白酒中氨基甲酸乙酯形成途徑及影響因素的研究進展

路 瑞，馬 龍，唐 云，郇 丹，李永霞，趙亞雄

（金徽酒股份有限公司，甘肅隴南 742308）

作為世界六大蒸餾酒之一，中國白酒具有悠久歷史和獨特工藝，其在我國社交、慶典及其他傳統活動中扮演重要角色，代表了我國豐富多樣的酒文化。同時，在國際市場上中國白酒也具有一定的知名度和影響力。在白酒釀造過程中會自發產生一類可致癌的副產物，即氨基甲酸乙酯（Ethyl carbamate，EC）。目前為止，大量研究顯示大部分發酵食品包括酒精飲料中都含有EC[1-3]，且有研究顯示EC 具有多位點基因毒性，對人類具有潛在的致癌風險[1]。2007 年國際癌癥研究署（International Agency For Research On Cancer，IARC）正式將EC歸為2A 類致癌物質[3-4]。之后，許多國家開始關注酒精飲料中的EC 并對不同酒飲品中的最高EC 殘留量進行了設定。其中，國際規定蒸餾酒中EC 最高限量為150 μg/L[5]。目前，我國尚未制定酒精飲料中EC限量標準。隨著人們對EC的關注度增加，國內外科研人員對白酒釀造、蒸餾、貯存過程中EC的生成代謝，EC 檢測方法優化以及EC 生物毒性進行了相關研究。鑒于我國尚未建立白酒中EC 限量標準，本文參考國內外相關研究內容，針對食品中EC 研究進展、白酒釀造過程中EC 代謝機制以及影響EC 形成因素等方面進行綜述，以期為中國白酒產品安全風險評估、建立白酒中EC 限量標準以及白酒產業的可持續健康發展提供理論基礎。

1 EC概述

19世紀初，在植物生長促進劑與抑制劑的研究過程中，研究人員發現EC具有抑制植物組織、細菌以及小鼠腫瘤細胞生長的功能[6]。隨著研究的深入，EC 被用作人類和實驗動物催眠及抗腫瘤的藥物，直到1943 年首次在小鼠中發現其可引起肺腺瘤[7]。之后的動物研究表明，實驗動物接觸EC可增加機體多位點腫瘤發病率，包括肺、肝、淋巴、乳腺以及皮膚等器官[8]。EC 主要通過皮膚以及腸道上皮組織快速進入體內，雖然攝入機體中的EC 大部分被水解后排出體外，但少部分EC 在機體中經過細胞色素P450 氧化分解形成乙烯基-氨基-甲酸酯環氧化物，該物質能破壞脫氧核糖核酸（Deoxyribonucleic acid，DNA）結構，也能造成Cu2+調控的DNA損傷，最終導致細胞癌變[9]。隨著21 世紀分子生物學及細胞生物學等的快速發展，EC 致癌機制的相關研究更加深入。在嚙齒動物的EC 毒性研究中發現，EC 在機體中被細胞色素P450 轉化為N-羥基-氨基甲酸乙酯（0.1%）和氨基甲酸乙酯環氧化合物（0.5 %）。其中，N-羥基-氨基甲酸乙酯最終轉化為以活性氧（Reactive oxygen species,ROS）為主的含氧產物，ROS 通過影響Cu2+調控過程進而引起DNA損傷；乙烯基－氨基甲酸乙酯會轉化形成可與DNA 共價結合的加聚物，進而導致細胞癌變[9-10]。近年來，EC 的毒理學研究也開始轉向細胞模型及人體組織。有研究表明，細胞中的信號轉導和轉錄激活因子3（Signal transducer and activator of transcription 3,STAT3）、核轉錄因子κB（Nuclear transcription factor-κB,NF-κB）[11-13]及細胞外信號蛋白調節激酶（Extracellular signal-regulated kinase,ERK）[14]等參與了EC 誘導細胞癌變的過程；EC 也可以通過誘導氧化應激、破壞膜完整性以及破壞DNA 和蛋白質結構等多種途徑引起機體毒性效應[15-16]。

隨著人們生活水平不斷提高，居民的日常飲食模式也逐漸發生轉變，其中飲用酒及其他發酵食品的消費量大幅度提高。根據國際食品添加劑法典委員會統計數據表明[17]，人體從酒精飲料中攝入的EC含量高達65 ng/kg·d，而從其他發酵食品中攝入的EC 含量僅為15 ng/kg·d。酒精飲料中EC 的高含量使得許多國家已開始制定控制措施，以有效控制人體攝入高含量EC。雖然目前歐盟還未建立EC 限量標準，但許多國家就發酵酒中的EC 含量設定了自己的標準。例如，加拿大政府和捷克共和國對不同酒精飲料中的EC 最高殘留量進行了設定，包括葡萄酒30 μg/L、蒸餾酒150 μg/L、清酒200 μg/L 和水果白蘭地400 μg/L；日本對葡萄酒、蒸餾酒以及水果白蘭地的EC 限量標準與加拿大相同，但對清酒中EC 含量設定為最高100 μg/L。此外，美國、韓國、巴西、德國、法國、英國及瑞士也限定了部分酒精飲料中EC的最高含量[18-19]，具體如表1所示。

表1 不同國家酒精飲料EC限量

Chen[20]在2007 年和2009 年分別開展了第四次和第五次中國總膳食研究（The China Total Diet Study，TDS），在兩次調查研究中，首次對我國酒精飲料中的EC 進行了分析研究，調查樣品取自全國16 個省份，代表了中國各省的平均飲食模式，覆蓋中國總人口的60 %左右。調查結果表明第五次TDS 酒精飲料中的平均EC 水平（19.8 μg/kg）高于第四次TDS（8.5 μg/kg），約增長1.3 倍，且在第五次TDS 中，中國人口中EC 的膳食攝入量約為平均人口8.27 ng/kg·d，高消費者約為45.67 ng/kg·d。此外，對北京市售的47份白酒樣品的調查顯示，EC的檢出率為100%，EC的平均含量為63.0 μg/L[21]；浙江酒精飲料中的EC含量范圍為2～515 μg/kg，包括黃酒中EC平均濃度160 μg/kg，米酒為87 μg/kg，白酒為72 μg/kg，葡萄酒為16 μg/kg，啤酒為2 μg/kg[1]。隨著我國白酒產業日益壯大以及消費量的增加，白酒中EC 的存在不僅會給消費者帶來健康隱患，更會阻礙我國傳統白酒國際化的進程，然而我國對于酒精飲料中EC的研究仍然處于數據積累階段。

2 白酒中氨基甲酸乙酯代謝機制

白酒中EC 的形成由多因素調控。首先，EC 的形成需要前體物質提供可與乙醇發生反應的氰酸鹽以及具有氨甲酰基官能團的化合物等；其次，EC形成也與發酵過程中的微生物息息相關。目前已經發現的EC 前體物質主要有尿素、瓜氨酸、氰化物、氨甲酰磷酸。林宜錦等［23］的研究表明，尿素、瓜氨酸與氨甲酰磷酸這3 種前體物質由發酵過程中微生物生長代謝等過程積累產生，而氰化物則主要由原料帶入并經過酶促反應生成EC。這些前體物質在不同香型白酒中對形成EC 的貢獻程度有所差異，主要取決于發酵微生物的組成體系及其協同代謝過程[23]。

2.1 EC的尿素形成途徑

Lin[24]對白酒中EC 及不同前體物質進行相關性分析發現，尿素與EC 相關性最強(r=0.92，P＜0.01)，其次是氰化物(r=0.61，P=0.02)，瓜氨酸與EC的相關性最弱，說明尿素是白酒中EC 形成最主要的前體物質，且尿素存在于白酒釀造的各個階段（發酵、蒸餾、貯存）。尿素的主要來源有兩方面：一是以高粱為主的釀酒原料帶入；二是酵母菌代謝精氨酸產生尿素[25]。酵母菌代謝精氨酸在供應自身生長繁殖以及進行乙醇代謝反應的過程中會積累大量尿素，其中少量尿素用以供應酵母細胞的生長需求，其余的尿素則被分泌至細胞外并進入糟醅中，從而導致糟醅中尿素含量顯著增加[26-27]。白酒釀造不同階段的尿素會通過不同途徑與乙醇反應從而生成EC：（a）發酵階段，尿素與乙醇在酸性條件下緩慢反應并積累EC，該反應速率隨發酵溫度的升高而逐漸加快，研究表明，酒精飲料在發酵過程中EC 與尿素濃度的變化基本同步[28]；（b）蒸餾階段，雖然EC 是在發酵過程中產生的，但由于EC 的沸點較高，難以達到蒸餾溫度，因此發酵過程中產生的EC 只有一小部分進入白酒中，而當含有尿素和乙醇等物質的混合溶液溫度達到60～100 ℃時，混合溶液中的尿素分解并產生氰酸鹽、異氰酸鹽以及氫氰酸和氨氣，其中氫氰酸能與乙醇反應積累EC，氰酸鹽、異氰酸鹽在酸性條件下也可以與乙醇反應生成EC[29-30]，因此，白酒中的EC 主要是在蒸餾過程中產生的，蒸餾過程中形成的EC 是白酒基酒中EC 的重要組成部分；（c）貯存階段，在白酒貯存過程中，酒體中未完全反應的尿素等前體物質也會與乙醇進行持續緩慢反應，從而形成EC。EC 的尿素形成途徑如圖1所示。

圖1 EC的尿素形成途徑

EC 的尿素合成途徑中，除原料中直接分解產生的尿素之外，酵母菌代謝精氨酸生成尿素途徑也十分重要。白酒發酵體系中精氨酸的來源是多樣的，發酵原料不僅能為發酵菌群提供其生長繁殖所需要的營養和能源，也是構成精氨酸的物質來源，要積累大量的精氨酸，需要有適量的碳源和氮源。碳源來自碳水化合物，用于合成菌群所需的糖類、脂肪以及次級代謝產物；氮源來自含氮化合物，用于合成菌體的蛋白質、核酸、酶以及其他初級或次級代謝產物。在白酒實際生產過程中，發酵池中微生物群落是由自然環境中長期積累而形成的穩定系統，因此，要控制尿素-EC 途徑中EC 的形成，可根據發酵成本及微生物群落特點選擇合適的碳源和氮源。

2.2 EC的瓜氨酸形成途徑

有研究表明，葡萄酒中EC 形成的主要原因為精氨酸代謝[31]。由于葡萄中含有豐富的精氨酸，其可被葡萄酒發酵過程中的微生物代謝形成尿素或瓜氨酸。在葡萄酒及水果白蘭地的研究中發現，瓜氨酸可與乙醇反應生成EC[32]，可見瓜氨酸也是發酵食品中EC 的主要前體物質之一。白酒釀造過程中瓜氨酸的主要來源有兩方面：（a）由釀酒原料帶入，Fang[33]發現濃香型白酒的主要原料高粱中瓜氨酸的含量為82.5 mg/kg，其含量幾乎是其他釀造原料（小麥、玉米、大米、糯米）的兩倍；Caoet[34]通過模擬白酒固體發酵條件，分析了不同品類高粱原料在發酵過程中EC 形成及其前體物質的變化規律，結果表明瓜氨酸和尿素是由高粱進行發酵的白酒中EC 形成的主要前體物質，不同品種高粱發酵過程中瓜氨酸含量變化有明顯差異，而糯高粱的平均EC 形成率是粳稻高粱平均EC 形成率的1.6 倍，說明由原料帶入的瓜氨酸是白酒釀造過程中EC 形成的主要前體物質之一；（b）精氨酸經乳酸菌代謝從而形成瓜氨酸，在白酒發酵階段，乳酸菌會將釀造原料中的精氨酸代謝生成瓜氨酸，該過程中屬于精氨酸脫亞胺酶途徑的精氨酸降解，又可稱為ADI途徑（Arginine deiminase pathway，ADI）[35]，適宜的條件下瓜氨酸通過ADI 途徑之后將進一步代謝為鳥氨酸、氨以及二氧化碳，并產生腺苷三磷酸（Adenosine triphosphate，ATP）；但當發生環境脅迫時，瓜氨酸的代謝途徑受阻，從而導致瓜氨酸積累[36-38]并被分泌到細胞外，進而與糟醅中的乙醇反應生成EC。EC的瓜氨酸形成途徑如圖2所示。

圖2 EC的瓜氨酸形成途徑

白酒釀造原料中瓜氨酸以及發酵體系中的精氨酸含量都能影響白酒中EC 的形成，發酵體系中的精氨酸含量不僅能影響EC 的尿素形成途徑，也能影響EC 的瓜氨酸合成途徑，其區別在于發酵體系中菌種不同。之前的研究表明白酒中EC 形成的主要途徑為尿素合成途徑和瓜氨酸合成途徑，但目前很少有研究對原料中不同氨基酸含量進行分析，且白酒發酵體系中微生物群落變化規律及不同種類微生物功能研究依然處于初步研究階段。如何控制白酒中EC的形成，可從降低原料中EC前體物質以及微生物鑒定及選育途徑進行研究。

2.3 EC的氰化物形成途徑

氰化物是發酵食品中EC 的另一種前體物質，有研究表明白蘭地中EC 是由乙醇和氰化物氧化產生[25]，一些富含生氰糖苷的核果蒸餾酒中EC 形成的主要前體物質也是氰化物。氰化物是通過植物原料中氰苷的酶促或酸熱分解產生的，其能夠以氰酸、氫氰酸以及含氰基的化合物等多種形式存在，上述任何形式均能與乙醇發生反應從而生成EC[29-30，39]。研究顯示，部分蒸餾酒發酵過程中原料中的生氰糖苷可通過加熱裂解形成氰化物，也可在微生物代謝過程中通過酶促反應生成氰化物[40]，此后氰化物被氧化生成氰酸鹽[41-42]，氰酸鹽在催化劑如光照、氧氣或Cu2+等作用下與乙醇反應進而生成EC[43]。中國白酒釀造工藝獨特且復雜，這導致白酒中EC 的形成機制比其他蒸餾酒更為復雜。通過對白酒中EC 前體物質的變化規律進行分析發現瓜氨酸和尿素是高粱固態發酵過程中EC 形成的主要前體物質，氰化物并未參與EC 的形成[44]。目前的研究并未明確指出氰化物是白酒中EC 形成的主要前體物質，但氰化物能以不同形式參與白酒中EC 的形成，對于白酒中EC 含量變化具有一定影響。未來需要對白酒釀造原料以及不同釀造階段中氰化物的不同形式進行分析，從而對氰化物是否為白酒中EC 的前體物質進行確定，并制定相應措施對該途徑形成EC 進行控制。EC 的氰化物形成途徑如圖3所示。

2.4 EC的氨甲酰磷酸形成途徑

氨甲酰磷酸（Carbamoyl phosphate,CP）是高能磷酸化合物之一，由二氧化碳和氨消耗ATP 形成。氨甲酰磷酸主要為多種生物合成途徑提供氨甲酰基團，其中尿素的產生以及精氨酸的尿素/精氨酸途徑均有氨甲酰磷酸的身影[45-46]。研究發現，產生氨甲酰磷酸的酶有3 種，包括氨甲酰磷酸合成酶（Carbamoyl phosphate synthetase，CPS）的兩個亞型CPS-A、CPS-P 以及具有合成代謝作用的氨甲酰激酶（Carbamate kinase，CK）[47-49]。早在19 世紀，Ough 的研究就已經表明，在發酵食品中，氨甲酰磷酸鹽能夠與乙醇反應生成EC，而氨甲酰磷酸鹽的生成過程在酵母細胞中進行，主要由氨甲酰磷酸合成酶催化CO2、氨以及ATP 形成[50]。Allen 和Jones的研究表明，氨甲酰磷酸在不同pH 條件下分解產物不同：在酸性條件下(pH2.0～4.0)可水解為氨氣、正磷酸鹽，可能還有CO2；堿性條件下(pH6.0～8.0)可水解為氰酸鹽和正磷酸鹽[51]。部分發酵食品能利用氨甲酰磷酸形成EC，但在常規的酒精飲料中，氨甲酰磷酸并不是主要的EC 前體物質。目前還未有相關研究報道氨甲酰磷酸是白酒中EC 形成的主要前體物質，僅有部分研究顯示氨甲酰磷酸參與白酒中EC 的形成。且由于我國白酒釀造工藝復雜，整個釀造過程受多因素調控，白酒中氨甲酰磷酸的EC 形成途徑仍需進一步研究。EC 的氨甲酰磷酸形成途徑如圖4所示。

圖4 EC的氨甲酰磷酸形成途徑

3 影響白酒中氨基甲酸乙酯形成的因素

與其他蒸餾酒相比，中國白酒的發酵工藝更為復雜，且不同香型白酒的釀造方法以及各地區生態環境不同引起的微生物差異導致我國白酒釀造工藝具有獨特且復雜的特性。雖然不同香型的白酒原料和釀造方法不同，但其前體物質是相同的，EC生產機理可能相似。根據白酒釀造時間不同，分別對發酵期、蒸餾期以及貯存期影響白酒中EC 形成的因素進行探討，可以明確白酒釀造各個階段中EC 形成原因，白酒企業可結合生產實際情況形成EC 有效調控措施，對促進我國白酒行業有序良性發展具有重大意義。

發酵期：白酒釀造原料豐富多樣，其中濃香型、醬香型白酒需要的原料更加復雜，導致原料中帶入的EC 前體物質含量相對增加。其次，發酵過程中溫度、時間、pH 值、乙醇含量以及微生物種群差異均會影響白酒中EC 的生成。研究顯示，在醬香型白酒生產過程中，EC 含量在原料的高溫堆積和發酵過程中不斷增加，且越接近發酵后期，EC 形成速率越快；芝麻香型白酒的EC 變化與醬香型白酒相似，但EC生成率比醬香型白酒高3倍[52]。另一項研究表明，釀造3 個月至1 年的濃香型、醬香型、混合香型白酒中EC 的含量高于釀造1 個月的清香型和米香型白酒[53-54]，表明在發酵過程中EC的生成受發酵溫度、發酵時間的調控。此外，Arena[37]發現乙醇含量和pH 會影響精氨酸和瓜氨酸的代謝，進而影響EC 的形成。隨著研究的深入，越來越多的研究者發現微生物也是影響酒中EC 含量不可忽視的因素[55]。

蒸餾期：EC 的沸點高達184 ℃，但我國白酒蒸餾溫度為100 ℃，因而在白酒蒸餾初期，由發酵階段帶入的EC含量相對較少，蒸餾階段EC主要依靠以乙醇為主的混合溶液中EC 前體物質在高溫條件下與乙醇反應形成。有研究顯示，白酒蒸餾前期EC 來源于發酵階段帶入，蒸餾后期EC 來源于其前體物質與乙醇反應生成[56]。此外，Fang[33]發現由于瓜氨酸沸點低于尿素，其在白酒蒸餾過程中更易影響EC 含量。此外，氰醇可在60 ℃左右條件下分解為氰化物，蒸餾過程中的氰化物可生成氰酸鹽，其與乙醇反應可生成EC。

貯存期：我國白酒貯存過程中EC 形成主要取決于貯存溫度、前體物質、貯存時間等。張瑩等[57]的研究表明，貯存溫度是短期內影響白酒基酒中EC含量變化的主要原因之一；對黃酒和葡萄酒的研究表明，EC生成速率隨貯存溫度的升高而加快[53]。除貯存溫度以外，貯存過程中EC 前體物質含量也是影響白酒貯存過程中EC 的主要原因，研究發現不同貯存年限濃香型白酒基酒中EC 含量增加的同時，尿素及瓜氨酸的含量降低，且EC含量變化與尿素、瓜氨酸含量變化具有顯著相關性[35]；Fang[33]的研究證實尿素是白酒基酒貯存期EC 形成的關鍵前體物質。此外，張順榮[58]發現白酒貯存時間也會影響EC 的生成，且經線性擬合及相關性分析發現氰化物是白酒貯存過程中EC 的最主要前體物質。由此可見，目前關于白酒貯存過程中EC 主要前體物質的結論并不統一，后期可加大對白酒基酒貯存期間EC形成機制的研究，為制定合理控制白酒EC含量的措施提供理論基礎。

根據已有研究以及EC 的形成途徑可對白酒釀造不同階段影響EC 形成的因素進行區分，對白酒實際生產具有指導作用。對白酒中EC 含量的控制，首先應對原料中不同的前體物質進行檢測并確定其含量，并根據實際生產情況調整原料配比；其次，對發酵體系中氮源、碳源進行調控，確定微生物的種類及不同發酵時間段中優勢菌群的變化規律，進一步分析不同前體物質作用階段以及明確EC 生成的主要途徑；最后，對蒸餾階段及貯存階段不同生產條件下EC 的含量以及前體物質含量變化規律進行分析，根據實際情況調整生產工藝，進而降低白酒中EC的生成。

4 總結與展望

酒精飲料中EC 污染普遍存在，我國黃酒及白酒的EC 暴露風險明顯高于其他酒精飲料。我國在2012 年才開始對酒精飲料中的EC 污染給予重視，目前仍然處于初步研究階段。近年來白酒在我國酒精飲料市場上的占比逐漸增大，白酒食品安全顯得尤為重要。明確白酒中EC形成機制、影響因素，白酒企業可根據實際生產情況，尋找有效控制EC的方法以及制定相關標準，以保證我國白酒產業持續健康發展。

國內外對發酵酒和部分蒸餾酒中EC 的形成途徑及控制方法進行了相對全面的研究，由于白酒生產的獨特性和復雜性，白酒釀造過程中EC 形成機理及控制措施等研究依然處于起步階段，未來可著重研究以下兩方面：首先，對白酒釀造過程不同階段EC 形成途徑進行全面且深入的研究，明確不同前體物質、釀造工藝等對EC形成的影響，為探索相應的EC控制措施提供數據支持；其次，完善白酒中EC 風險評估方法，應進行相關毒理學研究，了解機體EC 攝入量及表征反應等關系，從而開展人體腫瘤風險預測，形成科學的EC風險評估體系，并為我國建立酒精飲料中EC 限量標準提供理論基礎，為白酒安全管理提供指導依據。