菠蘿泛菌與水稻白葉枯病菌雙重PCR檢測方法的建立與應用

徐會永 楊雪 臧號昱 潘銳 谷春艷

關鍵詞：菠蘿泛菌；白葉枯病菌；雙重PCR

由水稻黃單胞菌XanthorrLonas oryzae pv．or3lzae引起的水稻白葉枯病是水稻上常見的一種細菌性病害，與稻瘟病、水稻紋枯病并稱水稻三大病害，一般引起減產10%～20%，嚴重時導致減產50%以上。而近年來在世界多國的水稻上發現一種由菠蘿泛菌Pantoea ananatis引起的新型細菌病害，其癥狀與白葉枯病類似，病斑沿葉尖擴展，稻葉失水干枯，在我國多省也相繼報道了該病害，其侵染性強、致病率高、危害性大，造成水稻嚴重減產。

在實際生產中，這兩種細菌性病害發生時期相近、病癥相似，難以準確分辨且存在混發的情況，增加了防治難度。目前單一針對白葉枯病菌或菠蘿泛菌的PCR檢測方法已有報道，但這兩種病害的雙重PCR檢測方法尚未見報道。因此，建立一種簡便、快速、靈敏度高的雙重PCR檢測方法，明確致病菌種類對于病害的防治具有重要的意義。

泛菌屬看家基因acnA編碼順烏頭酸酶（aconi-tate hydratase），本研究利用生物信息學的方法對acnA基因進行序列比對，設計了22對特異性引物，分別與已知的白葉枯病菌檢測引物X0080進行配對并篩選，建立了一種雙重PCR檢測方法。該方法可同時檢測樣品中是否含有白葉枯病菌和菠蘿泛菌，為水稻種子檢測、田間監測及制定針對性的防治措施提供技術支撐。

1材料和方法

1.1供試菌株

供試菠蘿泛菌HQOI為本實驗室2021年于安徽省霍邱縣田間分離并保存，其余參試菌株（表1）由本實驗室分離保存。

1.2DNA提取

本研究中所有菌株均使用NB培養基培養（每升含牛肉膏3.0g，蛋白胨5.0g，酵母提取物1.0g，蔗糖10.0g，pH7.0～7.2，其中固體培養基中含15.0g瓊脂粉）。將供試菌株劃線培養于NB固體培養基平板上，28℃倒置培養2d后，挑取單菌落于NB液體培養基中，180r/min振蕩培養至對數期，按照細菌基因組DNA提取試劑盒（艾科瑞，AG21007）操作說明提取DNA。

1.3引物設計

通過基因測序得到菠蘿泛菌HQO1中acnA的基因序列，同時下載NCBI（www．ncbi．nlm．nih．gov）公布的其余泛菌屬acnA基因序列，通過DNA-MAN軟件進行序列比對，分析7種菌的差異位點，設計特異性引物（表2）。

1.4雙重PCR檢測方法的建立

PCR反應體系：2×Pro Taq Master Mix（dye plus）（艾科瑞，AG11112）12.5uL，20umol/L上、下游引物各0.5uL，20umol/L X0080上、下游引物各0.5uL，模板DNA 1uL，ddH90 9.5uL。反應程序為94℃變性30s；98℃變性10s，58℃退火30s，72℃延伸1min，35個循環；72℃延伸2min。PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，根據條帶判斷檢測結果。

為了測試雙重PCR檢測方法的靈敏度，選用菠蘿泛菌與白葉枯病菌的DNA作為模板進行梯度檢測。設定2種DNA的初始濃度各為100ng/uL，并按10倍梯度依次稀釋，所得到的DNA作為模板，后續檢測方法同上。

1.5水稻樣品檢測

種子處理：稱取10g水稻種子置于容器中，加入15mL無菌水浸沒種子，靜置2h后吸取上清液作為待測樣品，通過建立的雙重PCR檢測方法進行檢測。

葉片處理：選取病健交接處的葉片置于培養皿中，加入無菌水漂洗2次，加入75%乙醇浸泡處理15s后用無菌水漂洗2次，用滅過菌的剪刀剪成小段放入1.5mL離心管中，研磨破碎后加入無菌水，2h后吸取上清液作為待測樣品，通過建立的雙重PCR檢測方法進行檢測。

2結果與分析

2.1差異位點篩選與引物設計

本研究通過文獻查閱和序列比對，選擇泛菌屬的看家基因acnA作為篩選基因。在菠蘿泛菌HQOI基因組中，acnA長度為2682bp，另從NCBI下載其余泛菌屬的acnA基因序列（Gene ID為66825758、58737924、67451744、65789518、61251203、57346462），運用DNAMAN軟件進行序列比對，共發現了9處差異較大位點（圖1）。基于這9處差異位點，共設計了22對引物（表2）。

2.2特異性引物篩選

雙重PCR檢測方法需要2對特異性引物在同一反應體系下擴增不同的目標序列，2對特異性引物之間在近似種屬是否存在錯配是雙重PCR檢測方法建立的關鍵。為了篩選到合適的特異性引物，本研究以近似種屬為模板，將引物X0080分別與22對引物進行組合，然后進行PCR擴增，對擴增產物進行檢測的結果如圖2所示。不同引物的擴增結果分為以下4種：1）在非目標泳道擴增出條帶或在陽性對照泳道出現若干條帶，說明該引物不具有特異性（a-440，a-875，a-1066，a-1132，a-839，a-404， a-1030，a-1096，a-466，a-501，a-657，a-1977，a-452，a-643，a-709，a-1493，a-1270，a-273）;2）在陽性對照泳道出現2條帶，但其中一條帶亮度較弱，說明該引物靈敏度低（a-2386，a-2350）；3）在陽性對照泳道出現2條帶，但不易區分，說明該引物的產物大小與白葉枯病菌的特異性引物產物大小接近（a-274）；4）在陽性對照泳道出現2條帶，非目標泳道均為空白，說明該引物組合可以從菠蘿泛菌與白葉枯病菌中特異性擴增出兩條DNA條帶，分子量分別為910bp與162bp，而未能從近似種屬的菌株及空白對照擴增出條帶（a-910）。

2.3雙重PCR檢測方法的特異性

為了進一步驗證引物a-910與引物X0080的特異性，選取了12種常見的細菌基因組DNA為模板（表1）進行PCR擴增。檢測結果如圖3所示，只有菠蘿泛菌和白葉枯病菌能分別擴增出清晰的目的條帶，且均無非特異性雜帶出現，位置和相應的白葉枯病菌對照組（泳道1）以及菠蘿泛菌對照組（泳道2）-致，其他種屬的細菌（泳道3～12）與空白對照均未擴增出條帶，說明本研究設計并篩選的引物a-910在與引物XO080組合后的雙重PCR檢測方法具有種屬特異性，可以將白葉枯病菌和菠蘿泛菌與其他種屬病菌區分開。

2.4雙重PCR檢測方法的靈敏度

利用已建立起來的PCR方法進行靈敏度檢測，結果顯示（圖4），該組引物在25uL的反應體系中可穩定地從至少1pg/uL的基因組模板中擴增得到910bp與162bp的特異性條帶。

2.5雙重PCR檢測方法的抗干擾能力

為了進一步測試雙重PCR檢測方法的抗干擾能力，選取作為供試菌株，在含有菠蘿泛菌和白葉枯病菌的雙重PCR檢測方法中分別加入以上5種供試菌株，測試在同屬種存在的條件下，該體系是否能進行有效擴增。結果如圖5所示，本研究的雙重PCR檢測方法在其他同屬種菌存在的情況下，依然能擴增出相應條帶，目標條帶大小也與之前一致，說明該方法的特異性并不受到同屬種菌的影響。

2.6水稻樣品檢測

為了驗證雙重PCR檢測方法的實際應用情況，隨機選取6種市售水稻品種種子和6份田間發病的葉片進行檢測，結果顯示（圖6，圖7），運用該方法能從帶菠蘿泛菌和白葉枯病菌樣品的上清液中特異地擴增出2條帶，分子量大小分別為910bp與162bp，能從帶菠蘿泛菌樣品的上清液中特異地擴增出910bp的條帶，能從帶白葉枯病菌樣品的上清液中特異地擴增出162bp的條帶，而未能從其他樣品擴增出條帶，說明該方法可以用于水稻樣品中菠蘿泛菌與白葉枯病菌的快速分子檢測。同時對此批樣品進行傳統的菌株分離、測序鑒定，與雙重PCR檢測結果一致，再次說明了該方法的可靠性。

3結論與討論

菠蘿泛菌引起的水稻病害是近年來危害極其嚴重的一種新型細菌病害，該病害發生迅速，從發現發病中心到全田蔓延，僅需要1～2d，在適合的條件下，3～5d就可以導致全田毀滅，損失慘重。在實際生產中，因發病癥狀和白葉枯病相似，容易被當成白葉枯病進行防治，但是使用防治白葉枯的藥劑無法控制該病害的蔓延，同時該病害不僅在抽穗期易發生，在移栽后也容易發生，導致死苗。這兩種病害雖然癥狀相似，但在防治藥劑、防治時期均有較大的差異，因此研究早期的快速檢測技術極其重要，對癥下藥才能有效地減少損失。PCR檢測作為一種檢測方法，相較于傳統耗時耗力的篩選分離，具有簡便、快速、易操作的優點，常被用于日常的檢測工作中。目前針對單一白葉枯病菌或者菠蘿泛菌的PCR檢測方法已有了報道，但這兩種病害在實際情況中存在混發的情況，單一檢測耗時耗力，為病害的防治造成了極大的困難。

本研究基于泛菌屬看家基因acnA，設計并篩選出了一對引物a-910，將其與已報道的白葉枯病菌檢測引物X0080進行組合，成功建立了一種雙重PCR檢測方法。結果顯示，利用該檢測方法，可從樣品中特異性地檢測出菠蘿泛菌和白葉枯病菌，靈敏度高，25uL體系中可穩定地從至少1pg/uL的基因組DNA模板中擴增出特異性條帶；在實際應用中，可從帶有菠蘿泛菌和白葉枯病菌的水稻種子或者發病葉片中一次性同時檢測出菠蘿泛菌和白葉枯病菌，為水稻種子檢測、田間監測及精準防治提供了技術支撐。

然而，本方法也有局限性。菠蘿泛菌不僅僅是致病菌，同時也是一種內生菌，本文所研究的檢測方法無法區分檢測的菠蘿泛菌是內生菌還是致病菌，但這并不影響本文中雙重PCR檢測方法對水稻樣品的檢測結果。菠蘿泛菌的確是一種內生菌，但是在水稻上其占比非常低。郭鶴寶等在2019年從8個不同基因型水稻種子中分離了146株內生泛菌，但其中并沒有分離到菠蘿泛菌P．ananatis。本年度本團隊利用該檢測方法完成了來自不同地區的35份疑似病樣的檢測，菠蘿泛菌檢出率為62.8%，在后續的調查中，這些地區均發生了水稻新型細菌病害，對檢測地區的發病組織進行取樣分離、純化，經公司測序鑒定病原菌為菠蘿泛菌P．ananatis，檢測準確率100%。為了提高檢測的準確率，降低假陽性率，本團隊目前也正在開展如何區分菠蘿泛菌是致病菌還是內生菌這方面的研究，計劃從水稻中分離不具有致病性的菠蘿泛菌，然后進行全基因測序，與致病性的菠蘿泛菌進行對比，找出差異點，從而區分內生菌菠蘿泛菌和致病菌菠蘿泛菌。