櫻桃小果病毒1號膠體金免疫層析試紙的研發與應用

郭靜靜 田利光 陳呈濤 趙怡琳 遲勝起 原雪峰 曹欣然

關鍵詞：櫻桃小果病毒1號；病毒檢測；膠體金免疫層析試紙；外殼蛋白

近年來對櫻桃主產區病蟲害情況調查發現，病毒病是危害櫻桃的主要病害，并且對櫻桃生產的影響逐年加重，目前國內報道了12種能夠侵染甜櫻桃的病毒，其中櫻桃小果病毒1號（little cher-ry virus 1，LChV-1）、2號（LChV-2）和3號（LChV-3）是櫻桃小果?。╨ittle cherry disease，LCD）的主要病原，侵染后導致櫻桃果實縮小，嚴重影響甜櫻桃的產量，甚至徹底喪失經濟價值。LChV-1田間檢出率較高。該病毒屬于長線形病毒科長線病毒屬Closterio‘-oirus[13]。多數品種對LChV-1敏感，因此在田間生產中對該病毒的檢測尤為重要。

病毒檢測常用的方法有血清學檢測（蛋白水平）和PCR/qPCR/RT-PCR/法（核酸水平）等。在病毒進入植物體的過程中，高度保守的含有多個抗原決定簇的CP蛋白起重要作用，決定著病毒的抗原性，因此對LChV-1的CP蛋白免疫獲得抗體后可以對病毒進行特異性檢測。常規的Westernblot和PCR等方法均需在實驗室完成，不能滿足田間快速檢測的需求。目前，環介導等溫擴增（loop-me-diated isothermal amplification，LAMP）技術、膠體金免疫層析（colloidal gold immunochromatographyassay，GICA）技術和重組酶聚合酶擴增（recombi-nase polymerase amplification，RPA）技術可以滿足田間檢測。其中膠體金免疫層析技術是以血清學檢測法為原理建立的一種檢測方法，是將膠體金作為示蹤標志物應用于抗原抗體反應的一種新型的免疫標記技術。該方法只要根據條帶指示即可判斷病毒的有無，不需要專用儀器和專業技術人員操作，能夠滿足田間快速檢測的需求。

LChV-1存在潛伏侵染現象，在苗期獲得無毒種苗是預防櫻桃病毒病的有效措施，所以，早期的田間檢測至關重要。目前的檢測技術無法滿足田間快速檢測的需求。本研究采用膠體金免疫層析試紙的方法，可以用較短時間呈現檢測結果，旨在為櫻桃小果病的綜合防控提供了有效監測和檢測手段。

1材料與方法

1.1構建含有LChV-1 CP編碼序列的原核表達載體

對NCBI上已經報道的櫻桃小果病毒1號分離物序列（GenBank序列登錄號分別為KU715989、KR080325、JX669615、NC001836和KR736335）進行比對分析，設計帶有BarnH工和Not工酶切位點的引物LChV-1-CP-BamHI-12061-F（5'-AAGGATCCAT-GGCGAATTTAGCTTTCACGAAA-3），LChV-1-CP-Notl-13275-R（5'-TTGCGGCCGCTTAATTT-CTTCTACCGCGACGTGG-3）。使用RNAprepPure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]提取植物總RNA，反轉錄為cDNA，以cDNA為模板進行PCR擴增。PCR反應體系（25uL）：10×PCR緩沖液（Mg2+ plus）2.5uL，10mmoL/L dNTPs

1uL，LChV-1-CP-BamHI-12061-F和LChV-1-CP-Notl-13275-R各1uL，cD-NA 1uL，5U/uL Taq DNA聚合酶1uL，ddH20補足至25uL。PCR反應程序：94℃預變性5min;94℃變性40s，50℃退火40s，72℃延伸2min，共30個循環；72℃10min，

將PCR產物連接到表達載體pESC-HIS上，經雙酶切鑒定和測序得到酶切位點和序列信息正確的重組表達載體pESC-HIS-LChV-1-CP。

1.2LChV-1CP蛋白的原核表達及蛋白純化

將pESC-HIS-LChV-1-CP原核表達質粒轉化到大腸桿菌Rosetta感受態細胞中。挑取含重組質粒的Rosetta菌株于LB培養基中活化8h，然后擴大培養至OD600達0.5左右，在LB培養基中加入0.5mmol/L的IPTG繼續振蕩培養4h，進行目的蛋白的誘導表達。收集少量菌體加入2×SDS蛋白上樣緩沖液[20 mmoL/L Tris-HCl（pH 7.4）、0.2moL/L NaCI、1mmoL/L EDTA]沸水浴8min，采用SDS-PAGE電泳檢測誘導表達的蛋白質。成功表達后，將獲得的菌體超聲波破碎，分別檢測上清液和沉淀物中蛋白質含量，確定表達蛋白的可溶性。

大量誘導表達LChV-1的CP蛋白并超聲破碎。上清液用0.22um的水系濾膜過濾至50mL離心管中，過Ni柱純化（整個層析過程在4℃環境中進行）。裝柱：根據待純化的蛋白量，將2 ml。介質加入層析柱；平衡：用5～10倍柱體積平衡緩沖液平衡層析柱；上樣：將蛋白加入層析柱中，收集流出液；洗滌：用洗滌緩沖液（19.6mL 1×Buffer B，400uL1mol/L咪唑）分兩次洗脫雜蛋白，每次1mL，再用洗脫緩沖液（8.5mL1×Buffer C，1.5mL 1mol/L咪唑）洗脫目的蛋白，收集5管流出液（每管500uL）。SDS-PAGE電泳檢測，-80℃保存。

1.3LChV-1 CP抗血清制備、特異性檢測及效價分析

將純化后的LChV-1 CP蛋白送北京華大基因科技有限公司進行抗血清制備。采用Western blot檢測抗血清的特異性。獲得的一抗的多抗血清終濃度為1：5000，加入二抗終濃度為1：20000。使用間接ELISA方法分析抗血清效價，多抗血清用TBS從200倍開始2倍梯度稀釋，終濃度分別為200、400、800、1600、3200、6400、12800倍和25600倍，反應終止后在波長405nm下測定吸光度，以OD值大于0.1標準判斷為陽性。

1.4膠體金免疫層析試紙的研發

1.4.1確定最佳抗體標記濃度

將制備好的膠體金溶液pH調節至7.08。取不同濃度的抗血清30uL加入離心管中，加入膠體金125uL，5min后，加入10% NaCI，1h后觀察顏色變化，顏色不變的最低濃度即為最佳抗體標記濃度。

1.4.2制備金標抗體

取1mL膠體金，用0.2mol/L碳酸鉀調節pH至7.08。將最佳抗體標記濃度（0.24mg/mL）的抗血清加入到1mL膠體金中，迅速振蕩5min，室溫靜置1h；加入137.8uLBSA至終濃度為1%;振蕩5min后靜置1h；13000r/min4℃離心25min，棄上清，加入1mL含0.01mol/L硼砂的2%BSA重懸沉淀；重復步驟上一步；13000r/min 4℃離心25min，加入200uL TBS重懸沉淀。

1.4.3膠體金免疫層析試紙的檢測原理

試驗采用競爭法。在試紙條的結合墊上固定金標抗體，NC膜的T線和C線上分別固定待測抗原和能與金標抗體特異性結合的二抗。當待測樣品液體滴加到試紙條上后，通過層析作用，液體依次會流過結合墊、T線、C線。當樣品中含有目的抗原時，移動至結合墊時待測抗原與結合墊上的金標抗體結合，移動至T線時，由于金標抗體已經與樣品中的待測抗原結合，故無法被T線上的抗原捕獲，膠體金不會發生聚集，T線不會顯色，移動至C線時，游離的金標抗體被二抗捕獲，膠體金聚集并顯色，結果呈現為一條線；當樣品中不含有目的抗原時，液體移動至結合墊，結合墊上的金標抗體上的抗原結合位點未被占據，液體移動至T線，金標抗體被T線上的抗原捕獲，膠體金聚集并顯色，液體運動至C線，游離的金標抗體被二抗捕獲，膠體金聚集并顯色，結果呈現為兩條線。

1.5田間樣品檢測

采用膠體金免疫層析試紙條及常規RT-PCR對田間甜櫻桃樣品進行檢測。田間甜櫻桃上常發生的病毒有櫻桃小果病毒1號、櫻桃小果病毒2號（littlecherry virus 2，LChV-2）、櫻桃病毒A（cherry virus A，CVA）、櫻桃綠斑駁病毒、李矮縮病毒（prune dwarf virus，PDV）、黃瓜花葉病毒（cucumber mosaic virus，CMV）、李樹皮壞死與莖痘伴隨病毒（plum bark necrosis stem pitting-asso-ciated virus，PBNSPaV）、李屬壞死環斑病毒（prunus nec-rotic ring spot virus，PNRSV）和柑橘葉斑駁病毒（citrusleaf blotch virus，CLBV）。這些病毒的RT-PCR檢測所用的特異性引物參考專利ZL201811480617.2。

田間甜櫻桃樣本于2021年7月采集于煙臺棲霞，品種為‘輝煌’‘玲瓏脆’‘櫓櫻三’‘瑞德’‘五月紅’。采用TransZoI Plant試劑盒提取植物葉片總RNA，利用RT-PCR檢測病毒。反轉錄反應體系（25uL，試劑購自TaKaRa公司）：植物總RNA 20～50ng，100mmol/L反向引物 5．0uL，10mmol/LdNTPs 4．0uL，ddH25．0uL。80℃ 3 min然后冰上5min，加入5×Reverse Transcriptase M-MLVbuffer 5．0uL，反轉錄酶（M-MLV）0.5uL，Recom-binant RNase Inhibitor 0．5uL，于42℃反應90min。PCR反應體系（20.0uL）：cDNA 2．0uL，100mmol/L上、下游引物各0.5uL，2×Taq Master Mix（康為世紀生物科技有限公司）10uL，超純水7.0uL。反應條件：94℃5min；94℃40s，50～54℃40s，72℃20～35s，30個循環；72℃10min。

將櫻桃葉片用緩沖液（20mmol/L Tris-HCI，150mmol/L NaCI，0.05% Tween-20，pH 7.5）研磨后，滴加于膠體金免疫層析試紙上。10min后待條帶清晰穩定后，通過觀察檢測線和質檢線的顯色情況進行判定。檢測線沒有紅色條帶，質檢線出現紅色條帶，判定為陽性，說明所檢測植物樣本中有LChV-1；檢測線和質檢線兩條線都顯現紅色條帶，判定為陰性，即所檢測樣品中不含有LChV-1；只有檢測線有條帶，或檢測線質檢線均沒有條帶，表明該試紙條檢測結果不可信。

2結果與分析

2.1LChV-1 CP蛋白的原核表達及可溶性

SDS-PAGE電泳發現不同濃度IPTG誘導表達出的目的蛋白量差異不明顯。選取0.5mmol/L濃度的IPTG進行目的蛋白的誘導表達，表達的蛋白分子量在43～55kD之間，與LChV-1-CP蛋白的分子量（45kD）相符（圖2）?？扇苄詸z測結果顯示，目的蛋白在上清和沉淀中均存在（圖2）。上清中的目的蛋白可用于Ni柱純化。

2.2抗血清的特異性及效價

以實驗室保存的健康煙草葉片、重組的LChV-1CP蛋白、帶有LChV-1的田間櫻桃葉片為材料，對制備好的抗血清進行特異性檢測。結果（圖3）顯示，重組的LChV-1CP蛋白和田間樣本在45kD處有明顯特異性條帶。表明該抗體可用于LChV-1的檢測。間接ELISA進行抗血清的效價分析顯示，抗血清在稀釋12800倍時，仍然可以檢測出陽性樣本。

2.3膠體金免疫層析試紙檢測體系的優化

2.3.1最佳抗體標記濃度

膠體金結合墊上含有抗體標記膠體金顆粒，該抗體為本實驗所獲得的特異性良好的LChV-1CP的抗血清。為確定結合墊上最佳抗體標記濃度，將終濃度分別為0，0. 12，0.24，0.48mg/mL和0. 72mg/mL用作抗體標記濃度，以不變顏色的最低濃度為金標抗體的最佳濃度。結果顯示，最佳標記濃度為0.24mg/mL（圖4）。

2.3.2最佳檢測線濃度

檢測線包被抗原，該抗原為本實驗所獲得的可溶性良好的LChV-1CP的重組蛋白。為確定最佳檢測線濃度，將不同抗體終濃度（0.0625，0.125，0.25，0.5，1mg/mL）重組蛋白點涂于硝酸纖維素膜上，作為檢測線。如圖5所示，肉眼可識別的最低濃度即為最佳檢測線濃度，最終確定最佳檢測線濃度為0.25mg/ml．。

2.3.3最佳質檢線濃度

確定檢測線濃度后進行質檢線濃度的確定，將不同終濃度（0.1，0.08，0.06，0.04，0.02mg/mL）羊抗兔IgG抗體點涂于硝酸纖維素膜上，作為質檢線，肉眼可識別的最低濃度即為最佳質檢線濃度，最終確定最佳質檢線濃度為0.04mg/mL（圖6）。

2.3.4膠體金免疫層析試紙的特異性

用實驗室保存的分別單獨被黃瓜花葉病毒（cu-cumber mosaic vlrus，CMV），李屬壞死環斑病毒（prunus necrotic ring spot vlrus，PNRSV），李矮縮病毒（prune dwarf virus，PDV）侵染的植物樣品進行檢測。結果（圖7）顯示，LChV-1中檢測線不顯色，其余3種樣品中檢測線顯色，說明該試紙條可以特異性檢測LChV-1。質檢線顯色，說明該試紙條可正常使用。該試紙條可以特異性檢測出含有LChV-1病毒的植物樣本。

2.3.5膠體金免疫層析試紙的田間應用

試紙條結果（圖8a）顯示，樣本1中檢測線不顯色，質檢線顯色，表明樣本含有LChV-1，樣本2～樣本9檢測線和質檢線均顯色，表明樣本不含有LChV-1；將所有樣本提取RNA進行RT-PCR檢測，結果與試紙條結果一致（圖8b）。因此，在田間樣品的檢測中，制備的膠體金免疫層析試紙可以成功檢測出LChV-1，具有良好的田間應用效果。

3結論與討論

膠體金免疫層析技術是一種將膠體金標記技術、免疫檢測技術、層析分析技術和單克?。ǘ嗫寺。┛贵w多種方法相結合的一種固相標記檢測技術。該技術作為一種新型的免疫標記示蹤技術，比傳統酶聯免疫標記（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）、聚合酶鏈式反應（polymerase chain reac-tion，PCR）等方法更快速簡便、不需要特殊設備和試劑、結果判斷直觀等優點，成為當前檢測領域的熱點。其檢測原理分為競爭法與雙抗夾心法，競爭抗體法適用于含有單一抗原表位的小分子抗原，雙抗夾心法適用于含有多個抗原表位的大分子抗原，本試驗選用競爭法。前期試驗中也采用過結果更容易判讀的雙抗夾心法，但并未成功，推測原因可能由于LChV-1CP蛋白表位比較單一，后改為競爭法。

試紙樣品墊的作用是迅速吸收待測樣品，儲存樣品并迅速釋放待測樣品，試驗前期采用磷酸緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）加吐溫-20對樣品墊進行預處理，發現層析過程中樣品墊與結合墊連接處可見膠體金殘留堵膜，推測可能由于PBST鹽濃度較高容易引起沉淀，后調整為Tris緩沖液（Tris buffered solution，TBS）加吐溫-20，再添加活性劑，這樣可以使樣品墊緩沖液分布均勻，釋放樣品速率加快，膜上背景干凈，膠體金釋放完全。膠體金免疫層析試紙中的核心組件是硝酸纖維素膜（NC），是免疫反應的主要載體，其質量主要由兩方面決定，一是結合大分子物質的能力，二是膜的孔徑。膜的孔徑是影響層析速度的關鍵因素。孔徑越小，層析速度越慢，抗原抗體結合時間越長，反應越充分，但發生非特異性結合的可能性也相應提高，所以需要根據抗原（抗體）蛋白分子大小、檢測原理和廠家等多種因素進行摸索。

在我們前期工作中發現，甜櫻桃在田間復合侵染現象非常普遍。由于櫻桃小果病毒1號造成危害較為嚴重，故本試驗選擇該病毒進行膠體金免疫層析試紙的研發，旨在為LChV-1的早期診斷和綜合防治提供監測和檢測手段。后期可根據甜櫻桃復合侵染特點，針對兩種或更多種病毒研發兩重或多重GICA試紙，滿足田間的檢測需求。