分散固相萃取超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法同時檢測大豆植株及土壤中煙嘧磺隆、莠去津及其代謝物殘留

王寬 魏龍兵 任業(yè)雙 潘興魯 吳小虎 徐軍 董豐收 鄭永權(quán)

關(guān)鍵詞：煙嘧磺隆；莠去津；代謝物；農(nóng)藥殘留；大豆植株；土壤

煙嘧磺隆（nicosulfuron）（圖1）是一種磺酰脲類除草劑，其可抑制乙酰乳酸合成酶活性，影響植物分生組織的分化，使植株生長停滯，莖葉褪綠并逐漸死亡。煙嘧磺隆主要用于防治玉米田一年生和多年生禾本科雜草和部分闊葉雜草。莠去津（atrazine）（圖1）是一種三嗪類除草劑，其可抑制光合作用中的希爾反應，降低植物中CO2的固定速率，導致植物失綠干枯死亡，在玉米生產(chǎn)中廣泛用于出苗前后雜草的防控。煙嘧磺隆和莠去津難降解，在土壤中的半衰期較長，并且莠去津在土壤中可轉(zhuǎn)化為羥基莠去津、脫乙基莠去津、脫異丙基莠去津、脫乙基羥基莠去津、脫乙基脫異丙基莠去津和脫異丙基羥基莠去津等6種主要代謝物（圖1）。其中，脫乙基莠去津和脫異丙基莠去津是土壤中最常見的降解產(chǎn)物，具有很強的水溶性、極性和穩(wěn)定性，其活性與母體活性水平相當。羥基莠去津吸附性強，易滯留于土壤中。并且脫乙基莠去津、脫異丙基莠去津、羥基莠去津和母體莠去津具有相同的毒性模式，這3個代謝物對生態(tài)環(huán)境和人類健康會存在威脅，因此常被同時監(jiān)測。在我國煙嘧磺隆和莠去津在玉米田中使用量大，并且兩種農(nóng)藥會被同時使用防除雜草，截至目前，中國已有365個煙嘧磺隆和莠去津復配制劑產(chǎn)品（包含其他除草劑）登記。已有研究表明，由于玉米田過量施用煙嘧磺隆和莠去津，導致土壤中除草劑殘留高，影響后茬作物大豆的生長。因此，煙嘧磺隆和莠去津產(chǎn)生的殘留藥害問題及科學規(guī)范使用應得到重視。

2022年中央一號文件明確指出要大力實施大豆和油料產(chǎn)能提升工程，在黃淮海、西北、西南地區(qū)推廣玉米大豆帶狀復合種植。隨著復合種植面積逐步擴大，大豆產(chǎn)地土壤中煙嘧磺隆和莠去津的殘留水平直接影響了大豆的安全生產(chǎn)。然而，目前有關(guān)煙嘧磺隆和莠去津的分析方法多是只針對母體化合物的檢測，忽略了莠去津代謝物在土壤和后茬作物中的殘留。基于此，本研究建立了一種固相分散萃取一超高效液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜法，可同時測定土壤和大豆植株中煙嘧磺隆和莠去津及其代謝物殘留量，以期為煙嘧磺隆和莠去津的科學使用及后茬作物的安全種植提供有效監(jiān)測方法。

1材料與方法

1.1農(nóng)藥標準品與試劑

農(nóng)藥標準品：煙嘧磺隆（純度99.0%），沈陽化工研究院；莠去津（純度99.2%）、脫異丙基莠去津（純度98.9%）、脫乙基莠去津（純度98.0%）和羥基莠去津（純度96.8%），德國Dr．Ehrenstorfer Gm-bH公司。超純水由Genie E（上海樂楓生物科技有限公司，中國）制得；乙二胺一N一丙基硅烷化硅膠（PSA，40um）和石墨化炭黑（GCB，40um），天津博納艾杰爾科技有限公司；色譜級甲酸和乙腈，Sigma-Aldrich公司；分析級乙腈、氯化鈉和無水MgS04，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2儀器設(shè)備

Agilent 1290-6470A超高效液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜，Agilent公司（美國）；XW-80A渦旋混合器、高速振蕩儀，Scientific industries（美國）；TG16-WS臺式高速離心機，湘儀離心機儀器有限公司；醫(yī)用無菌注射器，上海治宇醫(yī)療器械有限公司。

1.3標準溶液制備及標準曲線

用電子分析天平準確稱取一定質(zhì)量農(nóng)藥標準品于100mL棕色容量瓶中，加入色譜級乙腈溶解并定容，得到100mg/L的農(nóng)藥標準混合溶液母液。將母液逐級梯度稀釋，制備得到系列濃度分別為0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1mg/L的標準溶液。基質(zhì)匹配標準溶液用空白大豆植株和土壤基質(zhì)的提取液逐級稀釋混合標準品母液得到。分別以目標化合物的質(zhì)量濃度為橫坐標，相應的峰面積為縱坐標繪制標準曲線。

1.4樣品前處理方法

稱取5.0g均質(zhì)大豆植株（幼苗期至鼓粒期）和土壤樣品分別置于50mL聚四氟乙烯離心管中（土壤樣品加入5mL超純水），加入10mL乙腈（含2%甲酸），振蕩10min，加入1gNaCI和4g無水MgS04繼續(xù)振蕩5min，4000r/min離心5min，用移液管吸取1.5mL上清液至內(nèi)含吸附劑（土壤樣品使用50mg PSA+150mg無水MgS04，大豆植株樣品使用50mg PSA 50mg GCB 150mg無水MgS04）的2mL離心管中，渦旋2min，5000r/min離心5min，使用2.5 mL無菌注射器抽取上清液，過0.22um有機濾膜至進樣小瓶中，待UPLC-MS/MS分析。

1.5UPLC-MS/MS分析條件

色譜條件：Poroshell 120 EC-C18色譜柱（2.1mm×50mm，1.9um）；柱溫：30℃；流動相A：0.2%甲酸水；流動相B：乙腈；流速：0.3mL/min；進樣量：5uL;梯度洗脫條件見表1。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源，正離子電離模式（ESI+），干燥氣溫度325℃，干燥氣流速10L/min。霧化氣壓力50psi，鞘氣溫度400℃，鞘氣流速12L/min，毛細管電壓4000V，噴嘴電壓500V；數(shù)據(jù)采集采用多反應監(jiān)測模式，質(zhì)譜參數(shù)見表2。

1.6方法驗證

根據(jù)NY/T 788-2018農(nóng)作物中農(nóng)藥殘留試驗準則要求，通過添加回收試驗對方法的準確性、精密度、線性、定量限和基質(zhì)效應（matrix effect，ME）進行驗證。分別將煙嘧磺隆、莠去津及其代謝物混合標準溶液添加到空白大豆植株和土壤均質(zhì)樣品中，設(shè)置3個添加水平，分別為0.01、0.10、1.00mg/kg。按1.4條件進行檢測，計算添加回收率及相對標準偏差。按照NY/T 788-2018要求，方法范圍內(nèi)所有分析物的平均回收率應在70%～120%之間，相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）≤20%。基質(zhì)效應（ME）=（基質(zhì)匹配標準曲線斜率／溶劑標準曲線斜率）×100%，一般基質(zhì)效應在80%～120%之間可忽略基質(zhì)效應。

通過比較乙腈和含2%甲酸的乙腈作為土壤和大豆植株樣品提取劑時目標化合物的回收率，來確定樣品的提取溶劑。PSA和GCB是農(nóng)藥殘留分析中常用的凈化吸附劑，PSA可吸附有機酸，某些糖等極性化合物，GCB可吸附色素。通過比較不使用吸附劑、使用PSA以及使用PSA與不同量GCB組合對土壤和大豆植株樣品提取液的凈化效果和目標化合物的回收率，來確定樣品的凈化吸附劑。

2結(jié)果與分析

2.1提取溶劑選擇

比較乙腈和含2%甲酸的乙腈作為土壤和大豆植株樣品提取劑時目標化合物的回收率，結(jié)果（圖2）表明，當使用乙腈作為提取劑時，土壤和大豆植株中5種目標化合物的回收率分別在20%～108%和27%～145%范圍內(nèi)。使用含2%甲酸的乙腈時，土壤和大豆植株中5種目標化合物的回收率分別在60%～103%和75%～97%范圍內(nèi)，提取效果比乙腈好。在提取溶劑中加入適量酸有助于提高目標化合物的回收率。因此本研究中土壤和大豆植株樣品均使用含2%甲酸的乙腈提取。

2.2吸附劑選擇

比較了不使用吸附劑、使用PSA以及使用PSA與不同量GCB組合對土壤和大豆植株樣品提取液凈化吸附的效果（圖3）和目標化合物的回收率（圖4）。隨著GCB用量增加，土壤和大豆植株提取液被凈化得更好。但是對于土壤樣品，目標化合物的回收率隨著GCB用量增加而逐漸降低。不使用吸附劑、使用50mg PSA.50mg PSA+10mg GCB.50mgPSA+30mg GCB.50mg PSA+50mg GCB時，土壤提取液中5種目標化合物的回收率分別在71%-110%.71%～105%.60%-103%.36%-93%.26%～88%范圍內(nèi)。而當不使用吸附劑、使用50mgPSA.50mg PSA+10mg GCB.50mg PSA+30mgGCB.50 mg PSA+50 mg GCB.50 mg PSA+70 mgGCB時，大豆植株樣品提取液中5種目標化合物的回收率分別在90%～100%、72% -97%、76%～113%、75%-97%、70%-113%、64%-107%范圍內(nèi)。綜合考慮凈化后的回收率和樣品澄清度，選擇50mg PSA作為土壤樣品的凈化吸附劑，50mg PSA+50mg GCB作為大豆植株樣品的凈化吸附劑。

2.3方法正確度、精密度、線性、定量限和基質(zhì)效應

平均回收率和RSD結(jié)果（表3）表明：在0.01～1.00mg/kg添加水平下，煙嘧磺隆、莠去津及其3個代謝物在土壤和大豆植株中的平均回收率分別在71%～105%和70%～113%之間，RSD分別在0.3%～10.3%和2.1%～11.8%之間（n=5）。由表4可知，在試驗范圍內(nèi)5種目標化合物的質(zhì)量濃度與對應的峰面積之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，R2≥0.984 1，5種目標化合物的LOQ為0.01mg/kg。該方法正確度、精密度、線性和LOQ良好，符合農(nóng)藥殘留分析要求。

在土壤和大豆植株中5種目標農(nóng)藥的基質(zhì)效應分別為60%～140%和20%～80%。其中大豆植株對煙嘧磺隆、莠去津、脫乙基莠去津和脫異丙基莠去津具有基質(zhì)抑制效應，對羥基莠去津基質(zhì)效應不明顯。土壤對脫乙基莠去津和脫異丙基莠去津具有基貢抑制效應，對羥基莠去津具有基質(zhì)增強效應，而對煙嘧磺隆和莠去津基質(zhì)效應不明顯。因此，為了更好地定量分析，使用基質(zhì)匹配標準溶液校準以降低基質(zhì)效應影響。

2.4實際樣品分析

基于上述開發(fā)的方法，對采集自內(nèi)蒙古自治區(qū)不同農(nóng)田的幼苗期至鼓粒期大豆植株（15份）和土壤樣品（15份）進行了農(nóng)殘測定（表5）。在8份大豆植株樣品中檢測出脫乙基莠去津，殘留量在0.01～0.051mg/kg范圍內(nèi)，其余樣品中目標化合物的殘留量均<0.01mg/kg。

3結(jié)論

本研究建立了一種分散固相萃取一超高效液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜法同時檢測大豆植株及土壤中煙嘧磺隆、莠去津及其代謝物殘留的方法。結(jié)果表明：在0.01～1.00mg/kg添加水平下，煙嘧磺隆、莠去津及其代謝物的平均回收率為70%～113%，相對標準偏差在0.3%～11.8%之間，目標化合物濃度在0.001～1mg/kg范圍內(nèi)與對應的峰面積之間線性關(guān)系良好，決定系數(shù)R2≥0.9841，方法的定量限為0.01mg/kg。該方法簡便、快捷、準確、靈敏度高，適用于大豆植株（幼苗期至鼓粒期）和土壤中煙嘧磺隆、莠去津及其代謝物殘留的檢測，可為煙嘧磺隆和莠去津的科學使用及后茬作物的安全種植提供有效監(jiān)測方法。