氧酰基載體蛋白還原酶基因FgOAR1對禾谷鐮孢生長、發育和致病的影響

宮安東，雷銀玉，吳楠楠，劉景榕，宋夢鴿，張藝美，楊光，楊鵬

氧酰基載體蛋白還原酶基因對禾谷鐮孢生長、發育和致病的影響

宮安東，雷銀玉，吳楠楠，劉景榕，宋夢鴿，張藝美，楊光，楊鵬

信陽師范大學生命科學學院，河南信陽 464000

【背景】禾谷鐮孢（）是引起小麥赤霉病（Fusarium head blight）的主要病原真菌，侵染后導致作物品質和產量下降，同時產生多種真菌毒素，嚴重危害糧食生產和人類健康。氧酰基載體蛋白還原酶（3-oxoacyl ACP reductase，OAR1）催化羧酰基載體蛋白還原成氧酰基載體蛋白，在脂肪酸的生物合成過程中具有重要作用。【目的】構建基因缺失突變體，研究其表型、顯微結構、孢子產量、有性生殖和致病力等的變化，探究的生物學功能，揭示其對禾谷鐮孢生長、發育和致病的影響，為新型抑菌作用靶點的篩選及小麥赤霉病的防控提供科學依據。【方法】以禾谷鐮孢野生型菌株PH-1為材料，應用Split-Marker基因敲除技術，構建基因缺失突變體（Δ），Gap-repair技術獲得缺失基因的回補突變體（Δ-C）；將PH-1、Δ和Δ-C菌株分別接種到常規培養基，觀察菌落表型變化并測定脂肪酸含量差異；接種到含剛果紅（Congo-Red）、SDS、NaCl和H2O2的壓力篩選培養基中，觀察菌絲在壓力培養條件下的生長狀況；接種CMC培養基，比較分生孢子產量差異；接種胡蘿卜培養基，觀察有性生殖及孢子性狀；分別進行小麥胚芽鞘和穗部接種，統計發病率和毒素產量，比較突變體與野生型菌株的致病力差異。【結果】與野生型PH-1菌株相比，在PDA、YEG和CM培養基中Δ突變體未呈現明顯表型變化，在0.7 mol·L-1NaCl、0.03% H2O2、0.01% SDS和300 μg·mL-1Congo-Red等壓力培養條件下，突變體菌落直徑顯著低于野生型PH-1，表明與禾谷鐮孢細胞膜和細胞壁的合成相關；Δ突變體在液體培養基中的分生孢子產量（8.1×105個/mL）顯著低于PH-1（1.26×106個/mL），接種小麥胚芽鞘和麥穗后，Δ突變體的致病力顯著低于野生型菌株PH-1。【結論】禾谷鐮孢中參與脂肪酸的生物合成，對細胞膜合成具有重要作用，該基因缺失導致突變體抗逆性降低，分生孢子產量下降，且致病力顯著降低，對禾谷鐮孢的生長、發育和致病具有重要作用。

禾谷鐮孢；小麥赤霉病；基因敲除；；致病力

0 引言

【研究意義】由禾谷鐮孢（）侵染引起的小麥赤霉病（Fusarium head blight，FHB）是一種危害嚴重的真菌病害[1-3]，在全球范圍內普遍存在[4]。在我國，赤霉病的暴發區主要集中在長江中下游地區，近年來，隨著氣候變暖，赤霉病呈現出向北蔓延的趨勢[5]。此外，禾谷鐮孢還產生多種鐮孢菌毒素，對人體危害嚴重[6]。目前，針對小麥赤霉病的防治主要依靠化學殺菌劑，但殺菌劑的大量使用對環境造成一定影響，并引起病原菌耐藥性的增強[7]。因此，開發新型、高效抑菌劑是病害防控的重要任務[8]。開展基因功能研究，明確基因在病原菌侵染和致病過程中的生物學功能，將有助于鑒定核心作用位點，對抑菌劑的研發和赤霉病防控具有重要意義。【前人研究進展】脂肪酸是細胞膜的重要組成成分，對磷脂、脂多糖和脂蛋白的形成至關重要[9]，同時，對病原真菌的生長、發育和致病具有重要作用。已有研究表明，稻瘟病菌（）中超長鏈脂肪酸的合成可影響侵入釘的形成，當超長鏈脂肪酸的合成受抑制后，侵入釘的形成受阻，病原菌致病力降低。HE等篩選到一種可抑制超長碳鏈脂肪酸合成酶活性的化合物，并抑制侵染釘的形成和病原菌的侵染，為真菌病害的防治提供新材料[10]。禾谷鐮孢中脂肪酸的生物合成由脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，FAS）催化[11]，該酶由分布在兩條鏈上的6個酶活性中心及一個酰基載體蛋白（acetyl carrier protein，ACP）組成，以乙酰輔酶A為底物，經酰基轉移酶催化生成乙酰ACP，與丙二酸單酰ACP結合，歷經縮合、還原、脫水、還原4步反應，生成丁酰乙酰ACP，重復上述4步反應，每重復一次增加2個碳單位，經多輪循環后合成長鏈脂肪酸，用于脂蛋白和細胞膜等的生成。編碼氧酰基載體蛋白還原酶，又稱-酮脂酰-ACP還原酶，參與脂肪酸生物合成的第二次“還原”反應，以NADPH為輔因子，將乙酰乙酰ACP還原成-羥丁酰ACP，在脂肪酸的生物合成過程中具有重要作用。鮑曼不動桿菌（）中發現一種高分子量OAR1酶，在營養豐富的條件下，該酶可維持細菌的生長、運動和膜合成，當基因缺失后，突變體在富營養培養基中的生長受抑制，因此對鮑曼不動桿菌的生長和發育具有重要作用[12]。在野油菜黃單胞菌（pv.）中發現2個氧酰基載體蛋白還原酶，分別為Fab G1和Fab G3，Fab G1是脂肪酸生物合成與細菌生長所必需的，該基因缺失會導致細菌死亡；Fab G3缺失后，未影響脂肪酸合成和細菌生長，但影響次級代謝產物菌黃素的產生，菌黃素可保護病原菌免受光氧化損傷，突變體無法合成菌黃素，細胞的光氧化損傷增大，導致病原菌毒力降低[13]。釀酒酵母（）中敲除后，突變體在以甘油為唯一碳源的培養基上無法正常生長，且線粒體呼吸減弱，表明缺失導致脂肪酸合成受阻，無法與甘油分子合成脂類物質，導致細胞生長受阻[14]。【本研究切入點】在植物病原真菌中，針對的生物學功能，以及該基因對真菌生長、發育和致病的影響等，尚未有研究揭示。【擬解決的關鍵問題】以禾谷鐮孢野生型菌株PH-1為研究對象，構建基因缺失突變體，分析突變體在表型、顯微結構、壓力培養、無性生殖、有性生殖和致病力等方面與野生型菌株的差異，探究在禾谷鐮孢生長、發育和致病過程中的重要作用，為新型抑菌劑的研發以及赤霉病防控提供新的作用靶點。

1 材料與方法

試驗于2019年6月至2022年3月在信陽師范大學生命科學學院應用與環境微生物學實驗室完成。

1.1 材料

1.1.1 質粒、菌株 含有潮霉素抗性基因的pCB1003質粒；含有G418、氨芐青霉素抗性、I酶切位點的pFL2質粒；禾谷鐮孢野生型菌株PH-1（NRRL 31084）、Δ突變體、Δ-C回補突變體；大腸桿菌菌株DH5；色氨酸缺陷酵母菌株XK1-25。均由本實驗室保存。

1.1.2 試劑、酶及培養基 幾丁質酶、崩潰酶、溶菌酶購于Sigma公司（Sigma-Aldrich，St Louis，MO）；r-Taq DNA聚合酶、dNTPs、PCR Buffer、2×Taq Mix等購于大連寶生物公司；I限制性內切酶（Thermo Fisher Scientific，Cleveland，OH，USA）。

PDA培養基（馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，ddH2O定容至1 L）用于真菌培養；CM培養基（葡萄糖3 g，蛋白胨0.6 g，酵母提取物0.3 g，酸水解酪蛋白0.3 g，NaNO31.8 g，KCl 0.15 g，MgSO40.15 g，KH2PO40.45 g，瓊脂4.5 g，ddH2O定容至300 mL）用于禾谷鐮孢的脅迫試驗；CMC培養基（羧甲基纖維素鈉6 g，酵母提取物0.4 g，KH2PO40.4 g，NH4NO30.4 g，MgSO40.1 g，ddH2O定容至400 mL）用于禾谷鐮孢分生孢子制備；胡蘿卜培養基（胡蘿卜40 g，瓊脂粉4 g，ddH2O定容至200 mL）用于有性生殖試驗。

1.1.3 引物設計 在Ensemble Fungi真菌數據庫（http://fungi.ensembl.org/index.html）下載編碼序列，并保留及其上下游2 000 bp堿基序列，根據目的基因序列及潮霉素磷酸轉移酶基因（）序列，利用primer 5.0軟件，設計基因敲除引物、回補突變體構建引物和檢測引物，所有引物由天一華煜基因科技有限公司合成，引物序列見表1。

1.2 方法

1.2.1的同源性比對 在NCBI和Ensembl Fungi數據庫以禾谷鐮孢基因組為研究對象，檢索OAR1氨基酸編碼序列，將所得序列在NCBI-BLAST中進行序列同源性比對，得到不同病原真菌中OAR1氨基酸序列。挑選不同病原真菌OAR1氨基酸序列在Clustal W軟件中進行多重序列比對處理，在GENEDOC軟件繪制多重序列圖譜。

1.2.2基因敲除突變體和回補突變體的構建 運用同源重組基因敲除法構建Δ突變體，以PH-1基因組DNA為模板，以成對引物FgOAR1_1F/2R及FgOAR1_3F/4R分別特異性擴增目的基因的上、下游同源片段a和b；以pCB1003質粒DNA為模板，以HYG/F和HY/R及YG/F和HYG/R為引物特異性擴增的H1和H2片段。a和H1片段，b和H2片段進行overlap-PCR得到融合片段aH1和bH2，瓊脂糖凝膠電泳檢測條帶大小。aH1和bH2融合片段用于原生質體的轉化。

回補載體正向引物OAR1_hbF位于目的基因自身啟動子的上游，反向引物OAR1_hbR在目的基因終止密碼子前20個堿基左右位置上，不包含OAR1基因編碼區的終止密碼子。分別在互補引物FgOAR1_hb/F和FgOAR1_hb/R的5′端增加36 bp的PFL2同源片段，以PH-1基因組DNA為模板，特異性擴增互補片段，將互補片段與I酶切線性化后的pFL2載體，在酵母細胞內進行同源重組，構建回補載體，使用檢測引物insert_F/R進行PCR檢測，PCR產物送天一華煜基因科技有限公司進行測序。

1.2.3 菌株的壓力篩選 將PH-1、Δ突變體和Δ-C回補突變體菌株接種到PDA培養基上培養3 d，用0.5 cm打孔器在菌絲邊緣打孔，并接種在終濃度分別為0.7 mol·L-1NaCl、0.03% H2O2、0.01% SDS和300 μg·mL-1剛果紅的CM培養基上進行壓力篩選[15-17]，每處理3個重復，25 ℃培養箱培養3 d，用十字交叉法測量菌落直徑，并拍照記錄。

表1 本試驗所用引物序列

1.2.4 分生孢子萌發與有性生殖 為檢測無性孢子的產生與萌發狀況，將PH-1、Δ和Δ-C接種PDA培養基培養3 d，用打孔器打取含新鮮菌絲的菌餅，接種在50 mL CMC培養基中，振蕩搖培5 d，用無菌尼龍濾布過濾收集分生孢子，接種相同濃度的孢子液于50 mL的YEPD培養基中，25 ℃和175 r/min搖培8 h后，顯微鏡觀察各菌株分生孢子的萌發情況。試驗重復3次，每處理統計30個孢子，計算孢子萌發率，以及萌發產生的芽管長度，并比較3個菌株間的差異。

為檢測突變體的有性生殖情況，將活化的PH-1、Δ和Δ-C菌絲塊接種于胡蘿卜培養基上，25 ℃培養6 d；待菌絲長滿培養皿后加入1 mL 0.1%的Tween 20，用無菌藥匙壓倒菌絲使其融合，放在25 ℃培養箱黑暗處理（黑暗12 h，黑光燈12 h），培養8 d觀察子囊殼的產生，解剖鏡下觀察子囊孢子的釋放。

1.2.5 脂肪酸含量測定 將新鮮的PH-1、Δ突變體孢子液（1×105個/mL）分別涂布PDA培養基，培養4 d后收集表面菌絲，用于脂肪酸的提取[18]。菌絲研磨處理，分別取100 mg置于玻璃瓶中，加入1.5 mL溶解液（氯仿﹕甲醇=2﹕1，v/v），渦旋處理10 min，4 ℃和12 000 r/min條件下離心10 min，靜置后取1 mL上清液于新的玻璃管中，加入0.2 mL KCl（0.75%，w/v），渦旋10 min后靜置分層，取下層液體400 μL于新的玻璃管中，加入2 mL濃縮硫酸和甲醇混合液（5/95，v/v），95 ℃酯化處理1.5 h。向反應體系中加入1 mL超純水和1 mL正己烷，混勻后靜置10 min分層。取上層提取液進行脂肪酸測定。

1.2.6 菌株的致病力和產毒分析小麥苗期胚芽鞘接種和花期麥穗接種均選用赤霉病高感小麥品種安農8455。選取大小均勻一致的小麥籽粒，種子進行表面消毒，于25 ℃保濕催芽3 d，待胚芽鞘長出3 cm左右，剪去胚芽鞘尖端造成斜面損傷。收集不同菌株的分生孢子，調整孢子液濃度至1×105個/mL，將2.5 μL分生孢子懸液接種至胚芽鞘尖端，每處理12個重復，相對濕度保持在80%，25 ℃黑暗培養24 h后，每天光照處理12 h，繼續培養7 d，測量小麥基部褐色病斑長度。試驗重復3次，每組10個處理，統計每株幼苗病斑長度后取平均值進行比對。

收集分生孢子，調整濃度至1×105個/mL，將10 μL分生孢子懸液接種至揚花期麥穗中部小花，套袋保濕。每處理12個重復，14 d后統計發病情況，記錄發病麥穗數量，計算病穗率（發病麥穗數/接種總麥穗數）；統計接種小穗中發病小花數量，計算發病率（發病小花數/每穗總小花數）。

小麥成熟后，收集發病麥穗并剝離籽粒，分別研磨成粉末，進行毒素測定。每組取1 g粉末樣品，加入4 mL提取液（乙腈/水=84/16，v/v），充分混勻后靜置10 min，取上清，重復進行二次抽提，混合上清液，濃縮后重溶于1 ml甲醇中，進行DON毒素測定[19]。每處理重復3次，取平均值，比較突變體與野生型菌株產毒差異。

1.2.7 不同侵染階段的基因表達分析 為了解在禾谷鐮孢不同生長、侵染階段的表達情況，查閱已發表的轉錄組測序結果，比對禾谷鐮孢在YEPD培養基中生長12、24、36、48 h的表達量，以及接種小麥穗部24、48、72 h的基因表達量，分析在不同階段的表達差異。

1.2.8 統計學分析 采用SPSS17.0軟件對試驗數據進行統計分析，統計結果為2—3次重復數據的平均值，采用獨立性T檢驗進行方差分析，計算標準差并分析差異顯著性（＜0.05）。

2 結果

2.1 FgOAR1預測

在NCBI禾谷鐮孢數據庫和Ensembl Fungi數據庫中進行BLAST氨基酸序列分析，篩選到一個，ID為FGSG_03438。生物信息學分析顯示，該基因不含內含子、信號肽和跨膜區，CDS編碼區長839 bp。對禾谷鐮孢、稻瘟病菌、黃曲霉（）和釀酒酵母中該酶的氨基酸序列進行同源性比對，結果顯示OAR1蛋白氨基酸序列長度在不同真菌中相對穩定（263—278 AA），且氨基酸組成存在多個高度保守區（圖1）。

Fg：禾谷鐮孢F. graminearum；Af：黃曲霉A. flavus；Mg：稻瘟病菌M. oryzae；Sc：釀酒酵母S. cerevisiae

2.2 FgOAR1基因敲除和回補

運用同源重組基因敲除法構建Δ突變體。以PH-1基因組DNA為模板，擴增的上游同源片段a，長度為701 bp，下游同源片段b，長度為695 bp，以pCB1003質粒DNA為模板，擴增潮霉素編碼基因前段H1片段，長度為764 bp，后段H2片段，長度為930 bp。a和H1片段，b和H2片段進行overlap-PCR擴增，得到aH1長度1 464 bp，bH2長度為1 625 bp，瓊脂糖凝膠電泳檢測目的條帶大小，與理論值一致（圖2-A），表明基因敲除載體構建成功。

同源片段轉化PH-1原生質體獲得轉化子，用4對引物檢測陽性轉化子，FgOAR1_5F/6R引物擴增目的基因編碼區，無陽性條帶，表明轉化子中目的基因已被替換，h850/h852引物擴增aH1與bH2的overlap融合區，檢測條帶大小為750 bp，表明轉化子中兩個片段成功融合；引物FgOAR1_7F/h855R和h856F/ FgOAR1_8R分別擴增上游同源區與潮霉素編碼基因的overlap融合區，潮霉素編碼基因與下游同源片段的overlap融合區，片段大小分別為1 038和1 042 bp，表明潮霉素成功插入上下游同源片段之間，實現目的基因替換，擴增目的條帶大小與理論值符合（圖2-B），突變體構建成功。

同時，以PH-1基因組為模板，引物FgOAR1_hbF/ R擴增目的基因全長1 643 bp，利用Gap repair方法進行回補載體構建，引物insert_F/R和FgOAR1_5F/6R進行PCR驗證，擴增目的片段長度1 915和614 bp，符合試驗預期（圖2-C）。擴增產物純化后，送公司測序，測序結果與原序列一致，沒有突變，表明回補載體構建成功。回補載體轉化突變體原生質體，構建回補突變株Δ-C，提取基因組DNA，進行PCR鑒定，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測條帶大小與理論值一致（圖2-D）。

A：FgOAR1基因敲除載體構建Construction the FgOAR1 gene deletion vector。M：Marker 5000；a：FgOAR1上游同源片段FgOAR1 upstream homologous fragment (701 bp)；b：FgOAR1下游同源片段FgOAR1 downstream homologous fragment (695 bp)；H1：hph抗性基因上端The upper end of the hph resistance gene (764 bp)；H2：hph抗性基因下端The lower end of the hph resistance gene (930 bp)；aH1：a片段和H1片段進行Overlap的產物Overlap of a fragment and H1 fragment (1464 bp)；bH2：b片段和H2片段Overlap后的產物Overlap of b fragment and H2 fragment (1625 bp)。B：轉化子的PCR檢測PCR detection of transformants。M：Marker 5000；CK：假陽性轉化子false positive transformants；1：引物h850/h852擴增條帶Amplification band of primer h850/h852 (750 bp)；2：引物FgOAR1_5F/6R擴增，無條帶Amplification of primer FgOAR1_5F/6R, no band；3：引物FgOAR1_7F/h855R擴增條帶Amplification band of primer FgOAR1_7F/h855R (1038 bp)；4：引物h856F/FgOAR1_8R擴增條帶Amplification band of primer h856F/FgOAR1_8R (1042 bp)。C：回補片段擴增與連接Amplification of complementary fragment。M：Marker 2000，1：引物insert_F/R擴增片段Amplification band of primer insert_F/R (1915 bp)；2：引物FgOAR1_5F/6R擴增片段Amplification band of primer FgOAR1_5F/6R (614 bp)。D：回補突變體的鑒定PCR identification of complementary mutant。M：Marker 5000；1：引物h850/h852擴增片段Amplification band of primer h850/h852 (750 bp)；2：引物FgOAR1_hbF/R擴增片段Amplification band of primer FgOAR1_hbF/R (1643 bp)

2.3 菌落形態以及生長速度的測定

在PDA、5×YEG、CM基礎培養基上接種PH-1、Δ和Δ-C菌株，培養3 d后，Δ與PH-1菌株相比菌落形態、菌落邊緣、氣生菌絲的疏密程度以及色素產生情況均無明顯差異（圖3）。檢測菌落生長直徑，計算生長速率顯示，野生型菌株PH-1在PDA培養基上的生長速率最快，為1.20 cm·d-1，Δ的生長速率為1.19 cm·d-1，與PH-1相比，無顯著差異（表2）。此外，PH-1菌株與突變體在5×YEG和CM培養基上生長速率相近，未呈現顯著差異。表明在基本培養基中，對禾谷鐮孢的生長無顯著影響。

2.4 菌株在不同壓力脅迫培養條件下的生長測定

在含有0.7 mol·L-1NaCl、0.03% H2O2、0.01% SDS和300 μg·mL-1Congo-Red的CM平板上分別接種PH-1、Δ和Δ-C，培養后觀察菌絲形態。結果顯示在0.7 mol·L-1NaCl脅迫條件下，PH-1生長速率為0.98 cm·d-1，Δ的生長速率0.62cm·d-1，比PH-1菌株降低36.7%，差異顯著；在300 μg·mL-1Congo-Red和0.01% SDS壓力脅迫下，Δ的菌絲生長速率分別為0.81和0.37 cm·d-1，PH-1的菌絲生長速率分別為1.15和0.54 cm·d-1，Δ相比PH-1分別顯著降低29.6%和31.5%；在0.03% H2O2脅迫下，Δ的生長速率相比PH-1也顯著降低20.0%（表3）。在4種壓力脅迫條件下，突變體菌絲的生長速率顯著低于野生型菌株，表明在不同壓力培養條件下，具有更強的生物功能，可促進脅迫條件下菌絲的生長和發育（圖4）。

圖3 PH-1、ΔFgOAR1和ΔFgOAR1-C菌株的菌落形態

表2 3個菌株的生長速率測定

圖4 PH-1、ΔFgOAR1及ΔFgOAR1-C菌株在不同脅迫條件下的菌落形態

表3 PH-1、ΔFgOAR1和ΔFgOAR1-C菌株在不同脅迫下的生長速率

*：差異顯著Significant difference (＜0.05)。下同The same as below

2.5 脂肪酸含量測定

在禾谷鐮孢pH-1和Δ菌株中，均檢出4種類型的脂肪酸，分別為十六烷酸（軟脂酸）、十八烷酸（硬脂酸）、順-9-十八碳一烯酸甲酯（油酸）、十八二烯酸（亞油酸），其中以亞油酸的相對含量最為豐富，達到43.34%，硬脂酸最少，為3.82%，軟脂酸（11.78%）和油酸（14.87%）居于二者之間。Δ與pH-1菌株相比，4種脂肪酸的含量均無顯著差異（圖5），表明在基礎培養基培養過程中，對脂肪酸的合成無明顯影響。

2.6 FgOAR1對分生孢子產生和萌發的影響

CMC培養基中培養pH-1、Δ和Δ-C進行分生孢子定量分析，發現Δ、pH-1和Δ-C分生孢子濃度分別為0.81×106、1.26×106和1.15×106個/mL，與pH-1相比，Δ產孢量顯著降低（圖6-A），表明在分生孢子的形成過程中具有重要作用。

pH-1、Δ和Δ-C的分生孢子均為鐮刀狀，孢子形態均勻，每個孢子有5—7個隔膜，孢子表型無明顯差異。孢子萌發后顯微觀察萌發狀態，3個菌株孢子萌發率均高于95%，無顯著差異。進一步測定孢子萌發8 h后形成的菌絲長度，PH-1產生菌絲的平均長度為362 μm，與突變體（353 μm）相比，二者無顯著差異（圖6-B）。缺失導致禾谷鐮孢無性生殖過程分生孢子產量顯著降低，但孢子形態和萌發狀況無明顯變化，表明該基因在孢子的生成過程中具有重要作用。

C16:0：十六烷酸（軟脂酸）hexadecyclic acid；C18:0，十八烷酸（硬脂酸）octadecanoic acid；C18:1n9c：順-9-十八碳一烯酸甲酯（油酸）octadecenoic acid；C18:2n6c：十八二烯酸（亞油酸）octadecadienoic acid

標尺bar =200 μm

2.7 突變體的有性生殖

黑光燈誘導培養8 d后，Δ可產生黑色顆粒狀的子囊殼，且子囊殼的大小、形態和數量與PH-1菌株無明顯差異。子囊殼成熟后，頂端可見噴發的子囊孢子。壓開子囊殼，呈現花簇狀子囊，每個子囊內含8個子囊孢子，子囊孢子一般含3個隔膜、4個細胞，Δ產生的子囊及子囊孢子數量與pH-1相比無明顯變化（圖7）。因此，對禾谷鐮孢有性生殖過程中子囊殼、子囊孢子的釋放以及子囊孢子形成無影響。

圖7 PH-1、ΔFgOAR1及ΔFgOAR1-C菌株的有性生殖

2.8 FgOAR1在侵染過程中的作用

新鮮孢子接種小麥胚芽鞘7 d后，觀察發病情況。PH-1侵染小麥胚芽鞘發病嚴重，病斑長度為5.5 cm，Δ也可侵染，但發病較輕，病斑長度為1.5 cm，Δ-C發病狀況與PH-1相近，病斑長度5.0 cm，表明在小麥苗期生長階段，缺失導致禾谷鐮孢致病力降低（圖8-A、8-B）。

在小麥揚花期進行穗部接種，PH-1和Δ均可侵染麥穗，導致小麥發病，二者病穗率均為100%。從致病程度而言，PH-1發病嚴重，接種后更多小花被侵染，小花發病率98.6%。但Δ發病率僅為38.6%（圖8-C、8-D）。表明缺失后，禾谷鐮孢對成株期小麥致病力顯著降低。小麥籽粒成熟后進行毒素測定，結果顯示接種PH-1和Δ的小麥DON毒素含量分別為431.03和421.05 μg·kg-1，二者無顯著差異，表明在侵染小麥過程中，缺失對毒素的產生無影響。

A：小麥胚芽鞘的侵染發病The infection on wheat coleoptile；B：病斑長度Spot length；C：對麥穗的侵染The infection on wheat spikelet；D：發病率統計Incidence statistics

2.9 FgOAR1在不同階段的表達

在菌絲生長階段和侵染小麥階段的表達量明顯不同[20-21]。在無脅迫培養基培養條件下，禾谷鐮孢菌絲中的表達量很低，TPM（Transcript per Kilobase per Million mapped reads）均低于1，在36 h時達到最大值0.46。當接種到麥穗后，的表達量明顯增高，接種48 h時TPM值為115.93，隨侵染時間的延長，表達量也逐漸升高，到72 h時TPM值最高達141.18（圖9）。表明在禾谷鐮孢侵染小麥過程中，的表達受到誘導，表達量始終維持在高水平。

Hyphae 12 h, 24 h, 36 h, 48 h：PH-1接種到YEPD培養基上培養12、24、36、48 h時FgOAR1的表達量The expression level of FgOAR1 of PH-1 cultured in YEPD medium for 12, 24, 36, 48 h, respectively；Wheat 24 h, 48 h, 72 h：PH-1接種小麥麥穗24、48、72 h時FgOAR1的表達量The expression level of FgOAR1 of PH-1 inoculated on wheat spikelet for 24, 48, 72 h, respectively

3 討論

3.1 脂肪酸的合成對禾谷鐮孢生長具有重要作用

禾谷鐮孢是一種兼性寄生菌，可侵染小麥、玉米、大麥、水稻、燕麥等多種禾谷類作物，造成嚴重的經濟損失[22]。禾谷鐮孢的侵染和致病受到眾多基因調控，許多基因已被證明對禾谷鐮孢的侵染和致病具有重要作用，其編碼蛋白也被認定為赤霉病防控的潛在靶位點[23-24]。脂肪酸是真菌細胞中磷脂、脂多糖和脂蛋白的重要組成部分，對細胞膜的形成、病原真菌的生長、發育和致病等具有重要作用。本研究對禾谷鐮孢脂肪酸合成途徑的氧酰基載體蛋白還原酶OAR1開展研究，構建缺失突變體與回補突變體，揭示該基因對禾谷鐮孢生長、發育和致病的影響，明確其生物學功能，可為新型抑菌劑的研發及作用靶點的篩選提供理論依據。

3.2 在脅迫條件下，FgOAR1對禾谷鐮孢的生長具有更強的促進作用

Δ突變體菌株在常規PDA、CM、YEG培養基上，菌絲直徑、生長速率與野生型菌株無顯著差異，表明在常規培養條件下，缺失后，對菌絲的生長無影響。在禾谷鐮孢的基因組中，存在7個同源基因，基因編號分別為FGSG_03438、FGSG_03838、FGSG_09169、FGSG_11198、FGSG_ 04045、FGSG_06029、FGSG_06455，對所有基因均進行敲除，發現前4個基因為微效基因，缺失后對禾谷鐮孢生長和侵染的影響較小，后3個基因為主效基因（致死基因），缺失后禾谷鐮孢無法生長。因此，禾谷鐮孢脂肪酸合成途徑中，氧酰基載體蛋白還原酶存在多個同源基因，本研究敲除的（FGSG_03438）為微效基因，該基因缺失后，其同源基因存在功能補償，故常規培養條件下無表型變化。

與常規培養下的無表型變化相比，Δ突變體菌株在NaCl、H2O2、SDS和Congo-Red壓力脅迫條件下，菌絲生長速率顯著低于野生型菌株。在脅迫因子的影響下，同源基因的補償作用不足，可能發揮更為重要的作用，故該基因缺失后，突變體菌株生長速率顯著降低。SDS是一種陰離子表面活性劑，可以干擾細胞膜的生物合成[25]，當敲除后，突變體對SDS的響應更敏感，細胞膜形成受抑制，菌絲生長減慢，生長速率顯著低于野生型。參與的脂肪酸合成與細胞膜形成直接相關，缺失影響細胞膜的合成，而細胞膜表面含有多種蛋白酶和調控因子，細胞膜的合成受阻對禾谷鐮孢的生長發育各方面均產生影響。禾谷鐮孢細胞壁的主要組成成分是幾丁質[26]，其生物合成必須依賴于細胞膜，當細胞膜合成受阻后，也導致突變體在Congo-Red（幾丁質合成抑制劑，破壞細胞壁完整性）[27-30]的脅迫下，菌絲的生長速度顯著降低。同時，細胞膜的合成受抑制，也引起細胞對氧化應激和滲透壓的響應性降低，因此突變體菌株在H2O2、NaCl的協迫作用下[31]，生長速率也顯著低于野生型菌株。

3.3 FgOAR1對禾谷鐮孢的侵染和致病具有重要作用

在禾谷鐮孢侵染小麥試驗中，突變體菌株的致病力顯著低于野生型菌株，表明在禾谷鐮孢的侵染和致病過程中也發揮重要作用。在病原菌侵染植物過程中，病原菌與植物間存在復雜的互作機制，植物通過自身的免疫防御系統，能夠識別病原菌的入侵，激活防御系統，抵御病原菌的侵染和危害[32]，而植物的防御反應對于病原菌而言，同樣是一種脅迫刺激。在脅迫因子的作用下，被激活，發揮更重要的作用。因此當敲除時，禾谷鐮孢對脅迫刺激的響應喪失，無法發揮作用，禾谷鐮孢侵染能力減弱導致致病力顯著降低。在禾谷鐮孢侵染小麥過程中，的表達量受誘導后顯著提高，在禾谷鐮孢的侵染和致病過程中具有重要作用，因此缺失后，突變體的致病力顯著降低。后續將進一步借助多組學分析技術，探究的具體功能，進一步揭示禾谷鐮孢響應逆境脅迫誘導的分子機制。

4 結論

參與脂肪酸的生物合成，對菌絲細胞膜的形成具有重要作用。該基因在脅迫因子誘導條件下能發揮更重要的作用，有利于脅迫條件下禾谷鐮孢的菌絲生長，以及侵染小麥過程中致病力的提升。綜上，對禾谷鐮孢的生長、發育和致病具有重要影響，可作為潛在的赤霉病防控靶點，用于新型抑菌劑的研發。

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The effect of 3-oxyacyl ACP reductase geneon the growth, development and pathogenicity of

GONG AnDong, LEI YinYu, WU NanNan, LIU JingRong, SONG MengGe, ZHANG YiMei, YANG Guang, YANG Peng

College of Life and Science, Xinyang Normal University, Xinyang 464000, Henan

【Background】is the main pathogenic fungus which can infect wheat and result in Fusarium head blight. The infection ofleads to huge reduction in crop quality and yield, and produces different types of mycotoxins that endanger grain production and human health. 3-oxoacyl ACP reductase (OAR1), catalyzing carboxyacyl carrier protein to oxyacyl carrier protein, which plays an important role in the fatty acid biosynthesis of【Objective】To reveal the biological functionof, thedeletion mutants were constructed. The phenotype, cell structure, conidia concentration, sexual reproduction and pathogenicity of mutant were analyzed and compared with wild-type strain PH-1. The results will uncover the function of, and provide scientific evidences for the identification of novel antifungal target and control of Fusarium head blight.【Method】Wild-type strainPH-1 was used as material in this study. Split-Marker gene knockout technology was conducted to construct the Δmutants. The Δ-C reverting strain was obtained by the Gap-repair method. All strains were individually inoculated in common media (PDA, CM, YPG), and the stress selection medium containing Congo-Red, SDS, NaCl and H2O2, respectively. The mycelium phenotypes and fatty acid content were recorded. The strains were inoculated in CMC medium to analyze the conidia concentration. The carrot culture-medium was used to analyze the sexual reproduction of each strain. All strains were individually inoculated to the wheat coleoptile and spikelet to analyze the pathogenicity and mycotoxin content, respectively. The disease incidence of mutant strains was calculated and compared with PH-1 strain.【Result】Compared with the wild-type strain PH-1, the growth of Δmutant showed no difference in PDA, YEG and CM media. Whereas, under the pressure of 0.7 mol·L-1NaCl, 0.03% H2O2, 0.01% SDS and 300 μg·mL-1Congo-Red, the growth of Δmutant was significantly reduced compared with PH-1. The evidence demonstrated thatis related to the cell membrane and cell wall formation in. In CMC medium, the conidia concentration of Δmutant (8.1×105conidia/mL) was less than PH-1 (1.26×106conidia/mL) with significant difference; The pathogenicity analysis further demonstrated that the disease incidence of Δmutant was significantly lower than PH-1 in wheat coleoptile and spikelet inoculation tests.【Conclusion】participates in the fatty acid biosynthesis, and plays an important role in cell membrane formation of. The deletion ofresulted in the reduced resistance to pressures, decreased conidia production and pathogenicity. Therefore,is important for the growth, development and pathogenicity process of.

; Fusarium head blight; gene knockout;; pathogenicity

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.24.005

2023-07-28；

2023-09-29

國家自然科學基金（31701740）、河南省自然科學基金（222300420519，222301420111）、河南省教育廳高等學校重點科研項目（24A210025）、河南省科技攻關項目（232102110202）、南湖學者獎勵計劃

宮安東，E-mail：gongad@xynu.edu.cn。通信作者張藝美，E-mail：xynuym@163.com

（責任編輯 岳梅）