中國白酒中健康因子四甲基吡嗪的研究進展

龍亞飛，趙益梅，冉光耀，胡智慧，張春林，吳德光

（茅臺學院釀酒工程系，貴州仁懷 564500）

中國白酒歷史悠久，它是以糧谷為主要原料，采用大曲、小曲或麩曲為糖化發酵劑，經過蒸煮、糖化、發酵、蒸餾而制成的蒸餾酒[1-2]。近年來，由于人們生活水平的提高，越來越多的人關注保健、養生，“健康飲酒”是中國白酒研究的熱點問題，研究人員將中國白酒中含有的對人體健康有利的成分統稱為健康功能因子，簡稱健康因子[3]。四甲基吡嗪（tetramethylpyrazine,TTMP）又名川芎嗪[4]，是我國首先從常用中藥川芎中提取出的生物堿，是川芎治療心腦血管疾病的有效成分之一，臨床上已廣泛應用于治療缺血性心腦血管疾病及慢性心衰、腎衰等并且取得了良好的療效。吳建峰[5]在2006 年率先提出四甲基吡嗪是白酒中的主要功能性成分之一，在不同香型白酒中普遍存在，引起行業的關注。

在所有蒸餾酒中，四甲基吡嗪是中國白酒特有的功能性成分，四甲基吡嗪賦予了中國白酒有益健康的功能，對酒體貢獻甜香、堅果香及花香，能對其他香味物質起到明顯的烘托疊加作用，豐滿白酒香氣[6-7]。本文就中國白酒中四甲基吡嗪研究現狀進行總結，以期為科學研究中國白酒中的四甲基吡嗪提供參考。

1 四甲基吡嗪類的性質與功能

吡嗪是一類含有2 個對稱氮原子的六元雜環化合物（圖1），在自然界中廣泛存在，烷基吡嗪是一類在碳原子上只發生碳氫取代的化合物，其中R1、R2、R3、R4 被甲基取代即為四甲基吡嗪（圖2），是一類重要的烷基化吡嗪，白色針狀晶體，具有令人愉快的、特殊的烤肉和炒堅果香氣。四甲基吡嗪還是國際公認的、安全的食品風味添加劑[8]。在醫學界，四甲基吡嗪是中草藥川芎根莖的主要生物活性成分，具有抑制血小板聚集、擴展血管和防止血栓形成等作用[9]，對治療呼吸系統疾病、腎小球疾病、心腦血管疾病等也有一定的療效[10-11]，還可以用于食療，有利于增強認知能力[12]。此外，四甲基吡嗪治療老年慢性肺心病患者動脈高壓時可以發生低血壓反應，四甲基吡嗪作為中藥單體，有降低低氧PAH 的作用，且不影響動脈血壓，已被《中國藥典》收錄[13]。

圖1 吡嗪的化學式

2 中國白酒中四甲基吡嗪的形成途徑

四甲基吡嗪作為一種健康的風味化合物，國外研究者對不同產品中四甲基吡嗪的來源也進行過研究，某些烘焙食品中的四甲基吡嗪主要來自美拉德反應，但其他一些產品則主要來自微生物代謝作用。

2.1 美拉德反應

食品烘焙過程中羰基化合物（還原糖類）和氨基化合物（氨基酸和蛋白質）會發生非酶促的美拉德反應[14]，對食品風味、顏色的形成有十分重要的作用。人們普遍認為美拉德反應是非酶促的化學反應，反應條件一般是溫度大于100 ℃，pH≥7，含水量不超過25 %，這一反應條件在中國白酒中很難達到，莊名揚等[15]通過實驗，認為大曲中地衣芽孢桿菌某種酶系可以催化美拉德反應發生，其中產物含四甲基吡嗪。2005 年莊名揚[16]再次提出，中國白酒的香和味部分由美拉德反應產生。2019 年，ZHANG 等[17]研究芝麻香型白酒中四甲基吡嗪變化時，提出中國白酒中四甲基吡嗪形成主要存在于溫度較高的制曲、高溫堆積、蒸餾等階段。截至目前，研究發現，關于吡嗪類化合物的產生途徑已經非常清楚，微生物的作用占70%以上，而美拉德反應的作用約30%不到。

2.2 微生物代謝作用

1962 年，Kosuge 等[18]在日本的發酵豆制品“納豆”中分離得到四甲基吡嗪，并首次發現是其中的枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）通過生物合成獲得四甲基吡嗪。1967 年，Demain 等[19]發現一株突變的谷氨酸棒狀桿菌利用異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸和泛酸，通過變異的異亮氨酸纈氨酸途徑，合成四甲基吡嗪，提出枯草桿菌培養體系中四甲基吡嗪的生物合成途徑——由糖的代謝產物3-羥基丁酮和氨基酸的氨基部分生物合成，這是最早關于微生物合成四甲基吡嗪機制的報道。直到2011 年，江南大學徐巖[20-23]團隊研究發現白酒中四甲基吡嗪并非完全來源美拉德反應，而是來源于微生物的代謝反應，其產生機制為：功能菌株糖降解產生丙酮酸，兩分子的丙酮酸縮合生成α-乙酰乳酸，α-乙酰乳酸脫酸產生乙偶姻，發酵體系中的乙偶姻和主要由氨基酸轉化而來的氨通過非酶促反應生成四甲基吡嗪。研究發現，在中國白酒中產吡嗪的微生物主要是芽孢桿菌，以枯草芽孢桿菌最多。

3 中國白酒中四甲基吡嗪的分析檢測技術

關于藥品中四甲基吡嗪檢測方法，在《中國藥典》中已建立了高效液相色譜（High performance liquid chromatography，HPLC）的檢測方法體系[24]。食品添加劑中四甲基吡嗪的檢測分析，香氣的評定是按照GB/T 14454.2 執行，分析檢測是按照GB/T 11539—1989 中第5 章的規定，即填充柱氣相色譜分析[25]。由于中國白酒中四甲基吡嗪含量低（濃度為ppb 級），所以白酒中四甲基吡嗪前處理尤為重要，目前常用的前處理方法主要有液液萃取法和頂空固相微萃取法，經過前處理后的白酒，一般用高效液相色譜和氣相色譜進行檢測。

對白酒中四甲基吡嗪的分析檢測，一開始主要進行定性分析，隨著檢測技術發展，對白酒中四甲基吡嗪進行定量分析，后來在檢測的準確度、靈敏性、快速性上進行深入研究，除了常規的高效液相色譜和氣相色譜檢測外，還創建了新的檢測方法，具體研究如下：范文來等[26]應用液液萃取和分餾技術研究了綿柔型洋河藍色經典酒微量揮發性成分，經氣相色譜質譜儀（Gas chromatograph mass spectrometer，GC-MS）檢測，檢測到四甲基吡嗪；王曉欣等[27]采用液液萃取法對醬香白酒中的香氣化合物進行濃縮，并通過氣相色譜-聞香法（Gas chromatography-Odor，GC-O）結合氣相色-質譜（GCMS）分別進行香氣成分分析，其中四甲基吡嗪香氣描述為焙烤香，平均香氣強度為3.5；孫嘯濤等[28]采用渦旋輔助液液萃取結合氣相色譜-質譜（GCMS）對67 種白酒中四甲基吡嗪進行檢測，分析表明，67 種白酒均含有四甲基吡嗪，含量范圍為1.5～2434.3 μg/L；楊帆等[29]在分析茅臺大曲中3 株芽孢桿菌代謝產物時，采用液液萃取結合GC-MS 分析檢測，發現地衣芽孢桿菌MTDB-01 和枯草芽孢桿菌MTDB-03 代謝產物中有四甲基吡嗪；王莉等[30]利用氣相色譜-質譜-離子掃描聯用（GC/MS-SIM）技術，直接定量分析了7 種樣品酒的四甲基吡嗪含量，該方法具有準確度高、靈敏度高、檢測時間短等特點；張溫清等[31]建立了用氣相色譜內標法測定芝麻香型白酒中四甲基吡嗪含量的方法，該方法具有操作簡便、精密度好、準確度高的特點，酒中四甲基吡嗪含量為1.20 mg/L；高傳強[32]采用頂空-固相微萃取法（Headspace-solid phase microextraction method，HS-SPME）與氣相色譜-質譜聯用法分析芝麻香型白酒風味物質，發現四甲基吡嗪的含量很高，含量為1.27 mg/L。吳婷婷等[33]對梅蘭春芝麻香酒的健康成分分析，采用頂空固相微萃取和氣相質譜聯用法檢測到梅蘭春酒樣（1 號和2 號）中四甲基吡嗪的平均含量為0.71 mg/L；孫棣等[34]建立了液相色譜-串聯質譜檢測法對8 種吡嗪化合物進行定量分析，發現真茅臺酒四甲基吡嗪的含量在9.25～28.3 mg/L，假茅臺酒中四甲基吡嗪的含量在0.89～12.5 mg/L，該方法靈敏度高、專屬性好，樣品直接進樣，在檢測方法上進行了創新；韓興林等[35]采用GC-FID（氫火焰離子化檢測器）結合GC-MS分析云門醬香型白酒風味特征成分，發現云門醬香白酒中四甲基吡嗪的含量偏低，其中南方的飛天茅臺四甲基吡嗪含量為6.52 mg/L，云門醬香的含量為0.43 mg/L；徐占成等[36]采用全二維-飛行氣質聯用檢測儀（GC-GC-TOFMS）及HPLC-MS 對劍南春酒中微量香味物質進行分析檢測，定性檢測了四甲基吡嗪；任學坤等[37]設計出一種利用氣相色譜外標法測定白酒中四甲基吡嗪的方法，并對含量進行測定；司冠儒等[38]首次利用高效液相色譜技術建立了一種芝麻香型白酒中健康功能因子四甲基吡嗪的快速檢測方法，測得宣酒芝麻香白酒中四甲基吡嗪含量分別為1.26 mg/L、1.02 mg/L、1.31 mg/L；王國明等[39]應用液液萃取結合氣相色譜-質譜聯用對濃香型山莊老酒吡嗪類物質進行分析，檢測發現四甲基吡嗪的含量高于100 μg/L；司冠儒等[40]建立了氣相色譜內標法、液相色譜外標法和液相色譜質譜聯用外標法測定芝麻香白酒中的四甲基吡嗪，對檢測四甲基吡嗪的回收率和精密度進行了比較，發現液相色譜質譜法測定白酒中四甲基吡嗪效果最好；梅明明等[41]采用直接進樣法和液液萃取濃縮法進樣樣品前處理，建立了GC-MS 測定白酒中常見吡嗪類化合物的方法，對醬香型和濃香型白酒中四甲基吡嗪含量進行測量，分別為17.03 μg/L和0.53 μg/L；黃杰等[42]建立了白酒中四甲基吡嗪的氣相色譜-三重四級桿質譜（GC-QQQ）測定法，首次開發了一種利用三重四級桿氣質聯用儀測定白酒中四甲基吡嗪含量的方法，能夠準確進行定性和定量，具有快速、準確、選擇性好、靈敏度高等優點；史改玲等[43]應用液液萃取結合氣相色譜-質譜-選擇離子掃描（gas chromatography mass spectrometry-selective ion monitoring，GC-MS-SIM）技術檢測20 種酒樣中的四甲基吡嗪含量，發現四甲基吡嗪在醬香型酒樣中質量濃度為2379.65～2985.09 μg/L，遠高于芝麻香型酒樣的1116.80～1309.66 μg/L 及濃香型酒樣的245.40～555.76 μg/L，具有檢測快速、準確度高、專一性強等優點；趙應梅等[44]建立了GC-MSSIM(選擇離子掃描）快速檢測四甲基吡嗪的分析方法，茅臺、珍酒、郎酒中四甲基吡嗪的含量分別為9.42 mg/kg、3.31 mg/kg、1.40 mg/kg，該方法的特點是縮短了樣品前處理時間，減少了目標物的損耗，能檢出低濃度的吡嗪類化合物。

4 提高中國白酒中四甲基吡嗪含量研究

在明確中國白酒中四甲基吡嗪來源和機理及檢測技術后，研究人員把目標鎖定在如何提高中國白酒中四甲基吡嗪含量，梳理文獻資料發現，主要通過篩選高產四甲基吡嗪的菌株，優化發酵條件，使其產四甲基吡嗪的含量達到最大，再將其應用到白酒的生產過程。具體研究如下：2022 年，范恩帝等[45]為提高醬香白酒中四甲基吡嗪含量，從醬香大曲中篩選出菌株西姆芽孢桿菌一株，應用于醬香大曲模擬生產時，發酵產物中四甲基吡嗪的產量可以達到65.51 mg/kg；2022 年，王慶等[46]從高溫大曲中篩選高產四甲基吡嗪菌株，鑒定為貝萊斯芽孢桿菌，對其發酵條件優化后，四甲基吡嗪產量為728.38 mg/L，比優化前提高了167%；2022 年，郭春生等[47]以高溫大曲為材料，篩選出一株高產四甲基吡嗪的菌株（1-13），鑒定為解淀粉芽孢桿菌，經發酵條件優化后四甲基吡嗪產量可達（166.19±2.79）mg/L，較優化前（112.26 mg/L）提高48 %；2022 年，張春林等[48]從高溫大曲中篩選出4株產醬香風味的細菌，鑒定為枯草芽孢桿菌YHB0165、枯草芽孢桿菌YHB0169、巨大芽孢桿菌YHB0170 和枯草芽孢桿菌YHB0171，發酵產物中四甲基吡嗪含量分別為67.30 ng/g、17.80 ng/g、78.30 ng/g、69.86 ng/g；2022 年，梁慧珍等[49]從高溫大曲中篩選出一株產吡嗪類的菌株，鑒定為芽孢桿菌（X1），用于強化大曲，對提高四甲基吡嗪有顯著影響，比對照組提升2.36 倍；2022 年，張穎等[50]為提高白酒中四甲基吡嗪的含量，從高溫大曲中篩選出一株高產四甲基吡嗪的功能菌，鑒定為地衣芽孢桿菌（GTBL-168），測得發酵液總四甲基吡嗪含量為12.22 mg/L；2021年，吳錢弟等[51]對芽孢桿菌與酵母菌和根霉曲混合發酵提高四甲基吡嗪含量進行研究，發現先接種酵母菌和根霉曲，再接種芽孢桿菌發酵，四甲基吡嗪含量最高，為881.5 μg/g；2021 年，張穎[52]篩選出產四甲基吡嗪的功能菌后，將功能菌制成麩曲,其TTMP 含量是傳統大曲中的160 倍，協同傳統大曲進行窖面酒發酵,較空白對照窖池，窖面基酒中TTMP含量提高了160.71%，用頭尾酒浸泡麩曲后回地鍋串蒸，窖面基酒中TTMP 含量提高了85.75%，將倆種方式結合應用于窖面酒的發酵，TTMP 含量提高了202.75 %，將實驗窖與對照窖基酒進行品評，結果實驗窖基酒在曲香特征和整體風格上均優于傳統生產的基酒，但干凈度比傳統工藝基酒低；2020年，黃治國等[53]以高溫大曲曲房空氣中可培養細菌為研究對象，分離出3 株菌，在高粱汁液態發酵物中檢測到四甲基吡嗪含量比較高；2020 年，盧君等[54]采用菌種強化結合工藝優化的方法，將醬香型白酒基酒中四甲基吡嗪含量提高了202.75%，該研究提供了一種適合企業落地應用的進一步提高醬香型白酒基酒中四甲基吡嗪含量的方法；2020 年，鐘桂芳等[55]以高溫大曲為研究對象，篩選了兩株高產四甲基吡嗪的菌株，鑒定為甲基營養型芽孢桿菌和蛋白水解型芽孢桿菌，可用于白酒工藝改進，提升原酒中四甲基吡嗪的含量；2020 年，周榆林等[56]通過加熱強化工藝制成的高溫大曲中四甲基吡嗪的含量由常規曲組未檢出提升至0.13 mg/100 mL；2019 年，張溫清等[57]從宣酒大曲中篩選出高產四甲基吡嗪的功能菌株，鑒定為解淀粉芽孢桿菌，固態發酵生產麩曲中四甲基吡嗪的含量最高，為202.54 mg/kg；2018 年，陳詩佳等[58]通過分子育種手段選育了高產乙偶姻酵母菌株，并應用到清香型麩曲白酒中，與出發菌株比較，該菌株發酵后酒醅中四甲基吡嗪含量提高了74.66 %。2018 年，葛向陽等[59]將篩選到的吡嗪類合成能力較強的菌株應用到大曲中，將大曲中四甲基吡嗪含量提高到100～380 mg/kg，較傳統中高溫曲提高了4～10 倍；2018年，馬美榮等[60]將篩選的4 株高產四甲基吡嗪芽孢桿菌應到清香型原酒的生產中，極大提升了清香型原酒中四甲基吡嗪的含量，高達10 mg/L；2018 年，葛向陽等[61]使用強化高產四甲基吡嗪地衣芽孢桿菌的大曲發酵濃香型白酒，結果濃香型原酒中四甲基吡嗪含量提高到了3～6 mg/L，較傳統濃香型白酒提高了5～20 倍；2017 年，王曉丹等[62]將篩選到的地衣芽孢桿菌用于提高碎沙酒醬香風格特征，將菌株添加到窖池中層的糟醅中，與空白糟醅做對比分析，發酵后糟醅中四甲基吡嗪含量達6.81 μg/g，是對照組的3.03 倍，酒樣中四甲基吡嗪相對百分含量達0.028%；2016 年，李曉歡等[63]對從古井桃花曲中篩選到的高產四甲基吡嗪菌株進行優化，與初始條件下比，四甲基吡嗪含量達到833 mg/L，提高了46 倍；2016 年，李曉霞[64]從汾酒大曲中篩選到高產四甲基吡嗪菌株，并制備芽孢桿菌固體制劑應用于釀酒車間，釀造的汾酒保持了基本特性，經專業評酒師品評認為增加了綿甜感，四甲基吡嗪增加到5.3 μg/mL，比對照增加了近3倍。

5 總結與展望

葡萄酒中白蘆藜醇的發現，促進了葡萄酒市場的快速發展，啤酒中支鏈寡糖、蛋白質、氨基酸、維生素及礦物質等豐富的營養物質，被譽為“液體面包”，極大促進了啤酒產業的發展。白酒中四甲基吡嗪的發現使人們認識到中國白酒中含有健康功能因子，對引領整個白酒界“健康白酒”的理念具有重要的意義。在保證白酒風味和口感協調的基礎上，建議中國白酒中四甲基吡嗪的研究可以從以下幾點入手：（1）利用代謝工程技術改造功能菌（主要是芽孢桿菌）從頭合成四甲基吡嗪機制研究；（2）當前研究較多是篩選產四甲基吡嗪的細菌，可以把目標轉移到篩選產四甲基吡嗪前體物質乙偶姻的微生物（例如酵母菌），并將不同菌株混合應用，找出最佳組合方式；（3）采用分子生物學技術，保證篩選出的產四甲基吡嗪功能菌株的穩定性；（4）外源添加產四甲基吡嗪藥材，比如在白酒發酵原料中適量添加中藥川芎粉末（或川芎的濃縮液）；（5）實踐中可以通過調控發酵進程（溫度、pH 值、含氮等）提高白酒酒體中四甲基吡嗪含量。總之，可以從多維度提高中國白酒中四甲基吡嗪的含量，達到適量飲用富含四甲基吡嗪白酒有益健康的目的，提升中國白酒相對于其他酒種在市場中的競爭力。