bào)從中國(guó)出口的番茄和辣椒種子檢出ToBRFV的頻次可以推測(cè)，當(dāng)前ToBRFV在國(guó)內(nèi)的分布可能不止局限于已報(bào)道的山東、北京和云南等省份。因此，建議加強(qiáng)番茄和辣椒種苗跨境運(yùn)輸和國(guó)內(nèi)跨區(qū)域調(diào)運(yùn)的植物檢疫，對(duì)國(guó)內(nèi)的番茄和辣椒主要產(chǎn)區(qū)盡快開(kāi)展ToBRFV疫情普查，并對(duì)國(guó)內(nèi)已發(fā)生的區(qū)域及時(shí)采取控制、根除措施，避免該病毒進(jìn)一步擴(kuò)散傳播造成更大的損失。

綜上所述，本研究針對(duì)ToBRFV建立了基于RdRP基因的TaqMan熒光定量RT-PCR方法，該方法特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好、穩(wěn)定性強(qiáng)，能夠滿足快速、精準(zhǔn)、穩(wěn)定的鑒定需求，適用于番茄和辣椒種子、葉片攜帶ToBRFV的檢測(cè)，是現(xiàn)有針對(duì)MP和CP為檢測(cè)靶標(biāo)的檢測(cè)方法的有效補(bǔ)充手段，有助于ToBRFV進(jìn)行高效檢測(cè)和診斷，為T(mén)o-BRFV疫情的檢疫及防控提供有力支撐。