響應面法優化蜂蜜釀酒工藝條件及風味的分析研究

黃 莎，陳 琳，楊動聽，汪 昕，楊 選，王曄洋，李偉榮*

（1.麗水市農林科學研究院，浙江麗水 323000；2.麗水市質量檢驗檢測研究院，浙江麗水 323000）

蜂蜜酒是世界上最早的酒精飲料，在公元五世紀至六世紀之間人們憑借經驗實踐制作蜂蜜酒，并將之儲存于瓦罐中。近幾年蜂蜜酒非常受歡迎[1]。蜂蜜酒采用稀釋蜂蜜，經發酵過濾澄清得到，酒精度不高[2]。目前，蜂蜜酒釀造工藝存在兩大問題，一是蜂蜜酒發酵酒精度不高，周期長達數周甚至幾個月，因蜂蜜成分和發酵菌種的不同而有所差異[3]，酒精度不高使得蜂蜜酒不耐貯藏，發酵周期長使得商業化的生產成本增加，不利于蜂蜜酒的產品化開發；二是蜂蜜釀酒過程中產生不良風味，使得蜂蜜酒品質難以滿足人們對愉悅感受的追求[4]。

導致蜂蜜酒發酵酒精度不高、時間長的原因，一是蜂蜜自身的問題，蜂蜜的高滲透壓抑制大部分微生物的生長，蜂蜜缺乏酵母生長所需的營養物質如氮源和礦物質；二是與發酵的菌種及發酵溫度有關，菌種抗性能力的強弱、適應性的好壞、接種量以及發酵溫度與發酵進程和成品品質密切相關[5]。蜂蜜酒的風味來自于蜂蜜本身、酵母發酵及發酵工藝[6]。揮發性香氣物質對蜂蜜酒品質起著決定性的作用，不良風味的產生嚴重影響蜂蜜酒的品質。據研究報道，蜂蜜酒的不良風味物質主要來自于發酵不完全導致的二次發酵，蜂蜜酒的不良風味與乙酸乙酯、辛酸和己酸的含量有關，這些揮發性物質導致蜂蜜酒感官品質下降，尤其是香氣和味道[7]。還有研究者發現用于發酵的菌株對酒的風味有影響，不恰當的菌株有可能會產生異味[8]。本研究擬通過研究酵母菌種、酵母接種量、氮源、氮源添加量、蜂蜜稀釋度、pH 值等單因素條件對蜂蜜酒的影響，結合響應面法優化工藝解決蜂蜜發酵酒精度不高及發酵過程產生不良風味的問題。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

樣品及菌種：棗花蜜（波美度42 oBx），浙江麗水蜂農；AQ 釀酒酵母，安琪酵母股份有限公司；LMD 釀酒酵母，憨酒匠自釀坊，原產國丹麥；DBS釀酒酵母，煙臺帝伯仕酵母有限公司；

試劑及耗材：純凈水；(NH4)2SO4、(NH4)2HPO4、維生素B1，食品級，廣東順達食品配料城；其他檢測用試劑均為分析純試劑（AR）或生物試劑（BR）。

儀器設備：BSA224S 電子天平，賽多利斯科學儀器有限公司；T9CS 雙光束紫外分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；恒溫水浴鍋，上海精宏實驗設備有限公司；pH 計，梅特勒-托利多；糖度計，上海力辰邦西儀器科技有限公司；氣相色譜儀，7890 安捷倫科技有限公司；Trace 1300-ISQ QD 氣質聯用，安捷倫科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 純蜂蜜釀酒操作步驟

蜂蜜稀釋：按蜂蜜和水的質量比加純凈水稀釋，并攪拌均勻，采用手持折光儀測定糖度，單位為oBx。

加氮源：蜂蜜中缺乏酵母生長繁殖所需的足夠氮源[9-10]，需將外源氮源(NH4)2SO4、(NH4)2HPO4、維生素B1 等加入蜂蜜稀釋液中，并攪拌均勻，才能使發酵進行徹底。

滅菌和冷卻：將配制好的蜂蜜營養液置于80 ℃水浴保溫20 min，起到殺滅有害微生物的作用，冷卻至30 ℃左右。

加酵母：將酵母置于35 ℃左右含2%的蔗糖水溶液中活化約20 min，將活化好的酵母菌加入滅菌冷卻好的蜂蜜營養液中。

發酵：將接種好的蜂蜜營養液置于適宜溫度下發酵1個月左右。

澄清：將發酵液靜置一段時間，直至發酵液完全澄清，取澄清發酵液即得到蜂蜜酒成品。

1.2.2 發酵工藝單因素試驗設計

試驗研究不同酵母菌種、不同接種量、不同氮源、不同氮源添加量、不同蜂蜜稀釋度、不同pH 值對純蜂蜜發酵酒的影響，評價指標有蜂蜜酒酒精度和感官評分。

1.2.3 發酵工藝響應面優化試驗

在單因素試驗結果的基礎上，自變量選取A 酵母接種量、B 氮源添加量和C 蜂蜜稀釋度，響應值為X 酒精度和Y 感官評分，采用Box-Behnken 響應面試驗法優化發酵條件[11]，3因素3水平見表1。

表1 純蜂蜜酒發酵條件優化響應面試驗因素與水平

1.2.4 分析檢測

蜂蜜酒酒精度的測定參照GB 5009.225—2016執行[12]；蜂蜜酒糖度采用手持折光儀進行測定，單位為oBx；總糖、總酸和揮發酸參照GB/T 15038—2006 執行[13]；甲醇的測定參照GB 5009.266—2016執行[14]；衛生指標金黃色葡萄球菌和沙門氏菌的測定參照GB 4789.10—2016[15]和GB 4789.4—2016[16]執行。

1.2.5 感官評價

蜂蜜酒感官評價參照行業標準QB/T 5475—2020 執行[17]，將酒樣水浴調溫至20～25 ℃，取酒樣注入潔凈透明的玻璃杯中進行感官評價。外觀與色澤：在自然光亮處，用肉眼觀察酒樣的外觀與色澤，色澤及深淺、透明度和澄清度、有無沉淀及懸浮物；香氣：手握杯柱，將酒杯置于鼻孔下方，嗅聞揮發香氣，然后慢慢搖動酒杯，嗅聞空氣進入后的香氣，加蓋用手握酒杯腹部2 min，搖動后再嗅聞香氣；滋味：喝入適量酒樣，仔細品嘗后咽下，再體會后味[18]，最后根據表2評分標準[19]進行打分。

表2 蜂蜜酒感官評價標準

1.2.6 風味物質的檢測

風味物質的檢測參照何瑞的略做修改[20]，取樣品6 mL 加入到萃取瓶中，密封好后插入萃取針，50 ℃恒溫萃取40 min后插入進樣口解析4 min。

氣相色譜條件：色譜柱為DB-5MS（30 mm*0.25 mm，0.25 μm）；載氣氦氣，流速1.0 mL/min；進樣口溫度250 ℃；升溫程序：42 ℃保持4 min，以10 ℃/min 升至90 ℃，保持2 min，再以8 ℃/min 升至130 ℃，保持2 min，最后以10 ℃升至240 ℃，保持5 min。

質譜條件：離子源溫度230 ℃，接口溫度230 ℃；質量掃描范圍35～450 m/z；質譜庫NIST 11。檢測出的物質通過計算機檢索與Library-Mainlib 標準譜庫對比，僅統計正反匹配度均超過800 的揮發性風味物質，采用面積歸一化法進行定量分析。

1.3 數據處理

本實驗數據分析采用WPS 2021 和Design Expert.V8.0.6軟件進行數據分析處理。

2 結果與分析

2.1 發酵工藝單因素試驗結果

2.1.1 不同菌種及接種量對蜂蜜酒酒精度與感官評價的影響

實驗選用3 種釀酒酵母，分別是DBS、AQ、LMD，對酒精度和感官評分的影響如圖1 所示。LMD 發酵得到的蜂蜜酒無論是酒精度還是感官評分都高于另外兩組，選用LMD 釀酒酵母作為發酵菌種。不同接種量對蜂蜜酒的酒精度和感官評分的影響如圖2 所示，酒精度和感官評分隨接種量的增加呈現增加的趨勢，接種量2 g/L時最大。

圖1 不同酵母菌種對蜂蜜酒酒精度和感官評分的影響

圖2 不同酵母接種量對蜂蜜酒酒精度和感官評分的影響

2.1.2 不同氮源及添加量對蜂蜜酒酒精度與感官評價的影響

實驗選用(NH4)2SO4、(NH4)2HPO4和VB1作為氮源，研究不同氮源及添加量對酒精度和感官評分的影響，實驗結果如圖3 和圖4 所示。3 種氮源的添加對酒精度無顯著影響，添加(NH4)2HPO4作為氮源蜂蜜酒的感官評分最高，添加VB1作為氮源得到的蜂蜜酒出現異味，影響感官體驗。

圖3 不同氮源對蜂蜜酒酒精度和感官評分的影響

圖4 不同氮源添加量對蜂蜜酒酒精度和感官評分的影響

2.1.3 不同初始糖度對蜂蜜酒酒精度與感官評價的影響

不同初始糖度對蜂蜜酒酒精度的提升至關重要，初始糖度低無法提供足夠的碳源用于發酵產生酒精，過高的初始糖度會產生過高的滲透壓不利于酵母繁殖增長。不同初始糖度對蜂蜜酒的酒精度和感官評價的影響如圖5 所示，酒精度隨初始糖度的升高呈現先上升后下降的趨勢，初始糖度的增加，致使滲透壓增加，限制了酵母的繁殖和產酒精的能力[20]。初始糖度的增加有利于蜂蜜酒的口感提升，增加蜂蜜酒的柔和感。

圖5 不同初始糖度對蜂蜜酒酒精度和感官評分的影響

2.1.4 不同pH 值對蜂蜜酒酒精度與感官評價的影響

原蜂蜜稀釋液pH 值為7.0，使用檸檬酸調節蜂蜜稀釋液pH值至3.0、4.0、5.0、6.0，再發酵得到蜂蜜酒，結果如圖6 所示。蜂蜜稀釋液的pH 值顯著影響蜂蜜酒的感官評分，蜂蜜稀釋液pH 值3.0 時得到的蜂蜜酒的酒精度和感官評分最低，未調節pH 值的蜂蜜稀釋液發酵得到的蜂蜜酒酒精度和感官評分最高。

圖6 不同初始pH值對蜂蜜酒酒精度和感官評分的影響

2.2 發酵工藝響應面優化試驗結果

2.2.1 響應面試驗結果與方差分析

在單因素實驗的基礎上，酵母的接種量、氮源的添加量及初始糖度對蜂蜜酒的酒精度和感官評分有較大影響，選擇三者作為三因素，采用響應面法進行優化，篩選出純蜂蜜發酵酒的最佳發酵工藝條件，響應面試驗設計及結果見表3，方差分析結果見表4和表5。

表3 蜂蜜酒的響應面試驗設計和結果

表4 蜂蜜酒酒精度的回歸模型分析

表5 蜂蜜酒感官評分的回歸模型分析

模型的二次多項式回歸方程：

根據表4 可知，該模型極顯著（P＜0.01），失擬項不顯著（P＞0.05），表明該模型誤差較小，擬合度好。A2、B2、C2對酒精度影響極顯著（P＜0.01），B 對酒精度影響顯著（P＜0.05），模型相關系數R2=0.9736，表明該回歸方程與試驗結果具有較好的擬合度，可以用該方程表達酒精度與酵母接種量、氮源添加量和初始糖度之間的關系[21]。

模型的二次多項式回歸方程：

根據表5 可知，該模型極顯著（P＜0.01），失擬項不顯著（P＞0.05），表明該模型誤差較小，擬合度好。A、B、C、AB、A2、B2、C2對感官評分的影響極其顯著（P＜0.01），BC 對感官評分影響顯著（P＜0.05），模型相關系數R2=0.9904，表明該回歸方程與試驗結果具有較好的擬合度，可以用該方程表達感官評分與酵母接種量、氮源添加量和初始糖度之間的關系。

2.2.2 響應面交互影響

各因素交互作用對酒精度的影響如圖7，當酵母接種量（A）、氮源添加量（B）和初始糖度（C）兩兩交互作用時，對蜂蜜酒酒精度均有影響，但影響程度存在一定差異。酵母接種量（A）和氮源添加量（B）的響應面較為平緩，等高線也顯示酒精度變化跨度小，說明酵母接種量（A）和氮源添加量（B）對酒精度的影響小于初始糖度（C），在試驗范圍內可以獲得酒精度為最大值的點。

圖7 各因素交互作用對蜂蜜酒酒精度的影響響應面

各因素交互作用對感官評分的影響如圖8，當酵母接種量（A）、氮源添加量（B）和初始糖度（C）兩兩交互作用時，對蜂蜜酒感官評分均有影響，AB、AC、BC 面分別隨A、B、C 的增加，呈現先增加后下降的趨勢，因此試驗可以獲得感官評分最大值的點[19]。

圖8 各因素交互作用對蜂蜜酒感官評分的影響響應面

由Design expert.V8.0.6 預測得到，最佳工藝是：酵母接種量2.14 g/L，氮源添加量0.53 g/L，初始糖度28.01oBx，此時模型預測值酒精度和感官評分分別為15.09 %vol 和86.4 分。為此設計試驗進行驗證，得到的蜂蜜酒酒精度為15.20 %vol，感官評分為86.5 分，與預測值相差不大，表明本工藝可行，純蜂蜜釀酒能夠達到這一酒精度尚數少見。

2.3 理化指標檢測的結果

檢測優化工藝后釀造得到的蜂蜜酒理化指標，見表6。酒精度、總酸、揮發性酸均符合QB/T 5475—2020《蜂蜜酒》標準[17]，但此標準中對蜂蜜酒的總糖規范不夠明確，普遍認為可參照葡萄酒[22]和其他果酒的標準[23]，根據含糖量高低分為干型（總糖≤4.0g/L）、半干型（總糖4.1～12.0 g/L）、半甜型（總糖12.1～45.0 g/L）、甜型（總糖≥45.1 g/L）蜂蜜酒[24-26]。此外，蜂蜜酒中甲醇、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌未檢出。

表6 蜂蜜酒理化和衛生指標檢測結果

2.4 風味物質分析結果

本工藝釀造得到的蜂蜜酒檢測出的風味物質組分及相對含量如表7 所示。檢測出14 種揮發性風味物質，其中醛類和酯類相對含量最高，無不良風味物質出現，與感官評價結果一致。徐麗萍等[28]采用電子鼻和氣相色譜-離子遷移譜法對蜂蜜酒發酵前后揮發性風味成分的遷移變化進行比較分析，發現發酵后的蜂蜜酒在保留蜂蜜原有風味的同時，新的風味成分顯著增加，從而形成蜂蜜酒獨特的風味特征。

表7 蜂蜜酒風味物質組分及相對含量

3 結論

本研究采用深棕色棗花蜜釀造蜂蜜酒，有研究表明深色蜂蜜的抗氧化活性顯著高于淺色的蜂蜜，釀成蜂蜜酒仍然如此[29]。通過單因素及響應面試驗得到純蜂蜜釀酒的最佳發酵條件為菌種選用LMD釀酒酵母，酵母接種量2.14 g/L，氮源選擇(NH4)2HPO4，氮源添加量0.53 g/L，初始糖度28.01oBx，此條件下得到的蜂蜜酒感官評分86.5 分、總糖24.4 g/L、酒精度15.20 %vol、總酸3.6 g/L、揮發酸0.54 g/L，甲醇、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌均未檢出，檢測出14 種揮發性風味物質。純蜂蜜釀造酒酒體協調，呈透明琥珀色，無明顯沉淀，無明顯酸澀味，蜜香酒香濃郁和諧。本研究將蜂蜜酒酒精度提高至15.20%vol，風味也得到顯著提升。此外，蜂蜜酒仍值得深入研究，如蜂蜜酒的特征風味以及風味和化學物質之間的聯系還不清楚[30]，本地坊間還傳言蜂蜜酒具有諸多功能性，滋陰補腎、延緩衰老等，趙彤等[31]也提出發酵蜂產品的功能性和作用機制值得深入研究。