廣西澳洲堅果干花病病原菌鑒定

王彤彤 蔣婷 譚德錦 王曉宇 盧艷春 楊志強 徐冬英

關鍵詞：澳洲堅果干花病；亞洲新擬盤多毛孢；腐生新擬盤多毛孢；病原鑒定

澳洲堅果Macadarnia integrifolia，俗稱夏威夷果，廣泛種植于熱帶與亞熱帶地區，可獲得營養豐富的堅果仁。澳洲堅果因管理方便，果仁市場缺口大，經濟效益高等特點，正在廣西大力推廣種植。但花病害的發生會導致授粉效率低下，降低其開花結果潛力，進而造成產量損失。近年來國內外開始報道澳洲堅果干花病的發生，Akinsanmi等研究發現擬盤多毛孢屬的Pestalotiopsis rn.acadarniae與新擬盤多毛孢屬的Neopestalotiopsis rnacadarniae為引起澳大利亞昆士蘭和新南威爾士澳洲堅果干花病的致病菌。Prasannath等發現澳大利亞昆士蘭和新南威爾士的澳洲堅果干花病致病菌為5個新擬盤多毛孢屬新種，分別為蔣卓恩將中國廣西岑溪市、崇左市扶綏縣、龍州縣等地澳洲堅果干花病致病菌鑒定為棒狀新擬盤多毛孢。

筆者于2022年4月在廣西南亞熱帶農業科學研究所澳洲堅果種質資源圃內發現澳洲堅果干花病，為明確該澳洲堅果干花病病原種類，本研究采集患病堅果花序，分離病原菌，根據柯赫氏法則鑒定病原，并依據形態特征與翻譯延長因子微管蛋白基因（beta-tubulin gene，TUB）、核糖體內轉錄間隔區（rDNA internal transcribed spaces，ITS）多基因序列分析法進行病原種類鑒定，旨在明確廣西澳洲堅果干花病致病菌種類，以期為病害防治提供依據。

1材料與方法

1.1病樣采集、病菌分離與形態學特征觀察

2022年4月于廣西南亞熱帶農業科學研究所種質資源苗圃內發現一種澳洲堅果花部病害。組織分離法進行病原分離，PDA培養基中培養至分生孢子產生，隨后挑取單孢獲得純化菌落，菌種保存于4℃。形態學觀察包括：測定菌落在PDA培養基上的生長速率及菌落形態；在電子顯微鏡（Olympus，BX43，日本）的100×油鏡下拍照并測量25個分生孢子的長寬與附屬絲長度。參考Maharachchikum-bura等的研究并依據病原菌的形態學特征進行初步鑒定。

1.2致病性測定

選擇田間長勢一致的澳洲堅果健康花序進行回接試驗。將濃度為1×106個/ml．的病菌孢子懸浮液噴施于健康花序。利用封口機制作適宜花序長度與大小的長條形保鮮袋，在袋上戳出孔洞，袋內噴施少量無菌水后將處理好的花序進行套袋，并做好標記，每處理接種6個花序。以噴施無菌水為對照，共處理3株。接種后定期觀察發病情況。發病后對病花進行組織分離，若得到的病菌與接種菌一致，則確定其為致病菌，完成柯赫氏法則驗證。

1.3分子鑒定

準備培養好的病原菌培養皿，用滅菌藥匙將菌絲及孢子刮至1.5mL滅菌離心管中，放入2～3粒3mm小鋼珠，研磨機中打碎。隨后利用購自生工生物工程（上海）股份有限公司的真菌基因組DNA抽提試劑盒提取病原真菌DNA。選取TEF、TUB、ITS引物對進行PCR擴增，產物送至上海擎科生物科技有限公司得到拼接序列，于NCBI中對3種序列進行BLAST，下載相關序列后，使用MEGA軟件進行單基因序列的對齊與剪切，隨后將序列依據TEF-TUB-ITS的順序進行拼接，并利用最大似然法（ML）構建多基因系統發育樹。

2結果與分析

2.1田間癥狀

病樣采集地點為澳洲堅果種質資源收集圃，該苗圃收集并栽培著多個澳洲堅果品種。澳洲堅果干花病田間癥狀為：病害初期花瓣變為黃褐色，柱頭仍正常，花序軸頂端出現褐色或黑色干枯病變，隨后病原菌沿花序軸向近枝干部侵染（圖1a），嚴重時整個花序干枯死亡，花器官不能正常發育（圖1b），空氣濕度大時，干枯部位有墨綠色霉層覆于其上。該病害田間發病率約為20%。

2.2致病性測定

采集病樣后，共分離純化到9個菌株，分別命名為JGGH1～JGGH9。且田間接種后9個菌株均能致病，但由于依據形態學特征與多基因建樹只能將JGGH2、JGGH5與JGGH8鑒定到種，其余6個菌株只能明確到屬，因此本文后續只對澳洲堅果干花病致病菌JGGH2、JGGH5與JGGH8進行研究。

回接試驗結果顯示，接種JGGH2、JGGH5、JGGH8菌株4d時健康花序已全部發病。JGGH2與JGGH8處理病部部分單花花瓣呈現黃褐色，柱頭仍可正常伸出且顏色正常，花序軸也并無發病癥狀（圖1d、f）；接種JGGH5后病害發生程度明顯強于接種JGGH2與JGGH8，大部分單花已不能正常發育，柱頭不能正常伸出，花序軸干枯、變褐（圖1e）；而對照組并無病癥出現（圖1c）。JGGH2、JGGH5、JGGH8菌株接種后表現癥狀均與田間癥狀相似。隨后進行接種病部組織分離，得到的病菌皿內培養特征與原接種菌株幾近一致，完成科赫氏法則驗證，確定JG-GH2、JGGH5、JGGH8為澳洲堅果干花病致病菌。

2.3形態學鑒定

菌株JGGH2在PDA培養基上的生長速率為（7.03±0.08） mm/d，菌落圓形，輪紋狀，菌絲白色（圖2a）。培養后期產生嵌入基質的黑色分生孢子堆，排列不規則。分生孢子紡錘狀，直或略彎，4隔膜，大小為（50.31±4.71） （39.68～57.26） um×（13.73±1.05） （11.87～15.87）um;基底細胞圓錐形，透明，基底附屬絲長度為（13.68±2.91） （7.73～20.02）upm;3個中位細胞雜色，棕色，中間細胞顏色略深；頂端細胞圓錐形，頂端附屬絲不分支，2～3條，長度為（40.55±7.16） （27.79～54.96）um（圖2d）。據此，初步判定JGGH2歸屬于新擬盤多毛孢屬Neopestalotiopsis sp。

菌株JGGH5在PDA培養基上的生長速率為（7.00±0.07） mm/d，菌落近圓形，具明顯輪紋，菌絲白色、豐茂（圖2b）。培養后期產生較多嵌入基質的黑色分生孢子堆，排列不規則。分生孢子紡錘狀，4隔膜，大小為（56.95±2.47） （52.28～61.54）um×（14.62±1.02） （13.19～16.69）um;基底細胞圓錐形，透明，基底附屬絲長度為（17.70±5.21） （10.46～28.91）um;3個中位細胞雜色，棕色，第2個細胞淺棕色，第3、4個細胞為較深棕色，中間細胞和第4細胞之間的隔增厚且呈現深棕色；頂端細胞圓錐形，頂端附屬絲不分支，多數2條，長度為（62.21±7.80）（47.29～80.28）um（圖2e）。據此，初步判定JGGH5歸屬于新擬盤多毛孢屬Neopestalotiopszs sp.。

菌株JGGH8在PDA培養基上的生長速率為（6.94±0.05）mm/d，菌落圓形，呈現明顯且規則的輪紋狀，菌絲白色（圖2c）。培養后期產生嵌入基質的黑色分生孢子堆，排列不規則。分生孢子紡錘狀，直或略彎，4隔膜，大小為（53.87±3.06） （48.62～60.36）um×（13.66±0.85） （11.88～15.49）um;基底細胞圓錐形，透明，基底附屬絲長度為（10.72±3.50） （5.15～20.18）um;3個中位細胞雜色，棕色，中間細胞顏色略深；頂端細胞圓錐形，頂端附屬絲不分支，2～3條，長度為（41.40±6.70）（24.75～57.70）um（圖2f）。據此，初步判定JGGH8歸屬于新擬盤多毛孢屬Neopestalotiopsis sp。

2.4分子鑒定

擴增并測序獲得3個菌株的TEF、TUB、ITS基因序列，將所獲得的基因序列放入NCBI數據庫中，BLAST比對顯示，JGGH2和JGGH8的序列與N.saprophytica的TEF（KM199538）、TUB（KM199433）、ITS（MN635619）具有99.87%～100%的相似性，JGGH5的序列與N．asiatica的TEF（KX816892， 98.91%）、TUB（MN808590，99.10%）、ITS（ MN784702，100%）具有最高相似性。序列提交至GenBank，得到以下登錄號，JG-GH2：TEF（OP243457）、TUB（OP243458），ITS（OP223429）;JGGH5：TEF（OP243459）、TUB（OP243460）、ITS（OP223430）;JGGH8：

TEF（OP243455）、TUB（OP243456）、ITS（OP223431）.將3個基因拼接序列與鄰近種進行比對分析構建MEGA進化樹，結果顯示（圖3），JGGH2、JGGH8與腐生新擬盤多毛孢N. saprophytica聚為一支，JGGH5與亞洲新擬盤多毛孢N. asiatica聚為一支。結合形態學結果，將JGGH2、JGGH8鑒定為腐生新擬盤多毛孢N．saprophytica，JGGH5鑒定為亞洲新擬盤多毛孢N．asiatica。

3結論與討論

本研究鑒定出亞洲新擬盤多毛孢N. asiatica與腐生新擬盤多毛孢N. saprophytica為澳洲堅果干花病致病菌，這是世界范圍內由亞洲新擬盤多毛孢與腐生新擬盤多毛孢引起澳洲堅果干花病的首次報道。已發表的澳洲堅果干花病致病菌鑒定文章顯示，多種新擬盤多毛孢屬真菌可引起澳洲堅果干花病，且其報道的致病菌種類均不相同。這說明澳洲堅果干花病致病菌種類多樣，后續可繼續進行澳洲堅果干花病致病菌分離鑒定，以更多地了解其致病菌種類，為該病害的防治奠定基礎。