添加不同乳酸菌對燕麥低溫青貯發酵的影響

摘要：為了分析前期篩選出較耐低溫不同乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）對燕麥青貯發酵的影響，本試驗以‘隴燕5號’燕麥為原料，設置對照（CK）、商用菌株SLI和較耐低溫菌株OL77，OL54及OL122共5個處理，在15℃，10℃和5℃低溫下自然發酵45 d后進行營養成分、發酵品質和微生物數量的測定。結果表明：乳酸菌添加及溫度對燕麥青貯的營養成分、發酵品質、微生物數量均有極顯著影響。隨著溫度從15℃降至5℃，CK的粗蛋白（Crude protein，CP）降低了18.92%，氨態氮（Ammonia nitrogen，NH3-N）增加了58.47%；與SLI相比，耐低溫菌株OL77在提高干物質（Dry matter，DM）和CP、降低NH3-N水平方面的效果優于OL54和OL122；添加劑在各溫度處理下均提高了燕麥青貯發酵品質，15℃下添加OL77后燕麥青貯的pH值較CK和SLI分別降低了8.94%和1.57%，乳酸分別增加了79.23%和29.41%，乳酸菌數量分別增加了50.24%和15.61%。3個耐低溫菌株中，OL77總體表現最優，促進燕麥低溫發酵的效果最好。

關鍵詞：燕麥；耐低溫乳酸菌；低溫青貯；發酵品質

中圖分類號：S816文獻標識碼：A文章編號：1007-0435（2023）03-0923-06

Effects of Adding Different Lactic Acid Bacteria on Oat Silage

Fermentation at Low Temperatures

CHAI Ji-kuan， ZHAO Gui-qin*， JU Ze-liang

（College of Pratacultural Science， Gansu Agricultural University / Key Laboratory of Grassland Ecosystem， Ministry of Education，

Lanzhou， Gansu Province 730070， China）

Abstract：In order to analyze the effects of different lactic acid bacteria （LAB） with low temperature tolerance screened in the early stage on oat silage fermentation，Avena sativa ‘Longyan No.5’ was used as raw material in this experiment. Five treatments were set up，the control （CK），commercial strain SLI and the low temperature resistant strains OL77，OL54 and OL122. The nutritional components，fermentation quality，and microbial quantity of silage were investigated after natural fermentation at 15℃，10℃ and 5℃ for 45 days. The results showed that the addition of lactic acid bacteria and temperature had significant effects on the nutritional components，fermentation quality and microbial quantity of the oat silage. As the temperature decreased from 15℃ to 5℃，the crude protein （CP） of CK decreased by 18.92% and ammonia nitrogen （NH3-N） increased by 58.47%. Compared with the strain SLI，the strain OL77 was superior to OL54 and OL122 in improving Dry matter （DM） and CP while reducing NH3-N levels. The LAB additives improved the fermentation quality of oat silage among all temperature treatments. The pH value of oat silage after adding strain OL77 at 15℃ decreased by 8.94% and 1.57%，compared to CK and SLI respectively;the lactic acid increased by 79.23% and 29.41%;and the number of lactic acid bacteria increased by 50.24% and 15.61% respectively. Among those three low temperature resistant strains，the strain OL77 showed the best overall performance and had a best effect on promoting low temperature fermentation of oat silage.

Key words：Oat;Low temperature lactic acid bacteria;Low temperature ensiling;Fermentation quality

燕麥（Avena sativa L.）為禾本科燕麥屬一年生飼草作物，對冷涼氣候有獨特的適應能力，具有抗逆性強、產量高、品質好等特點［1］。燕麥既可青刈直接飼喂，也可調制成干草或青貯［2-4］。青貯和干草相比具有保存營養多、適口性好、制作簡單、儲存時間長等優點，是高寒冷涼地區燕麥調制和貯藏保存的最適宜方法［5-8］。但是高寒冷涼地區秋冬氣溫較低，面臨青貯發酵進程緩慢的問題［9-10］。乳酸菌制劑可顯著增加青貯材料中的乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）數量，在青貯發酵初期，使pH值迅速降低，從而有效抑制發酵過程中的有害微生物，改善發酵品質，保存更多營養物質［5-6，10-11］。但一般乳酸菌適宜的生長溫度為 20℃～37℃［12-13］，高寒冷涼地區燕麥在 8—9月收獲時氣溫已降至15℃以下，普通乳酸菌在這樣的低溫下活性較低，很難發揮應有的作用［11，14-15］。因此篩選耐低溫乳酸菌也許可以有效解決這一問題。崔棹茗［15］和楊曉丹［16］分別從農作物秸稈和西藏牧草青貯中篩選到適宜低溫青貯的乳酸菌，應用于燕麥低溫青貯，取得了一定了效果。Zhang等［17］將低溫下篩選出的植物乳桿菌添加到小麥秸稈青貯（32％DM）中，在5℃下發酵30 d或60 d后，發現其與商用對照菌株相比均顯著改善了青貯飼料的發酵品質。王鵬等［18］研究了乳酸菌添加劑對0℃和4℃下蘆葦草（Phagmites australis Cav. Trin. ex Sterd.）發酵質量的影響，發現低溫減緩了發酵的速度和程度，而添加6.63 lg cfu·g-1 FM乳酸菌的處理6周后已完成發酵。張淼［14］還研究了低溫下乳酸菌接種劑量對燕麥青貯發酵品質的影響，發現常溫下增加乳酸菌接種劑量對青貯品質影響不大，但低溫下則顯著提高了青貯品質。

因此，基于目前高寒冷涼地區的燕麥青貯時間長、發酵不充分的問題。篩選出耐低溫且加速燕麥青貯的乳酸菌，為不同高寒冷涼區域馴化出適應當地環境的乳酸菌，從而解決燕麥青貯時間長、發酵不充分的問題。本研究擬對這3個菌株進行測試，比較其在不同溫度下對燕麥青貯發酵的影響，篩選最適宜的菌株并為其在燕麥低溫青貯中的應用提供技術參考。

1材料與方法

1.1供試材料

供試燕麥品種：‘隴燕5號’（ Avena sativa‘Longyan No.5’），由甘肅農業大學草業學院提供。

供試菌株：課題組前期篩選的戊糖片球菌OL77、戊糖乳桿菌OL54和植物乳桿菌OL122。

1.2試驗設計

燕麥于2018年4月27日種植于通渭縣華家嶺鄉老站村，在乳熟期收獲，機械揉絲后取500 g鮮樣用于化學成分及微生物組成分析，其余用于調制青貯。設對照（CK），商業青貯添加劑Synlac I（SLI，亞芯生物科技有限公司）和篩選菌株OL77，OL54及OL122共5個處理。乳酸菌添加量均為105 cfu·g-1 FM，對照加等量清水，與青貯原料充分混勻后裝入5 L的聚乙烯桶，裝填密度為250 kg·m-3，分別貯藏于15℃，10℃和5℃的恒溫培養箱中，3次重復。45 d后采樣測定各項指標。

1.3測定內容與方法

取20 g燕麥原料加入180 mL去離子水，于4℃下浸提24 h，4層紗布過濾后測pH值。用烘箱干燥法測定干物質（Dry matter，DM）含量，凱氏定氮法定測粗蛋白（Crude protein，CP）含量；用蒽酮比色法測水溶性碳水化合物（Water soluble carbohydrates，WSC）含量［14］；中性洗滌纖維（Neutral detergent fiber，NDF）與酸性洗滌纖維（Acid detergent fiber，ADF）用Van soest法測定［20］。

采用梯度稀釋涂布法，分別用MRS培養基、普通瓊脂培養基和虎紅瓊脂培養基計數乳酸菌（LAB）、好氣性細菌（Aerobic bacteria）、霉菌（Mold）和酵母菌（Yeast）［10］，每個樣品3次重復。

青貯45 d后取樣測定各項指標。DM，CP，WSC及LAB、好氣性細菌、霉菌和酵母菌測定方法同上；氨態氮（Ammonia nitrogen，NH3-N）用苯酚-次氯酸鈉比色法測定。取20 g樣品加180 mL去離子水，4℃下浸提24 h，過濾后獲得青貯浸提液。其中一部分用于測定pH值，方法同前；用安捷倫1260高效液相色譜測定乳酸（Lactic acid，LA）、乙酸（Acetic acid，AA）、丙酸（Propionic acid，PA）和丁酸（Butyric acid，BA）含量［20］。

1.4數據處理

用Excel 2019對數據初步整理，以SPSS21.0的一般線性模型（GLM）進行雙因素方差分析（Two-way ANOVA），結合Duncan法對各處理均值進行多重比較（Plt;0.05）。

2結果與分析

2.1青貯原料的化學與微生物組成

對青貯前燕麥的化學成分及微生物數量進行了測定（表1），其DM含量為324.6 g·kg-1 FM，WSC含量為192.4 g·kg-1 DM，pH值6.13，弱酸性。附生乳酸菌數量為4.05 lg cfu·g-1 FM，好氣性細菌數量較多，為7.24 lg cfu·g-1 FM，霉菌和酵母菌數量分別為3.85 lg cfu·g-1 FM和4.88 lg cfu·g-1 FM。

2.2添加乳酸菌對燕麥低溫青貯營養品質的影響

乳酸菌添加和溫度對燕麥青貯的干物質、粗蛋白、水溶性碳水化合物和氨態氮含量影響顯著（表2）。青貯溫度和添加劑及其互作對CP，WSC及NH3-N含量的影響均達到極顯著水平（Plt;0.001）。DM含量受到的影響較小，僅添加劑的效應達到極顯著水平。

15℃下乳酸菌添加處理的DM含量顯著高于CK（表2），其中OL77處理的最高，為313.1 g·kg-1 FM，OL122次之。4個乳酸菌添加的CP含量無明顯差異，但SL1的WSC最高，為128.4 g·kg-1 DM，較OL54高7.45%。NH3-N含量以OL77處理的最低，較SL1低28.98%。

10℃下乳酸菌添加的各項指標仍顯著優于CK，CP和WSC含量極顯著高于未添加對照，而NH3-N含量則極顯著低于對照（表2）。4個添加劑中以OL77的DM，CP和WSC含量最高，NH3-N含量最低。

隨著青貯溫度進一步降至5℃，OL77和OL122的DM含量顯著高于CK和SL1，乳酸菌添加的CP和WSC含量均顯著高于CK，而NH3-N含量則顯著低于對照；其中以OL77的CP最高、OL77和OL122的WSC含量最高而NH3-N含量最低。

隨著青貯溫度從15℃降至5℃，無添加劑對照（CK）的CP含量降低了18.92%，NH3-N增加了58.47%。乳酸菌添加顯著提高了燕麥青貯的DM，CP及WSC含量，降低了NH3-N含量。5℃下各處理的DM含量與10℃下相比無明顯變化，CP含量則出現了分化，CK的CP增加了7.49%，乳酸菌添加的CP含量則較10℃下均顯著下降，其中OL54 的降幅最大（9.92%），其次為SL1（8.81%），OL77的降幅最小，為6.41%。NH3-N含量變化與CP恰恰相反，5℃下CK的NH3-N較10℃降低了7.49%，而乳酸菌添加的則增加了99.73%～197.56%。

2.3添加乳酸菌對燕麥低溫青貯發酵品質的影響

乳酸菌添加和溫度對燕麥青貯發酵品質也產生了顯著影響（表3）。青貯溫度和乳酸菌添加及其互作對所有指標的影響均達極顯著水平（Plt;0.001）。青貯飼料的pH值隨青貯溫度的降低而升高。15℃青貯時，各處理的pH值均降至4.2以下（3.77～4.14），其中OL77處理的最低（3.77）。10℃青貯時，乳酸菌添加的pH值均顯著（Plt;0.05）低于CK，其中仍以OL77的最低。5℃下，所有處理的pH值均在4.4以上，最高者達5.26（CK），青貯發酵沒有完成。

與pH值的變化相對應，青貯飼料的乳酸含量隨青貯溫度的降低而下降。15℃下各處理的乳酸含量均在62 g·kg-1 DM以上，其中OL77的高達112.2 g·kg-1 DM。10℃下仍以OL77處理的最高（Plt;0.05）。5℃下，所有處理的乳酸含量均進一步下降（Plt;0.05），含量最高的OL77處理也只有54.7 g·kg-1 DM。

乙酸含量也隨青貯溫度的降低而下降，但降幅較乳酸平緩。15℃青貯時，OL54處理的乙酸含量最高（33.4 g·kg-1 DM），其次為SLI（3.18 g·kg-1 DM），均顯著高于CK（Plt;0.05），OL77的乙酸含量最低（Plt;0.05）。10℃下的乙酸含量較15℃有明顯下降，其中OL77處理的乙酸含量最低，為13.1 g·kg-1 DM。5℃下各處理的乙酸含量以OL54最高（25.8 g·kg-1 DM），其次為SL1，OL77的仍然最低。

丙酸和丁酸含量呈相似的變化規律，除15℃外其他溫度下均未檢測出。15℃下CK的丙酸和丁酸含量較高，分別為8.4 g·kg-1 DM和5.4 g·kg-1 DM，其次為SLI，OL54處理中也有少量檢出，而OL77和OL122處理中則未檢出。

2.4添加乳酸菌對燕麥低溫青貯微生物數量的影響

乳酸菌添加和溫度對燕麥青貯的主要微生物類群數量也有顯著影響。從表4可知，青貯溫度和乳酸菌添加及其互作效應對各項指標的影響均達極顯著水平（Plt;0.001）。與乳酸含量的變化相對應，青貯飼料LAB數量隨青貯溫度的降低呈下降趨勢。15℃青貯時，添加處理的乳酸菌數量均顯著（Plt;0.05）高于CK，以OL77的為最高（9.48 lg cfu·g-1 FM），OL122次之（8.79 lg cfu·g-1 FM）。5℃下所有處理的乳酸菌數量較15℃和10℃均顯著降低（Plt;0.05），且添加處理的乳酸菌數量與CK的差值縮小，僅OL77 和OL122的乳酸菌數量顯著高于CK，SLI和OL54的對照差異不顯著。

隨著青貯溫度的下降，好氣性細菌的數量呈下降趨勢，但變幅不大（5.25～6.08 lg cfu·g-1 FM）。3個青貯溫度下均以CK的好氣性細菌數量最高，OL77處理的則始終最低（Plt;0.05）。乳酸菌添加顯著降低了霉菌和酵母菌數量（Plt;0.05）。在15℃和10℃青貯時，OL77和OL122均能很好地抑制霉菌和酵母菌生長，5℃下盡管數量有所上升，但仍為所有處理中的最低值。另外，低溫對霉菌和酵母菌的抑制作用并不明顯，15℃，10℃和5℃下青貯時，青貯燕麥中霉菌數量平均分別為2.62，2.45和3.56 lg cfu·g-1 FM，酵母菌數量平均分別為3.19，2.47和3.34 lg cfu·g-1 FM。

3討論

青貯是一個通過乳酸菌發酵來實現長期保存青綠飼料的過程。乳酸菌作為青貯發酵過程中的關鍵菌種，其最適應生長溫度一般在37℃，因此環境溫度的變化會通過影響微生物的活性進而影響發酵進程［13］。本研究中，溫度對各項（除干物質外）指標的影響極其顯著。隨著青貯溫度從15℃降至5℃，pH值從3.77～4.14增至4.40～5.26；LA含量從62.6～112.2 g·kg-1 DM降至21.1～54.7 g·kg-1 DM，AA含量從15℃下的25.5～33.4 g·kg-1 DM降至5℃下的13.7～25.8 g·kg-1 DM。Cao等［21］研究了不同季節全混合日糧（Total mixed ration，TMR）青貯的發酵質量，發現在冬季低溫條件下乳酸菌活性受到較大限制，發酵品質較差。另外，10℃和5℃下均未檢測出丁酸，這可能與低溫抑制了丁酸發酵有關［22］。

乳酸菌添加直接增加了青貯原料中乳酸菌的數量，促進了發酵進程［23］。趙牧其爾等［24］研究發現谷子青貯中單獨或混合添加乳酸菌劑可以降低其pH值并增加乳酸菌數量。本研究中加入乳酸菌制劑后，青貯飼料中乳酸菌數量較未添加對照明顯增加（表4），乳酸含量顯著升高，pH值迅速降低，進一步抑制了好氣性微生物和霉菌、酵母菌的繁殖，因為pH值降低，會影響微生物細胞膜所帶的電荷，從而引起細胞對營養物質的吸收，也會影響化合物分子進入細胞，從而影響微生物的繁殖，因此15℃和10℃下發酵品質較對照有大幅提升。但5℃下即使添加了乳酸菌且其各項指標也明顯優于CK，pH值則仍在4.4以上，LA和AA含量較低，這主要是低溫抑制了乳酸菌的生長繁殖及活性，各種生物酶活性降低，導致發酵不充分［25-26］。

乳酸菌添加的效果也受乳酸菌種類的影響。Cai等［27］研究了乳酸片球菌、戊糖片球菌和干酪乳桿菌在不同溫度下對玉米、高粱（Sorghum bicolor）、苜蓿（Medicago sativa）、意大利黑麥草（Lolium multiflorum）和羊草（Panicum max）青貯品質的影響，發現25℃下各菌株均有效改善了苜蓿和意大利黑麥草的發酵品質，但48℃下添加戊糖片球菌LS5并未起到任何作用。可見乳酸菌添加的效果在不同發酵環境下并不相同。本研究中添加劑顯著提高了燕麥青貯發酵品質，每個溫度處理下其CP，WSC，LAB和LA均顯著高于未添加對照，pH值、NH3-N含量、好氧細菌、霉菌和酵母菌數量均顯著低于對照（表2、表3、表4）。但4個乳酸菌添加之間存在顯著差異，OL77在3個溫度下表現最優，擁有最高的DM，LA和乳酸菌數量，最低的pH值，NH3-N，PA，BA和不良微生物數量；而SL1相較之下表現較差，15℃下其WSC含量顯著高于OL77，但后者的NH3-N含量卻顯著低于前者；隨著溫度進一步下降，其表現不及OL77，而且不及OL122和OL54。Liu等［28］也發現，添加戊糖片球菌、類植物乳桿菌和植物乳桿菌均顯著降低了柱花草（Stylosanthes guianensis Sw.）青貯的pH值和NH3-N含量，增加了乳酸含量，但不同菌株的發酵效果也有差異，其中戊糖片球菌SC1的表現最佳。另外，乳酸菌添加的效果還與接種劑量有關，低溫條件下增加耐低溫乳酸菌的接種劑量可顯著提高青貯品質，pH值和NH3-N含量更低，乳酸菌的數量和乳酸含量均增加，大腸桿菌被有效抑制［14］。因此在青貯生產過程中，要根據具體情況篩選最佳的乳酸菌添加以達到改善和提高青貯發酵品質的目的。

4結論

隨著青貯溫度的下降，青貯燕麥的DM，CP，WSC，LA，AC，LAB，AB呈下降的趨勢，NH3-N，pH值呈上升的趨勢。乳酸菌添加顯著提高了燕麥低溫青貯的發酵品質，其中戊糖片球菌OL77發酵的燕麥LA高于其他菌株表現最優，可用于高海拔冷涼地區燕麥青貯的調制與生產。

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（責任編輯劉婷婷）