草地貪夜蛾病原白僵菌的分離鑒定及其致病力研究

鄒春華 劉繼輝 吳偉 徐勛志 謝秀菊

關(guān)鍵詞：草地貪夜蛾；球孢白僵茵；分離鑒定；致病力

草地貪夜蛾Spodoptera frugiperda （J.E．Smith），又名秋黏蟲(chóng)（fall armyworm），隸屬于鱗翅目Lepidoptera，夜蛾科Noctuidae，是一種原產(chǎn)于美洲熱帶和亞熱帶地區(qū)的雜食性害蟲(chóng)。因其寄主范圍寬，適生區(qū)域廣，增殖潛能強(qiáng)，擴(kuò)散速度快，突發(fā)為害重等特點(diǎn)，自2019年1月入侵我國(guó)云南省普洱市江城縣以來(lái)，已快速擴(kuò)散至27省（區(qū)、市），2020年全年發(fā)生面積達(dá)134.6萬(wàn)hm2，已成為我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的一種新的常發(fā)性重大害蟲(chóng)。入侵我國(guó)的草地貪夜蛾現(xiàn)已確認(rèn)為“玉米型”，其在幼蟲(chóng)期（1～6齡）均可取食為害，為害部位主要包括玉米的生長(zhǎng)點(diǎn)、葉片、雄穗和果穗等，嚴(yán)重影響玉米的產(chǎn)量和品質(zhì)。華南地區(qū)處于亞熱帶氣候，可周年種植玉米，為草地貪夜蛾周年繁殖提供了良好的條件，防控壓力巨大。

現(xiàn)階段，我國(guó)草地貪夜蛾防治仍以化學(xué)藥劑為主。農(nóng)業(yè)農(nóng)村部在2019年6月推薦的25種應(yīng)急防治藥劑中，化學(xué)殺蟲(chóng)劑有19種，比例達(dá)76%。但施用化學(xué)藥劑會(huì)產(chǎn)生抗藥性和環(huán)境污染問(wèn)題，而生物防治在生態(tài)環(huán)保、對(duì)人畜無(wú)害等方面的優(yōu)勢(shì)，是草地貪夜蛾防治的重要有益補(bǔ)充。目前，生物防治研究主要集中在捕食性天敵、寄生性天敵、昆蟲(chóng)核型多角體病毒和昆蟲(chóng)病原真菌等方面。其中，篩選對(duì)草地貪夜蛾特異性高和防治效果好的昆蟲(chóng)病原真菌，是草地貪夜蛾可持續(xù)防控工作的重要任務(wù)。國(guó)內(nèi)外已報(bào)道綠僵菌Metarhiziurn spp．和白僵菌Beau--oeria spp.等對(duì)草地貪夜蛾的低齡幼蟲(chóng)具有殺蟲(chóng)活性，而在非洲已有白僵菌產(chǎn)品登記用于防治草地貪夜蛾低齡幼蟲(chóng)。然而，昆蟲(chóng)病原真菌不同菌株對(duì)草地貪夜蛾的侵染致病作用不同，且在田間自然感染草地貪夜蛾的昆蟲(chóng)病原真菌還不多見(jiàn)。在國(guó)內(nèi)，鄭亞強(qiáng)等和雷妍圓等分別從云南曲靖和廣東廣州玉米田發(fā)現(xiàn)并分離鑒定了感染草地貪夜蛾幼蟲(chóng)的萊氏綠僵菌Metarhiziurn rileyi，程?hào)|美等和龐繼鑫等分別在廣東廣州和云南大理玉米田發(fā)現(xiàn)草地貪夜蛾僵蟲(chóng)并分離獲得了球孢白僵菌Beauverza bassiana，因此，開(kāi)展昆蟲(chóng)病原真菌資源收集及生防功能評(píng)價(jià)十分必要。

本研究從玉米植株上采集到自然罹病的草地貪夜蛾僵蟲(chóng)，分離得到一株菌株，通過(guò)形態(tài)學(xué)與核糖體DNA ITS序列分析，對(duì)該病原真菌進(jìn)行了鑒定，并測(cè)定了其對(duì)草地貪夜蛾2齡幼蟲(chóng)的致病活性，旨在為草地貪夜蛾生物防治提供菌種資源，同時(shí)也可為該菌株的生防潛力研究奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1蟲(chóng)生真菌分離培養(yǎng)

自廣東省廣州市南沙區(qū)某地塊（22°42＇51＂N，113°34＇19＂E）玉米植株上采集到自然罹病的草地貪夜蛾幼蟲(chóng)僵蟲(chóng)，將其在75%的乙醇中浸泡5s，之后用無(wú)菌水沖洗3次，最后將處理好的僵蟲(chóng)等分成3小段，呈等邊三角形放入含有PDA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，置于（25±1）℃、光周期L∥D=14h∥10h、光照強(qiáng)度3000lx的RQX-01型人工氣候箱中培養(yǎng)6d后，挑取菌落上少量孢子至新的培養(yǎng)基進(jìn)行純化培養(yǎng)，得到純菌株。

1.2菌落形態(tài)學(xué)觀察

將純菌株接種培養(yǎng)，觀察并記錄其菌落生長(zhǎng)情況及形態(tài)特征。采用光學(xué)顯微鏡（OLYMPUSCX31RTSF）及其配套的TUCSEN顯微成像系統(tǒng)觀察菌落菌絲形態(tài)、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)和分生孢子形態(tài)等，并拍照記錄，根據(jù)菌株形態(tài)進(jìn)行分類鑒定。

1.3菌株rDNA-ITS序列分析

用真菌基因組DNA提取試劑盒（廣州鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司提供）獲得菌株總DNA。采用真菌通用引物進(jìn)行菌株rDNA-ITS序列PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系50uL： I-52×High-Fidelity Master Mix 25uL，DNA模板1uL，上、下游引物各2uL（10umol/L），ddH20 20uL。擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5 min; 94℃30s，56℃ 30s，72℃ 90s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，送至廣州銳捷生物科技有限公司測(cè)序。將得到的DNA片段序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，確定該菌株的種屬關(guān)系。

1.4菌株致病活性測(cè)定

1.4.1孢子懸浮液的制備

菌株培養(yǎng)產(chǎn)孢后，用無(wú)菌刀片刮取菌落表面分生孢子到0.1%吐溫-80無(wú)菌水溶液的三角瓶中，在磁力攪拌器上充分?jǐn)嚢枋规咦泳鶆蚍稚⒃谌芤褐校醚蛴?jì)數(shù)板測(cè)定孢子濃度，并將孢子懸浮液調(diào)配成所需要的濃度。

1.4.2試蟲(chóng)感病觀察

采集用玉米植株飼養(yǎng)于養(yǎng)蟲(chóng)棚內(nèi)的活躍健康且大小基本一致的草地貪夜蛾2齡幼蟲(chóng)，用于回接感病觀察。將幼蟲(chóng)用1.00×108個(gè)/mL的孢子懸浮液浸泡15s后放在干凈的濾紙上自然晾干，再置于培養(yǎng)盒中，每天用新鮮玉米葉和果穗，于（25±1）℃、光周期L∥D=12h∥12h、光照強(qiáng)度3000lx的RQX-O1型人工氣候箱中飼養(yǎng)，觀察蟲(chóng)體的感染情況。測(cè)試20頭幼蟲(chóng)。

1.4.3菌株致病活性試驗(yàn)

用無(wú)菌蒸餾水制備5個(gè)濃度的孢子懸浮液，濃度分別為1.00×109、1.00×108、1.00×107、1.00×106、1.00×105個(gè)/mL。用浸蟲(chóng)法接種草地貪夜蛾2齡幼蟲(chóng)，以無(wú)菌蒸餾水處理為對(duì)照，共計(jì)6個(gè)處理。每個(gè)處理3次重復(fù)，每次重復(fù)30頭2齡幼蟲(chóng)，飼養(yǎng)方法同1.4.2。接種后從第2天開(kāi)始，每天定時(shí)觀察，記錄幼蟲(chóng)死亡數(shù)，連續(xù)觀察14d，對(duì)死亡幼蟲(chóng)進(jìn)行保濕觀察，蟲(chóng)體表面長(zhǎng)出白色菌絲或白色分生孢子的視為染菌致死。

1.5數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 22.0進(jìn)行處理分析，采用Probit方法求回歸方程及計(jì)算致死中濃度（LCso）和致死中時(shí)（LT50）。采用Tukey法對(duì)不同處理的累計(jì)死亡率進(jìn)行差異顯著性分析。

2結(jié)果與分析

2.1菌株形態(tài)特征

田間罹病的草地貪夜蛾幼蟲(chóng)僵蟲(chóng)發(fā)現(xiàn)于玉米穗頂端，罹病蟲(chóng)體呈白色（圖1a）。分離純化獲得病原真菌，編號(hào)為SfG01。將菌株SfG01接種于PDA培養(yǎng)基上，菌落呈白色，不規(guī)則圓形，中央微隆起，產(chǎn)孢后，表面呈淺灰色，培養(yǎng)7d菌落直徑2.6cm（圖1b），菌落背面呈淡黃色（圖1c）。分生孢子梗直立，著生于營(yíng)養(yǎng)菌絲頂端或其分枝上，分生孢子近球形或卵圓形，無(wú)色透明，大小為（2.0～5.8）um×（1.9～6．0）um（圖1d）。

2.2菌株rDNA-ITS序列分析

SfGO1菌株rDNA-ITS的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段經(jīng)測(cè)定，序列共509 bp。將該段序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì)，選取相關(guān)序列，并使用MEGA 11.0將相關(guān)序列下載，以Cordycep.s ningxi-aensis HMJAU 25074為外群，采用Neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)（圖2）。比對(duì)結(jié)果顯示，分離的菌株與球孢白僵菌菌株（登錄號(hào)NR_111594.1）屬于同一進(jìn)化分支，相似度高達(dá)99.20%。因此，綜合形態(tài)學(xué)分析和rDNA-ITS序列相似性分析，將該菌株確定為球孢白僵菌。

2.3幼蟲(chóng)感病癥狀

草地貪夜蛾2齡幼蟲(chóng)接種1.00×108個(gè)/mL的SfG01菌株孢子懸浮液后，第2～3天，蟲(chóng)體活動(dòng)正常，第4天開(kāi)始變得不活躍，并且拒食；第5天出現(xiàn)死亡，并且蟲(chóng)體表面顏色變黑和淺黃（圖3a）；第7天蟲(chóng)體頭部和背部開(kāi)始長(zhǎng)出白色菌絲（圖3b）；第10天長(zhǎng)出大量菌絲，并伴隨產(chǎn)生少量孢子，隨后孢子繼續(xù)增多（圖3c）；第14天蟲(chóng)體表面已布滿菌絲和孢子（圖3d）。說(shuō)明該菌株是草地貪夜蛾的致病菌。

2.4不同濃度SfG01孢子懸浮液對(duì)草地貪夜蛾的致病活性

隨著球孢白僵菌菌株SfG01孢子濃度的增加和處理時(shí)間的延長(zhǎng)，草地貪夜蛾2齡幼蟲(chóng)的累計(jì)死亡率不斷提高，接種后lld，濃度為1.00×109、1.00×108個(gè)/mL和1.00×107個(gè)/mL處理下幼蟲(chóng)的累計(jì)死亡率均達(dá)最高值，其中以最高濃度（1.00×109個(gè)/mL）處理后幼蟲(chóng)的累計(jì)死亡率最高，達(dá)86.67%（圖4）。

球孢白僵菌菌株SfGOI對(duì)草地貪夜蛾2齡幼蟲(chóng)的致病活性存在時(shí)間一劑量效應(yīng)，隨孢子懸浮液濃度的增加，LT50縮短；當(dāng)濃度由1.00×108升至1.00×109個(gè)/mL時(shí)，幼蟲(chóng)LTso從7.75 d降至6.50 d，而當(dāng)孢子濃度為1.00×107、1.00×106個(gè)/mL和1.00×105個(gè)/mL時(shí)，幼蟲(chóng)累計(jì)死亡率均低于50.00%，無(wú)法計(jì)算LT50值（表1）。

應(yīng)用Probit模型，得到菌株SfGOI對(duì)草地貪夜蛾2齡第11天的致病活性回歸方程PROBIT=-4.318+0.497x，第11天時(shí)的LC50為4.85×107個(gè)/mL，95%置信區(qū)間為1.39×107～8.42×107個(gè)/mL。

3結(jié)論與討論

國(guó)內(nèi)外關(guān)于蟲(chóng)生真菌防治害蟲(chóng)的研究很多，其中，最主要的包括白僵菌、綠僵菌等病原真菌。昆蟲(chóng)病原真菌要應(yīng)用于農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)防治，獲得優(yōu)良的菌株是重要前提。本研究從自然染病的草地貪夜蛾幼蟲(chóng)僵蟲(chóng)上分離純化得到1株昆蟲(chóng)病原真菌，用其不同濃度的孢子懸浮液侵染草地貪夜蛾2齡幼蟲(chóng)，高濃度（1.00×109個(gè)/mL）侵染時(shí)致死中時(shí)（LTso）為6.50d，致死率高達(dá)86.67%，第11天時(shí)的LC50為4.85×107個(gè)/mL，表現(xiàn)出較強(qiáng)的致病活性，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。在實(shí)際運(yùn)用中，單獨(dú)使用殺蟲(chóng)真菌制劑進(jìn)行防治，難以在短時(shí)間內(nèi)達(dá)到防控目的，應(yīng)進(jìn)一步研究其與化學(xué)農(nóng)藥的復(fù)配使用，以期達(dá)到速效減量增效的效果，為草地貪夜蛾的安全、持效控制提供支撐。

試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)SfG01菌株分生孢子懸浮液處理可以延緩草地貪夜蛾幼蟲(chóng)的發(fā)育，引起草地貪夜蛾蛹的黑化并影響其羽化，這與彭國(guó)雄等關(guān)于球孢白僵菌（菌株編號(hào)ZJU435）和金龜子綠僵菌（菌株編號(hào)CQMa421）對(duì)草地貪夜蛾、馬濤等關(guān)于白僵菌對(duì)灰茶尺蠖Ectropis grisescens的研究結(jié)果相似。此外，龐繼鑫等發(fā)現(xiàn)球孢白僵菌（菌株編號(hào)SHL-2020）對(duì)草地貪夜蛾雌、雄成蟲(chóng)均具有較強(qiáng)的侵染致病作用，因此，進(jìn)一步研究球孢白僵菌SfG01菌株對(duì)草地貪夜蛾生長(zhǎng)發(fā)育及求偶、交配和產(chǎn)卵等行為的影響，進(jìn)而探究其對(duì)草地貪夜蛾種群的控制力，對(duì)將來(lái)在實(shí)際中進(jìn)行應(yīng)用意義重大。