禽偏肺病毒滅活疫苗攻毒保護效力評估實驗

摘要：為評估不同偏肺病毒疫苗和不同免疫程序對禽偏肺病毒的保護效力。本實驗采用SPF雞作為實驗雞群，將40只1日齡SPF雞平均分為4組，將2種自制的偏肺病毒滅活疫苗作為實驗樣本。21日齡進行滅活疫苗免疫，免疫21d后以4× 105.5 TCID50APV野毒進行攻毒。攻毒后觀察14 d，記錄觀察和監測臨床癥狀、采食和飲水情況、抗體水平。攻毒保護結果顯示：兩組禽偏肺病毒滅活疫苗攻毒保護效果均可達80%。

關鍵詞：禽偏肺病毒；滅活疫苗；攻毒保護

禽偏肺病毒（avian metapneumovrus，aMPV）屬于副黏病毒科肺病毒屬，感染火雞引起鼻氣管炎（turkey rhinotrachetitis，TRT）。該病主要感染雞和火雞，對雞的感染常因多種細菌和病原的混合感染，引起腫頭綜合癥（swollen head syndrome，SHS），上世紀70 年代南非首次報道了禽偏肺病毒引發的家禽發病。此后，歐洲也報道了本病，英國和法國相繼也分離到病原。1997 年，美國首次報道火雞感染偏肺病毒發病，造成巨大經濟損失。

aMPV屬副黏病毒科肺病毒亞科。根據編碼禽肺病毒G蛋白的基因不同將歐洲病毒株分為兩個亞型，即aMPV/A（英國）和aMPV/B（歐洲大陸）。1997年美國分離到aMPV/C亞型，aMPV/C 亞型喻aMPV/A 和aMPV/B 有明顯區別，而與人偏肺病毒的基因組相似。2000 年，法國首先分離到aMPV/D亞型[1]。

大多數火雞飼養的國家都有本病存在和流行，僅限于血清學檢測結果的實驗證據。目前aMPV報道有檢測到的國家有南非、歐洲大陸、美國、法國、巴西、中國、韓國、日本、以色列、約旦以及尼日利亞等國家。國內有研究人員也有對aMPV 種雞感染血清學的報道，發現種雞群中普遍存在aMPV 感染，多個雞群血清陽性率達到100%，而且開產前后或30 周齡左右易感染，抗體水平明顯升高[2]。一些雞場aMPV感染呈一過性，不便確診，但有些雞場呈典型的腫頭綜合癥狀，如雞場零星發病，雞臉、眼瞼和頭部腫脹，精神沉郁，整個頭部面部嚴重腫脹，下頜和頸上水腫，進而繼發感染，對生產成績和產蛋率造成比較大的影響。

由于aMPV對禽類危害較大，尤其是對家禽的上呼吸道健康造成比較大的威脅，容易繼發感染IBV、H9、支原體、大腸桿菌等呼吸道病原，導致雞群嚴重發病影響產蛋和體重增長，造成較大經濟損失。所以人們對該病毒的防控工作歷來都比較重視和關注。傳統活疫苗的安全性限制了其在田間的推廣和應用，針對aMPV的滅活疫苗是一個值得研究的方向和策略。本研究利用研究室自制的2種禽偏肺病毒滅活疫苗進行攻毒保護評估，結果表明2種禽偏肺病毒滅活疫苗都能夠對aMPV野毒產生80%的保護力，這為下一步規模化養禽場制定科學合理的aMPV防控措施和免疫程序提供了參考。

1 材料與方法

試驗疫苗：偏肺滅活疫苗1# 和偏肺滅活疫苗2# 為研究院自行研制。

攻毒用毒株：B型aMPV RPVA0201 株F4 代，病毒含量為105.89TCID50/0.1 mL，由瑞普生物家禽研究中心提供。

商品化SPF種蛋和SPF雞均購自北京勃林格殷格翰維通生物技術有限公司。

檢測試劑盒：禽偏肺病毒ELISA 抗體檢測試劑盒購自IDEXX公司；QiAamp viral RNA Mini kit 購自QiAamp。

試驗耗材：酒精棉、剪刀、鑷子、手術刀片、離心管、1mL 注射器均由瑞普生物動物評價中心提供。

2 實驗分組及方法

將40 只21 日齡SPF 雞隨機分成4 組，每組10 只，第1耀5 組按表1進行免疫，第6 組不免疫作對照。免后21 d采血，ELISA 檢測血清抗體；同時各組進行滴鼻/點眼攻毒，0.4 mL/只（約含4伊105.5TCID50），攻毒后第5 天各組采集咽拭子，進行PCR 檢測，活疫苗組進行病毒分離。攻毒后觀察14 d，每天觀察雞只是否有精神沉郁、采食和飲水下降、氣管啰音，打噴嚏，流鼻液，眶下竇腫脹和頸下水腫，嚴重者咳嗽、甩頭等癥狀并記錄。攻毒后第14 天進行剖檢，觀察氣管、喉頭是否有出血點及黏液；肺臟是否出現淤血、實變、萎縮等臨床癥狀。動物分組、免疫及攻毒情況見表1。

3 實驗結果

3.1 臨床觀察結果

攻毒后連續觀察14 d，第1組在攻毒后14 d內保護率為90%（9/10），其中1 只于攻毒后第5 天出現流鼻涕。第2 組在攻毒后14 d內保護率為80%（8/10），其中2 只于攻毒后第7 天出現流鼻涕。第3組在攻毒后14 d內發病率為40%（4/10），其中2只于第5天出現流鼻涕；2只于第6天在采咽拭子時喉頭有黏液。第4 組臨床無異常。

3.2 剖檢結果

攻毒后14 d剖檢，第1組保護率為80%（8/10），其中1 只喉頭氣管出現黏液，1 只肺臟出現淤血；第2 組保護率為80%（8/10），其中1 只喉頭出現黏液，1 只喉頭氣管有出血點；第3 組病變率為50%（5/10），其中4 只喉頭出現黏液，1 只出現肺臟實變；第4 組無異常。剖檢發病匯總結果見表2，剖檢病變典型照片見圖1。

3.3 不同疫苗免疫后21 d雞血清抗體測定結果

免疫后21 d采血，分離血清，并進行ELISA 抗體檢測，結果見表4。第1 組平均抗體滴度為42 446，第2 組平均抗體滴度為33480，第3 組平均抗體滴度為0，第4 組平均抗體滴度為0，第3 和第6 組抗體均為陰性。抗體檢測結果見表3。

4 結果分析

從臨床癥狀看，免疫滅活苗1# 組雞保護率為80%，免疫滅活苗2# 組雞保護率為80%，攻毒對照組發病率60%，說明滅活苗能產生一定的保護力。

從病理變化看，免疫滅活苗1# 組雞保護率為80%，免疫滅活苗2#組雞保護率為80%，攻毒對照組50%有病理變化。從抗體檢測結果看，雞免疫滅活苗后均可以產生ELISA抗體。免疫后21 d，免疫滅活苗1# 組雞平均ELISA 抗體滴度為42 446，免疫滅活苗2# 組雞平均ELISA 抗體滴度為33 480，攻毒對照組沒有檢測到ELISA抗體。

5 討論

aMPV 禽偏肺病毒已成為危害世界養禽業的重要疫病之一[3]，特別是在火雞養殖業由aMPV 引起的呼吸道疾病所造成的危害僅次于禽流感病毒，造成巨大的經濟損失。禽偏肺病毒通常可以引起雞的呼吸道感染，而且是導致肉雞腫頭綜合征的重要誘因之一[4]。有研究表明，aMPV感染雞后，可引發特異性抗體反應，但并不一定會導致發病[5]。雖然aMPV可以引起商品雞的產蛋下降和SHS的發生，但其帶來的經濟損失遠遠低于火雞。

由于aMPV對養禽業危害較大，也引起了人們對該病毒的防控工作的關注和重視。用于火雞和雞的aMPV疫苗也正在開發中。傳統的減毒活疫苗易出現病毒返強現象，有造成病毒擴散的潛在風險，滅活疫苗的研究和開發是防控aMPV 的一個重要的策略和途徑。利用研究室自制的2 種滅活疫苗進行攻毒保護評估實驗，初步實驗結果表明滅活疫苗免疫能夠產生較高的ELISA 抗體，并且對aMPV野毒都可以達到80%的免疫保護力。

雖然目前針對禽偏肺病毒感染尚無有效的治療方法，但落地的生物安全措施、科學的飼養管理及安全有效的免疫有助于防止禽偏肺病毒感染。通過我們的初步研究，對雞群進行禽偏肺病毒滅活疫苗的免疫，能夠加強對aMPV 的預防和控制，是當前規模化養殖面對aMPV的威脅可以采取的一項有效措施。

參考文獻：

[1] 沈瑞忠，曲立新，于康震，等.禽肺病毒的分離鑒定[J].中國預防獸醫學報，1999（1）：79-80.

[2] 贠炳嶺，劉在斯，吳關，等.我國部分地區種雞禽肺病毒感染的血清學調查[J].中國家禽，2012，34（12）：64-65.

[3] Cook J K.Avian pneumovirus infection of turkeys and chickens [J].VetJ，2000（160）：118-125.

[4] Banet-Noach C， Simanov L， Perk S. Characterization of Israeli avianmetapneumovirus strains in turkeys and chickens [J]. Avian Pathology，2005， 34（3）：220-226.

[5] 姜楠，姜利建，孫福亮，等.禽偏肺病毒研究進展[J].中國動物檢疫，2020，37（3）：86-91.