基于CRITIC法優化大葉冬青瞬時高溫滅菌工藝

關鍵詞：大葉冬青；瞬時高溫滅菌；正交設計；抗氧化活性；多酚類化合物；皂苷類化合物

doi：10.13304/j.nykjdb.2023.0055

中圖分類號：S567.1 文獻標志碼：A 文章編號：10080864（2023）12020511

大葉冬青（Ilex latifolia Thunb.）為冬青科冬青屬常綠喬木[1]，其葉可作為代茶飲用[23]，主要含有多酚、三萜、三萜皂苷和黃酮等化學成分[4]，具有抗氧化、降血脂、降血糖、抗腫瘤、抗菌、消炎等作用[5-8]。大葉冬青中的多酚不同于傳統意義上的茶多酚，主要是咖啡?？鼘幩犷惢衔锖忘S酮類化合物[9]。

中藥生粉在入藥前難免存在細菌、霉菌或其他致病菌[10]，《藥品生產質量管理規范》規定，入藥前的中藥生藥粉需滿足微生物限度要求。目前，實際生產采用的滅菌方式有干熱滅菌、濕熱滅菌、環氧乙烷滅菌、⁶⁰Co-γ 輻照滅菌、乙醇蒸汽滅菌等[1112]，這些方式均存在不同程度的缺點和問題。干熱滅菌時間較長易破壞藥物的有效成分，影響療效；濕熱滅菌后藥物易板結成塊，影響使用；環氧乙烷滅菌存在有機溶劑殘留；⁶⁰Co-γ輻照滅菌會存在放射性殘留；乙醇蒸汽滅菌能耗大、時間長，影響經濟效益[13]。瞬時高溫滅菌（high temperatureshort time，HTST）是利用直接蒸汽或熱交換器，使食品、藥品等在150～180 ℃滅菌幾秒至十幾秒[14]。該技術最重要的優點是高溫下滅菌時間極短、滅菌效率高，無環境污染[15-17]。國家藥監局將已上市中藥藥材粉末增加瞬時高溫滅菌的變更列為中等變更[18]，但需要重點對其活性成份或指標成份含量等是否產生明顯影響進行考察。

中藥化學成分復雜，滅菌工藝若僅以微生物水平為考察指標進行篩選，不能體現滅菌對中藥藥效物質基礎及活性的影響。尚海賓等[19]研究表明，瞬時高溫滅菌在達到滅菌效果的同時對黃芩質量無影響，但其僅以黃芩苷進行質量評價，未進行多指標全方位評價。為使瞬時高溫滅菌技術在中藥生產領域更大范圍的應用，本研究以大葉冬青干燥葉為原料，首次采用瞬時高溫滅菌技術結合正交設計多指標綜合評分法優化滅菌工藝參數，以微生物水平及多酚類、皂苷類化合物含量和大葉冬青1，1-二苯基-2-苦基肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除率為考察指標，多維度評價瞬時高溫滅菌工藝對大葉冬青生粉質量的影響，為其在中藥生產中的廣泛應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

大葉冬青采自浙江省新昌縣，共采集樣品10批，由吉林農業大學的田義新教授鑒定為冬青科冬青屬植物大葉冬青（Ilex latifolia Thunb.）。

試驗對照品蘆?。?2.6%，YDRJ-AVZX）購自中國藥品檢定研究所；綠原酸（RFSL00701908029）、新綠原酸（RFS-X01401903029）、隱綠原酸（RFS-Y06701903029）、異綠原酸A（RFSY06801911011）、異綠原酸B（RFS-Y06911801005）、異綠原酸C（RFS-Y07011805016）、咖啡酸（RFSK00311812016）、對羥基肉桂酸（RFSD03911804026）的純度均大于98%，購自成都瑞芬思生物科技有限公司；大葉冬青皂苷C、大葉冬青皂苷A、大葉冬青皂苷F、大葉冬青皂苷H、苦丁冬青皂苷E、苦丁冬青皂苷F均為實驗室自制，經高效液相色譜（high performance liquidchromatography， HPLC）檢測質量分數均大于98%；無水乙醇、甲醇、磷酸為分析純，購自北京化工廠；1，1-二苯基-2-苦基肼（DPPH）購自上海麥克林生化科技有限公司；乙腈為色譜純，購自安徽天地高純溶劑有限公司。

1.2 儀器與設備

LC-20A 高效液相色譜儀：日本島津公司；BT25S型十萬分之一電子天平：德國賽多利斯科學儀器有限公司；UV-1801紫外分光光度計：北京瑞利分析儀器公司；KQ-500E超聲清洗儀：昆山市超聲儀器有限公司；FW177型高速萬能粉碎機：北京市永光明醫療儀器廠；WS-FMD15過熱蒸汽瞬時滅菌系統：長春鉆智制藥有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 瞬時高溫滅菌工藝優化 采用正交試驗法，應用3因素3水平正交表，考察滅菌溫度、滅菌時間、粉碎粒度3種因素，每因素設置3個水平。中國藥典中1～5 號篩的目數分別為10、24、50、65、80目，因此選擇藥材粉碎粒度為24（粗粉）、50（中粉）和80目（細粉）。以滅菌率為評價指標，各因素水平表如表1所示。

根據第1次正交試驗結果，對滅菌溫度進一步優化，將其調整為160、170、180 ℃，其他因素水平不變。以滅菌前后大葉冬青多酚類含量、皂苷類含量及DPPH·自由基清除率為評價指標，按照3因素3水平（L9）33正交表設計正交試驗，篩選出最佳滅菌工藝。

1.3.2 樣品制備 取大葉冬青分別粉碎成24、50、80目的顆粒，備用。采用PE自封袋分裝不同粉碎粒度的藥材，共9袋，每袋約200 g，根據正交因素水平表對9袋樣品進行瞬時高溫滅菌，滅菌后立刻用無菌采樣袋密封，用于微生物限度檢查及分析。

1.3.3 微生物限度檢測 取滅菌前、后樣品各10 g，加入pH 7.0 的無菌氯化鈉蛋白胨緩沖液100 mL 混勻，即為1∶10 供試液，依次進行10、100、1 000倍系列稀釋。采用微生物計數法[20]測定需氧菌、霉菌、酵母菌、大腸埃希菌、沙門菌及耐膽鹽革蘭陰性菌總數。

菌落總數=細菌總數+霉菌及酵母菌總數 （1）

滅菌率=滅菌前菌落總數- 滅菌后菌落總數/滅菌前菌落總數 （2）

1.3.4 多酚類化合物含量測定及HPLC指紋圖譜的建立 按照王存琴等[21]方法進行檢測。HPLC指紋圖譜的檢測方法和多酚類化合物含量測定方法相同。

①對照品溶液的制備。分別精密稱取蘆丁、綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C、咖啡酸、對羥基肉桂酸、異槲皮素10種對照品5.05、4.92、4.95、4.96、4.97、4.95、4.97、4.98、5.00、5.00 mg，置于10 mL量瓶中，加50%甲醇至刻度，超聲處理使其溶解，搖勻；再精密吸取1 mL，置于10 mL 量瓶中，加50% 甲醇稀釋至刻度，搖勻，過0.22 μm微孔濾膜，制成對照品溶液的質量濃度分別為0.050 5、0.049 2、0.049 5、0.049 6、0.049 7、0.049 5、0.049 7、0.049 8、0.050 0、0.050 0 mg·mL-1，于4 ℃冷藏保存。

②供試品溶液的制備。取正交試驗9組及未滅菌樣品粉末各1 g，精密稱定，分別置于50 mL量瓶中，加70% 乙醇超聲提取30 min后，加70%乙醇定容至刻度，搖勻，過0.22 μm微孔濾膜，即得正交試驗供試品溶液。取按最佳滅菌工藝處理的9批樣品及未滅菌的樣品，按上述方法操作，即得最佳工藝驗證供試品溶液。

③ HPLC 色譜分析。采用Agilent HC-C18（4.6 mm × 250 mm，5 μm）色譜柱；流動相為0.2%磷酸乙腈（A）、0.2%磷酸水（B）進行梯度洗脫。柱溫40 ℃，流速1.0 mL·min^-1，檢測波長320 nm，進樣量10 μL。洗脫程序為：0—16 min 25%～41% A；16—30 min 46% A；30—31 min 50% A；31—55 min50% A。

④多酚類化合物含量測定。分別精密吸取對照品溶液與正交試驗供試品溶液10 μL，注入液相色譜儀測定，按公式（3）計算10種多酚類化合物的含量。

⑤HPLC指紋圖譜的建立。分別將采用最佳滅菌工藝處理的9 批樣品及未滅菌的樣品溶液10 μL注入液相色譜儀，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》（2012 版）軟件進行處理，得HPLC指紋圖譜。

1.3.5 皂苷類化合物含量測定及HPLC指紋圖譜的建立 按照姚蘭等[22]方法進行檢測，并對文獻方法開展了方法學研究。HPLC指紋圖譜的檢測方法和皂苷類化合物含量測定方法相同。

①對照品溶液的制備。分別精密稱取大葉冬青皂苷C、大葉冬青皂苷D、大葉冬青皂苷F、大葉冬青皂苷H、苦丁冬青皂苷E、苦丁冬青皂苷F適量置于5 mL量瓶中，用甲醇配成含大葉冬青皂苷C 347 μg·mL^-1、大葉冬青皂苷D 170 μg·mL^-1、大葉冬青皂苷F 220 μg·mL^-1、大葉冬青皂苷H 168 μg·mL^-1、苦丁冬青皂苷E 190 μg·mL^-1、苦丁冬青皂苷F 80 μg·mL^-1的混合對照品溶液，4 ℃冷藏保存備用。

②供試品溶液的制備。根據正交試驗設計，精密稱定，9組及未滅菌樣品粉末各1 g，分別置于50 mL 容量瓶中，加70% 乙醇超聲提取1 h，加70% 乙醇定容至刻度，搖勻，過0.22 μm 微孔濾膜，即得正交試驗供試品溶液。取按最佳滅菌工藝處理的9批樣品及未滅菌的樣品，按上述方法操作，即得最佳工藝驗證供試品溶液。

③HPLC 色譜分析。譜柱為XDB-C18 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈（A）水（B），二元梯度洗脫條件：0—15 min，15% A；15—65 min，15%～42% A；65—72 min，42% A；體積流量為1.0 mL·min^-1；柱溫35 ℃，檢測波長210 nm，進樣量5 μL。

④皂苷類化合物含量測定。分別精密吸取對照品溶液與正交試驗供試品溶液5 μL，注入液相色譜儀，測定6種皂苷類化合物的含量。

⑤HPLC指紋圖譜的建立。取最佳工藝滅菌的9批及未滅菌大葉冬青樣品溶液5 μL，注入液相色譜儀，測定，即得HPLC圖譜，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2012 版》軟件進行處理，建立HPLC指紋圖譜。

1.3.6 滅菌前后大葉冬青抗氧化活性測定 ①供試品溶液的制備。分別精密稱取滅菌前、后大葉冬青粉末0.6 g，置于250 mL具塞錐形瓶中，加入70%乙醇溶液200 mL，稱定質量，80 ℃超聲提取50 min，冷卻后稱量，加70%乙醇溶液補足損失質量，搖勻，過濾，精密量取濾液100 mL，水浴蒸干，70%乙醇溶解，定容至50 mL量瓶中，作為大葉冬青樣品溶液，質量濃度為6.0 g·L^-1。

②抗氧化能力的測定。按照王存琴等[23]方法，配置0.1 mol·L^-1的DPPH·乙醇溶液，測定抗氧化活性。DPPH自由基清除能力的計算公式如下。

式中，Mi為加入6.0 mL DPPH·溶液的大葉冬青提取液在517 nm波長處的吸光度值；Mj為用無水乙醇代替DPPH·乙醇溶液測得的吸光度值；M0為用50%無水乙醇代替樣品測得的吸光度值。

1.3.7 指標權重的確定 采用綜合加權法，通過歸一化處理，去除數據的單位限制。同時由于權重分析法（criteria importance though intercrieriacorrelation，CRITIC）更適用于指標間具有相關性的數據[24]，而大葉冬青中DPPH 自由基清除率與多酚類、皂苷類化合物含量相關，故采用CRITIC法。通過SPSSAU軟件將數據進行歸一化處理并進行CRITIC分析，確定指標多酚類化合物含量、皂苷類類化合物含量、DPPH自由基清除率的權重系數，并根據權重系數計算綜合評分[25]。

1.4 數據分析

采用Excel軟件計算多酚類、皂苷類化合物含量和抗氧化活性、DPPH 自由基清除率；采用SPSS 25.0軟件進行試驗數據的方差分析、T 檢驗；采用SPSSAU軟件進行CRITIC綜合加權分析；采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）建立HPLC指紋圖譜。

2 結果與分析

2.1 瞬時高溫滅菌對滅菌率的影響

由表2和3可知，各因素對大葉冬青瞬時高溫滅菌率的影響表現為滅菌溫度（A）gt;滅菌時間（B）gt;粉碎粒度（C）。方差分析結果表明，滅菌溫度對滅菌率有顯著影響。當滅菌溫度為140 ℃時，滅菌率相對較低；當滅菌溫度為160和180 ℃時，滅菌率相對較高，但二者相差20 ℃，為了獲得更準確的滅菌溫度，對滅菌溫度進一步優化，水平調整為160、170、180 ℃，其他參數及水平不變，再進行試驗。

2.2 瞬時高溫滅菌對樣品微生物水平的影響

對9組滅菌樣品和未滅菌樣品進行微生物限度檢測，在未滅菌樣品中菌落總數為6.8×10⁴ CFU·g^-1，霉菌酵母菌為3×10⁴ CFU·g^-1，耐膽鹽革蘭陰性菌數量為10²～10³，且檢測出大腸埃希菌和沙門菌，耐熱菌未檢出；而在滅菌后的9 組樣品中，需氧菌、霉菌、酵母菌、耐膽鹽革蘭陰性菌、大腸埃希菌和沙門菌均未檢出。由此表明，滅菌后大葉冬青的微生物水平符合藥典規定，瞬時高溫滅菌技術可有效殺滅大葉冬青中的微生物。

2.3 瞬時高溫滅菌對多酚、皂苷類化合物含量的影響

根據多酚類化合物對照品的保留時間，結合色譜峰的紫外譜圖（圖1），鑒定出樣品中含有新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、對羥基肉桂酸、蘆丁、異槲皮素、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C共10種多酚類化合物及大葉冬青皂苷F、大葉冬青皂苷H、大葉冬青皂苷C、苦丁茶冬青皂苷E、大葉冬青皂苷D、苦丁冬青皂苷F共6中皂苷類化合物。9組滅菌樣品的多酚、皂苷類化合物含量如表4和表5所示，不同樣品中多酚和皂苷類化合物含量差異較小。

2.4 瞬時高溫滅菌對大葉冬青DPPH 自由基清除率的影響

經瞬時高溫滅菌處理后，大葉冬青1～9號樣品的吸光度值分別為0.151、0.149、0.145、0.146、0.151、0.201、0.183、0.151、0.137，DPPH 對照試驗組吸光度值為0.989，因此DPPH自由基清除率分別為88.07%、88.17%、89.28%、89.48%、89.08%、87.42%、85.54%、88.78%、90.80%。

2.5 CRITIC 綜合加權優化大葉冬青滅菌工藝參數

通過SPSSAU軟件進行CRITIC分析，得多酚類化合物含量、皂苷類類化合物含量、DPPH自由基清除率的權重系數分別為25.78%、47.22%、27.00%。以綜合評分值進行直接觀察及方差分析，結果如表6和7所示。各因素對試驗結果均無顯著性影響，3個水平均可選擇。在保證滅菌效果的前提下，滅菌溫度原則上選擇較低溫度，故最佳滅菌工藝為滅菌溫度160～170 ℃。滅菌時間10 s，粉碎粒度不大于24目。

2.6 最佳工藝條件的驗證

以最佳滅菌工藝條件處理3 批大葉冬青樣品。進行微生物限度、多酚類、皂苷類化合物含量測定及DPPH 自由基清除率測定，結果如表8所示。滅菌后，樣品中需氧菌、霉菌、酵母菌、耐膽鹽革蘭陰性菌、大腸埃希菌和沙門菌均未檢出。樣品抗氧化活性與化合物含量均未發生明顯變化（表9），符合藥典規定，表明優化后的工藝合理可行，可操作性強。

2.7 大葉冬青滅菌前后多酚、皂苷類化合物的HPLC 指紋圖譜

2.7.1 多酚類化合物HPLC指紋圖譜 對最佳工藝滅菌的9批樣品及未滅菌大葉冬青對照建立指紋圖譜，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2012版》軟件，利用中位數法進行多點校正、自動匹配（時間窗寬度為0.10），對比混合對照品的HPLC譜圖，確認10個色譜峰（圖2），分別為新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、對羥基肉桂酸、蘆丁、異槲皮素、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C。將9批滅菌處理的樣品指紋圖譜與未滅菌樣品對照指紋圖譜進行比較，分別計算相似度，結果均大于0.9，表明滅菌前、后大葉冬青的圖譜整體相貌相同，化學物組成一致性較好，質量穩定。

2.7.2 皂苷類化合物HPLC指紋圖譜 建立優化后最佳工藝滅菌9批樣品皂苷類化合物的指紋圖譜，以相對保留時間為標定，對比混合對照品的HPLC譜圖，鑒定出6個色譜峰，分別為大葉冬青皂苷F、大葉冬青皂苷H、大葉冬青皂苷C、苦丁茶冬青皂苷E、大葉冬青皂苷D、苦丁冬青皂苷F（圖3）。比較滅菌前、后，大葉冬青樣品皂苷類化合物指紋圖譜的相似度均大于0.9。由此表明，滅菌前后大葉冬青皂苷類化合物的圖譜整體相貌相同，化學組成一致性較好，質量穩定。

3 討論

粉末粒度影響滅菌效果[26]，而瞬時高溫滅菌主要針對藥材粉末進行滅菌，因此本研究將粉碎粒度作為影響因素進行正交設計，并根據瞬時高溫滅菌的特點和大葉冬青藥材的理化性質選擇微生物水平及多酚類、皂苷類化合物含量和DPPH自由基清除率多個指標，采用CRITIC法確定指標權重，優化后的瞬時高溫滅菌工藝更為合理。

未滅菌的大葉冬青微生物水平嚴重超過相關規定，而在滅菌后的大葉冬青中需氧菌、霉菌、酵母菌、耐膽鹽革蘭陰性菌均未檢出；且與滅菌前比較，滅菌后多酚類化合物含量平均增加0.16%，皂苷類化合物含量平均增加0.01%，DPPH自由基清除率平均增加1.18%。這可能與滅菌后水分減少，從而使有效成分相對含量增加有關。瞬時高溫滅菌工藝在160～170 ℃、10 s就可有效地殺滅大葉冬青中的細菌、霉菌、酵母菌和致病菌，且對多酚類、皂苷類化合物含量和DPPH·抗氧化活性無顯著影響。因此，瞬時高溫滅菌適合大葉冬青的滅菌處理，在中藥生產領域有著廣泛應用前景。

（責任編輯：張冬玲）