基于土地整治復墾耕地土壤微生物群落結構和多樣性分析

關鍵詞：土地整治；復墾耕地；細菌；真菌；群落多樣性

我國是人口大國，人均耕地資源非常有限，隨著城鎮化的加快，建設用地與耕地矛盾突出，土地整治逐漸成為國土空間生態修復的重要抓手與手段。隨著近年來我國生態文明建設的加強，國家逐漸將生態建設納入到國土規劃戰略中[1]。為保障我國糧食和生態安全，農村土地整治已在全國大范圍內開展。早期農村土地整治活動的目標大多聚焦于擴大農用地的覆蓋面，以增加農作物的產出為目標，隨著農業基礎理論研究的逐步深化以及對國家農業有關政策法規更加具體詳細的指導，農村土地整治活動中也將調節土地權屬關系，保障農村生態環境，推動經濟社會的和諧發展等因素列入了考量范圍[2]。上海既是國際性大城市，但同時又面臨著應對資源環境的緊制約、城市轉型發展等壓力，通過十多年的創新和實踐，上海探索完善了鄉村地區以郊野單元村莊規劃為管理依據，以低效建設用地減量為核心抓手，以全域土地綜合整治為實施平臺，覆蓋全域、全地類、全過程國土空間用途管制的空間治理模式[3]。目前，我國對土地整治活動的耕地質量評估主要是以耕地質量等別評估為主，人們往往根據一種土地功能而進行了大量的指標和評估工作，而忽略了其它土地功能，而且評估指標大多聚焦于化學和物理要素，生物指標研究較少。

隨著人們對生態文明的關注及以對綠色生態農業的需求，土地整治活動對耕地生態環境質量影響的評價方法正在不斷完善。進入21 世紀之后，隨著生物技術和生物信息學用于環境基因組的深入研究，人類逐漸意識到土壤生物多樣性的重要性，土壤生物被當作土壤質量重要的評價指標[4-5]。近年來，研究者們圍繞環境生態學方面開展了大量科研實驗與篩選，內容涉及環境微生物、微食物網、蚯蚓數量、微生物生物量碳氮、土壤呼吸、土壤活性碳結構、β- 葡萄糖苷酶活性功能和土壤蛋白含量，可用作評價土壤健康狀況[6-8]。土壤微生物生物量碳氮等指標可以反映土壤的生物活性，但在評價時采用衍生熵值指標，如微生物熵更能反映土壤過程或土壤質量的變化[9]。

土壤微生物包括細菌、真菌、病毒、藻類及原生生物等，都是土壤生物的重要組成部分，它們在土壤結構、物質循環和肥力變化規律等過程中發揮著非常重要的作用，成為關鍵指示生物[10-11]。土地利用途徑的改變，如土地復墾、土壤培肥等措施能夠改變生態系統結構過程，進而改變了土壤的理化特性[12-13]，驅動土壤微生物群落結構組成和多樣性產生變化。土壤微生物世代時間較短，受環境影響比較大，可以作為土壤健康生物學重要指標。目前科研人員已篩選出多個微生物指標表征土壤健康和生態功能，如土壤土壤酶活性、微生物群落多樣性、微生物生物量碳氮、土傳病害病原菌數量、土壤微生物相關性網絡和關鍵物種豐度等指標。林耀奔等[14] 指出：土地整治區域通過耕地土壤培肥和合并地塊，土壤細菌和真菌多樣性顯著提高，耕地土壤質量得到明顯改善。施昊坤等[15] 研究證明：土地整治可改善耕地土壤微生物的結構和功能，降低土壤中變形菌門的相對豐度，同時提高酸桿菌門和綠彎菌門的相對豐度，并且提高鞘脂單胞菌屬和地桿菌屬關鍵種屬的相對豐度。土壤微生物是認識其環境特性的基礎，評價土地健康狀況、科學使用土壤資源、推動區域土地生態系統可持續開發的重點[16]。研究土地整治中影響耕地質量的微生物指標，不僅可以豐富農村土地整治項目績效評估指標維度，讓項目整體績效獲得較為全面的評估，關鍵的是能夠引起項目建設單位、項目執行單位和其他利益相關者對土地生態價值問題的共同關注，更有利于政府今后對項目的有效管理和跟蹤監督。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗地位于上海市松江區新浜鎮土地整治區域，該區域屬于北亞熱帶季風氣候區域，全年溫暖濕潤，日照充沛，雨水充足，無霜期較長，適宜栽種水稻、三麥、油菜、棉花等各類農作物。年平均降水量為1226.8 mm，6—7 月間有梅雨期，約20 天。夏秋季有臺風過境，偶有龍卷風、冰雹。秋冬有霧。土地整治始于2016 年，凈增加耕地總面積46.45 hm2，其中，通過住宅用地整理復墾可增加耕地45.29 hm2；通過坑塘水面整理可增加耕地5.90hm2。項目區土地平整工程采用完全平整方式，平整后地面坡度與灌溉方向一致，以耕作田塊作為一個基本平整單元，平整單元內部高程原則上要求一致，允許有一定高差但小于5 cm。當平均挖深小于20 cm 時，表土與底土一并平整，不單獨進行表土剝離回填；當平均挖深大于20 cm 時，先移走表層熟土，完成設計的挖、填土方以后，再把熟土層回填覆蓋。

本研究分別選取坑塘填埋復墾（XZ1）和宅基地復墾（XZ2）兩處具有代表性的新增耕地。質量建設耕地（ZL）為項目區內因農田水利設施建設等導致質量發生變化的原耕地，作為對照點。水稻品種為松香粳1018，2020 年5 月份移栽，10 月份收獲，種植方式為上海市郊區農民常規水稻種植和管理模式，施用化學肥料和使用普通化學農藥防治病蟲害。

1.2 土壤采集

2021 年1 月21 日，選取復墾的新增耕地（XZ1、XZ2）和質量建設耕地（ZL）進行土壤布點采樣，從水稻收獲后的表層土壤中，用五點取樣法采集土壤樣本。將所有土壤樣品放入無菌密封塑料袋中，并用裝有液態氮的冰箱運回實驗室。每個土壤樣本分為兩部分，一部分使用液氮速凍，經過冷凍干燥機凍干，然后研磨過2mm 篩，并且儲存在-80℃醫用冰箱，用于DNA 提取；另一部分土壤樣本經室溫風干，研磨通過2 mm 篩置于常溫，用于研究分析土地整治后耕地的土壤理化性質，包括土壤pH、全氮（TN）、陽離子交換量（CEC）和堿解氮（AN）、有效磷（AP）、速效鉀（AK）和土壤有機碳（SOC）含量。

1.3 DNA 提取

每份土壤樣品取研磨過篩的凍干土0.2 g，通過商品化土壤試劑盒E.Z.N.A.? 測定用試劑盒抽取的土壤中總DNA，并利用NanoDrop 2000 對DNA 進行定量分析和純度檢測，使用1% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 基因組片段質量，在-20℃冰箱儲存以進行后續測試。

1.4 土壤中細菌、真菌的熒光定量分析

以稀釋后的適當含量的土壤中全基因組DNA為模板， 細菌16S rRNA 的V3-V4 區域引物為F341（5'-CCTAYGGGRBGCASCAG-3'） 和R806（5'-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3'）[17]，真菌ITS1 區域引物ITS-1F（5'-CTTGGTCATTTAG AGGAAGTAA-3'）和ITS-1R（5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'），PCR擴增25 μL 體系包含2×ChamQ SYBR Col or qPCRMaster Mix，1 μL 標準品溶液或待檢測 DNA 模板，正向和反向引物（10 mM）各1 μL，雙蒸水 9.5 μL。細菌基因組實時熒光定量反應條件設置為：95 ℃ 3 min；95℃ 5s ，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min（40 個循環）。真菌基因組實時熒光定量反應條件：95 ℃ 3min；95 ℃ 5s，62 ℃30s，72 ℃ 1 min（40 個循環）。所有空白對照為雙蒸水，所有樣本均三次重復。

1.5 Illumina 第二代高通量測序（NGS）

使用的擴增引物同上一節中帶有標簽的引物。采用高保真酶進行土壤基因組PCR 擴增，細菌和真菌PCR 反應體系均為5 0μL，包含Phusion Master Mix 15 μL、Primer（F/R）1.5 μL、gDNA 10 μL 以及補足雙蒸水22μL，PCR 反應程序為：98 ℃ 1 min；98 ℃ 10 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s（30 個循環）；72 ℃ 5 min。檢測并純化基因擴增產物，純化后制備添加索引代碼的測序文庫。使用Qubit @ 2.0 熒光計檢測基因文庫的純度，并通過安捷倫Bioanalyzer 2100 系統質控基因文庫。最后，質檢合格后將基因文庫置于 Illumina Miseq PE300 測序平臺上進行測序分析。將測得的原始數據通過Trimmomatic 軟件程序進行質控分析，剔除不合格序列，再使用FLASH 等軟件程序將基因序列進行拼合，相似度為97% 的序列做OTU聚類分析。對每條序列進行分類注釋后將序列與Silva 數據庫（SSU123）進行物種比對。

1.6 統計分析

分析前對序列按照最小樣本序列進行抽平，使用SPSS 軟件16.0 版本進行差異性分析、顯著性檢驗（plt;0.05）和相關性分析等。使用mothur 軟件對細菌和真菌多樣性指數進行分析，然后利用R 軟件進行數據相關性分析、主成分分析、冗余度分析，繪制韋恩圖和火山圖。作圖來源于Origin8.0、R 軟件。

2 結果分析

2.1 絕對定量拷貝數

分別測定了新增耕地和質量建設耕地的土壤細菌和真菌的絕對定量。其中，新增耕地和質量建設耕地的土壤細菌絕對定量如圖 1A 所示。XZ1、XZ2 和ZL 的細菌拷貝數分別為2.43×108±2.13×107、7.48×108±2.44×108、4.37×109± 8.43×108。其中ZL 的拷貝數顯著高于 XZ1和 XZ2（p ＜ 0.05），分別為XZ2 的拷貝數顯著高于XZ1（p ＜ 0.05）。新增耕地和質量建設耕地的土壤真菌絕對定量如圖1B 所示。XZ1、XZ2 和ZL 的真菌拷貝數分別為5.20×1011±6.42×1010、1.24×1012± 7.79×1010、1.73×1012±4.62×1011（p ＜ 0.05）。通過差異性分析顯著ZL 的真菌拷貝數顯著高于XZ1 和XZ2（p ＜ 0.05），XZ2 的真菌拷貝數顯著高于XZ1（p ＜ 0.05）。

2.2 細菌和真菌群落豐富度和多樣性

本試驗分別選取具有代表性生物多樣性指數來表征土壤微生物群落的豐富程度和多樣性。選擇代表性的invsimpson 指數（逆辛普森指數） 和Shannon 指數（香農指數）指標用以反映細菌和真菌群落多樣性，通過Chao 1 指數能夠反映土壤細菌和真菌群落豐富度。細菌和真菌群落的多樣性指數如圖 2 所示。

ZL 的細菌多樣性 invsimpson 指數為 222.63，分別比XZ1 和XZ2 高40.06% 和13.62%， 但無顯著性差異（p ＞ 0.05），生態優勢度相對較小（圖2B）；XZ2 的Chao1 指數為4164.17， 分別高于XZ1 和ZL 5.75% 和4.45%，群落豐富度較高（圖2C）。

真菌多樣性方面， ZL 的 invsimpson 指數為12.01，高于XZ1 和XZ2，但無顯著性差異（p ＞ 0.05），分別為55.37% 和2.65%，生態優勢度相對較小（圖2E）；XZ2 的Chao1 指數為585.49，高于XZ1 和ZL，分別為89.19% 和41.06%，表明XZ2 的真菌群落豐富度指數高于XZ1 和ZL，群落豐富度較高（圖2F）。

2.3 細菌和真菌群落結構組成

新增耕地和質量建設耕地的細菌群落組成如圖 3A 所示。通過 16SrRNA 測序發現，樣本細菌群落中鑒定出 10個以上門：綠彎菌門（Chloroflexi）（20.61%～23.40%）、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）（15.57%～19.18%）、酸桿菌門（Acidobacteria）（6.99%～12.32%）、熱脫硫桿菌門（Desulfobacteria）（3.18%～6.75%）、Myxococcota（2.71%～3.56%）、Firmicutes（1.54%～3.78%）、Bacteroidota（2.06%～3.57%）、Nitrospirota（2.14%～3.19%）、Gemmatimonadota（2.05%～2.27%）。三個土壤樣本XZ1、XZ2 和ZL 的細菌群落結構與組成一致，相對豐度排前5 位的均為綠彎菌門、變形菌門、放線菌門、酸桿菌門和熱脫硫桿菌門。所有鑒定出來的門類不同處理之間無顯著性差異，XZ1、XZ2 的綠彎菌門相對豐度略低于ZL。新增耕地和質量建設耕地的真菌群落組成如圖3B 所示。通過ITS 測序，鑒定出6 個以上的真菌門：Ascomycota（52.94%～74.06%）、Basidiomycota（15.64%～23.75%）、Rozellomycota（0.82%～8.41%）、Mortierellomycota（1.52%～2.21%） 和Chytridiomycota（0.59%～1.35%）。XZ1、XZ2 和 ZL 的真菌群落結構和組成基本一致，其中，相對豐度較高的門均為子囊菌門（Ascomycota）、擔子菌門（Basidiomycota）、unclassified Fungi、羅茲菌門（Rozellomycota）和被孢霉門（Mortierellomycota）。XZ1 和XZ2 的擔子菌們的相對豐度顯著低于ZL，XZ1 的子囊菌門的相對豐度顯著高于ZL 和XZ2。

2.4 細菌和真菌群落結構差異性分析

由圖4 韋恩圖可知，XZ1 土壤細菌群落共鑒定出4379 個屬， 和ZL 共有298 個屬，XZ2 和ZL 共有484 個屬。ZL、XZ1 和XZ2 共有3310 個屬。XZ1 獨有240 個細菌屬，主要為Pajaroellobacter、厭氧黏細菌（Anaeromyxobacter）、乙醇產氫菌（Hydrogenispora）、厭氧黏細菌（Anaeromyxobacter）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、Ohtaekwangia、Acetobacteroides、生孢噬纖維菌屬（Sporocytophaga）以及Acetonema 等。XZ2 獨有333 個細菌屬，主要為螺旋體（Spirochaeta）、UCG-012、發酵性厭氧梭菌潛在新物種（Candidatus Soleaferrea）、生絲單胞菌屬（Hyphomonas）、脫硫念珠菌屬（Desulfomonile）、Neochlamydi、克斯氏體屬（Coxiella）、互營桿菌屬（Syntrophus）等。XZ1 和XZ2 與ZL 的細菌群落屬組成還存在一定的差異。XZ1 土壤真菌群落共有166 個屬，XZ2 共有179 個屬，ZL 共有204 個屬，三者共同有121個屬，XZ1 獨有18 個屬，暗梗穗孢霉屬（Stachylidium）、白冬孢酵母屬（Leucosporidium）、Mycoarthris、Collarina、短柄霉屬（Aureobasidium） 等XZ2 獨有20個屬，畢赤酵母屬（Pichia）、Zasmidium、淡紫字胞菌（Purpureocillium）、黃孢原毛平革菌（Phanerochaete）、紅酵母屬（Rhodotorula）、殼多胞菌屬（Stagonospora）、Oliveonia 等。XZ1 和XZ2 與ZL 的真菌群落屬組成還存在一定的差異，但是XZ1 和XZ2 的差異性較小。通過DESeq2 程序包對土壤細菌和真菌的OTUs 進行豐度差異分析，每個模式互相比較，在調整Plt;0.05 時，豐富性OTUs（eOTUs） 和消弭性OTUs（dOTUs） 分別代表新增耕地微生物增加和降低其相對豐度超過2 倍的OTUs（圖5），從圖中可以看出XZ1、XZ2 和ZL 的細菌和真菌群落變化是趨向于一致的。與ZL 相比，XZ1和XZ2 的細菌消弭性OTUs 分別為649 和483 主要來自綠彎菌門（26%）和酸桿菌門（14.0%），真菌消弭性OTUs 分別為109 和104，主要來自Ascomycota（39.5%）和unclassified-Fungi（32.0%）； 細菌豐富性OTUs 分別為618 和674，XZ1 為Hydrogenispora、Luteitalea、Anaeromyxobacter、gRB41，XZ2 為Spirochaeta、Syntrophorhabdus、Paenibacillus、Subgroup_23、Thermoanaerobaculum、Desulfobacca； 真菌豐富性OTUs 分別為130 和241，XZ1 和XZ2 為Udeniomyces、Hannaella、Vishniacozyma。

2.5 細菌、真菌的主成分分析和冗余分析

主坐標分析（PCoA）是一類非約束性的數據降維分析方法，可用PCoA 來表示微生物群落的內部組成存在的差異性或相似性。土壤細菌群落的主坐標分析（PCoA）如圖6A 所示，由圖可知細菌群落第一主坐標解釋度為30.1%，第二主坐標解釋度為18.82%，第一主成分和第二主成分之和貢獻度為48.92%，可很好地說明樣本之間的差異關系，不難發現XZ1、XZ2 和ZL 的群落結構存在較大差異。土壤細菌群落的冗余分析如圖6C 所示，通過綜合環境因子等限制性因素分析后，XZ1、XZ2 和ZL 的群落結構呈現更為顯著的差異，第一主成分解釋度為45.99%，第二主成分解釋度為21.47%，第一主成分和第二主成分之和為67.46%，解釋度較高，可發現SOC、AN、NH4+-N、AP 和CEC 為影響復墾新增耕地土壤細菌群落的重要環境因子。土壤真菌群落的主坐標分析（PCoA）如圖6B 所示，XZ1、XZ2 和ZL 的群落結構存在較大差異。土壤真菌群落的冗余分析如圖6D 所示，可知，在加入環境因子等因素后，XZ1、XZ2 和ZL 的群落結構組成呈現更為顯著的差異，第一主成分解釋度為42.37%，第二主成分解釋度為25.00%，第一主成分和第二主成分之和為47.37%，貢獻度較高，可發現AK（P=0.03）和NO3--N（P=0.02）是影響土壤真菌群落的重要環境因子。

3 討論

3.1 微生物絕對定量和群落多樣性

α- 多樣性指數可用來說明土壤中細菌和真菌群落的豐富度和多樣性。Chao1 指數的數值越大則說明土壤中微生物群落豐富度越高。Shannon 可用表示土壤中細菌和真菌群落的多樣性，數值越大則說明微生物群落多樣性越高[18-19]。本試驗中XZ2 的細菌和真菌Chao1 指數均顯著高于ZL 和XZ1（p ＜ 0.05），說明XZ2 的土壤細菌和真菌群落豐富度較高。但Shannon 指數并無顯著性差異（p＞ 0.05），說明ZL、XZ1、XZ2 三個土壤樣本之間的土壤細菌和真菌群落多樣性無顯著性差異。經過多年統一耕作，新增耕地的土壤微生物群落多樣性已經趨于質量建設耕地，而XZ2 的群落豐富度還保持著較高水平。土地整治工程能促進土壤微生物群落豐富度，通過改善土壤微生物群落功能和結構，能夠有效提高土壤地力以及促進氮碳循環，與林耀奔的研究結果一致[14]。通過土地整治的耕地可提高土壤養分和增加微生物多樣性和豐富度，改善耕地土壤生態環境質量。

3.2 微生物群落結構多樣性

XZ1、XZ2 和ZL 的土壤細菌群落組成基本一致，相對豐度較高的細菌門依次為綠彎菌門、變形菌門、放線菌門、酸桿菌門和熱脫硫桿菌門，同時可以發現通過土地整治提高了耕地土壤中綠彎菌門和酸桿菌門的相對豐度，降低了變形菌門相對豐度，這與施昊坤等[15] 研究結果一致。XZ1、XZ2 和ZL 的真菌群落組成和結構基本一致，相對豐度較高的土壤真菌門為子囊菌門和擔子菌門。作為微生物群落的重要組成，真菌能夠促進土壤中有機質循環、營養物質轉化、有毒有害物質降解和防治農作物土傳病害。土壤真菌群落多樣性是保證土地生態系統正常功能的重要前提， 和大多數淹水稻田土壤一樣，子囊菌門也是本研究中真菌優勢門[20]。XZ2 土壤中的子囊菌門相對豐度高于ZL，腐生的子囊菌能夠造成木材、糧食、布匹和皮革等的霉爛及其動植物殘體的腐爛，還可以用作抗生素、有機酸、激素、維生素制備和釀造產品中[21]。雖然在門水平的結構上無顯著差異，但群落組成還存在差異性，群落豐富度不一致。稀有物種與重要物種可能是對土壤重要功能關鍵的指示微生物，新增耕地獨有菌屬主要為厭氧黏細菌、芽孢桿菌屬、生孢噬纖維菌屬等細菌屬，為土地整治后耕地土壤功能提升相關的重要物種。研究表明厭氧黏細菌和芽孢桿菌會在生物炭改良的土壤里提高[22]，說明土地整治有效地驅動微生物變化影響土壤質量和地力。施昊坤等[15] 也指出從土壤細菌群落屬水平上來看，土地整治通過合并地塊等工程能夠提高耕地土壤鞘脂單胞菌屬、地桿菌屬的相對豐度。生孢噬纖維菌屬具有較強地降解纖維素的能力，具有提高肥力的潛力。新增耕地獨有白冬孢酵母屬、畢赤酵母屬、淡紫字孢菌、黃孢原毛平革菌等。白冬孢酵母屬可競爭性得抑制病原微生物，產生對土壤生態功能有益的代謝產物，防止產生有害物質[23]。淡紫字胞菌是植物寄生線蟲的重要天敵，對各類植物寄生線蟲蟲卵及成蟲都具有很好地防治效果[24]。黃孢原毛平革菌最主要作用就是具有降解木質素的功能[25]。總之，土地整治通過提高新增耕地獨有的有益真菌豐度來提高土壤肥力。

3.3 環境影響微生物群落

PCoA 結果表明，土地整治對復墾耕地XZ1 和XZ2的細菌和真菌群落產生了顯著影響，說明細菌和真菌群落結構與耕地土壤肥力息息相關。SOC、AN、NH4+-N、CEC 和AP 是影響土地整治后耕地土壤細菌群落的重要的環境因子，而對于土壤真菌群落，AK 和NO3--N 是主要環境影響因子。由此可見，與真菌群落相比，細菌群落在環境因素的影響下顯得更敏感，這與先前的研究高度一致[26-27]。土地整治工程，如合并地塊、田塊平整以及熟土覆蓋，被認為是導致微生物種群動態變化的主要原因，土地平整和土壤培肥等工程措施會影響耕地中土壤黏粒濃度和顆粒質量，也可能會導致土壤內含氮物質、有機質等營養元素的異質化分布，這將會影響土壤中營養元素如氮素等的異質性分布[28]，表明土地整治通過改變土壤環境驅動微生物群落產生變化，為豐富土壤細菌和真菌群落豐富度和多樣性提供驅動力。

4 結論

（1）相同土地整治措施下的土壤細菌和真菌群落組成和多樣性高度相似，土地整治措施可能會提高復墾耕地細菌和真菌群落組成和功能多樣性。

（2）通過土地整治，有助于提高土壤肥力的特定細菌和真菌相對豐度，如厭氧黏細菌、芽孢桿菌屬、生孢噬纖維菌屬等細菌屬及白冬孢酵母屬、畢赤酵母屬、淡紫字胞菌、黃孢原毛平革菌等真菌屬。

（3）SOC、AN、NH4+-N、AP 和CEC 是影響土壤細菌群落的重要環境因子，AK 和NO3--N 是影響土壤真菌群落的重要環境因子。土壤細菌種群多樣性及其組成特征與土壤整治的耕地環境因子密切有關，細菌群落對環境改變更加敏感。土地整理能夠利用整合土地資源和復墾耕地來顯著改善土地微生物多樣性和功能性。