一株產多糖真菌的篩選、鑒定與發酵條件優化?

摘 要：以馬鈴薯汁（PDA）培養基為篩選培養基，從自然界枯枝腐木中篩選產多糖真菌，經平板初篩、搖瓶復篩獲得最優菌株TL-8，胞外多糖產量達1.1 g/L。經形態觀察和分子生物學鑒定，TL-8菌株鑒定為白囊耙齒菌（Irpex lacteus）。在發酵基本培養基初始條件下，分別以培養條件（如溫度、搖床轉速、pH值、發酵時間等）和培養基成分（如氮源、碳源）作單因素優化，并根據單因素優化結果篩選影響較大的因素進行正交試驗優化，以確定白囊耙齒菌TL-8產胞外多糖的最優發酵條件。結果表明：在發酵基本培養基的基礎上，采用乳糖（12 g/L）和葡萄糖（28 g/L）作復合碳源，采用酵母膏（6.0 g/L）和豆渣粉（9.0 g/L）作復合氮源，pH值6.0，搖床轉速160 r/min，裝液量為100 mL/250 mL，培養溫度30℃的條件下培養8 d，白囊耙齒菌TL-8的生物量達15.78 g/L，胞外多糖產量達5.49 g/L。

關鍵詞：" 絲狀真菌；多糖；白囊耙齒菌；搖瓶發酵優化

中圖分類號：Q93-335 文獻標識碼：A 文章編號：1006-060X（2023）02-0001-06

Abstract： Using potato dextrose agar （PDA） as selective medium， a polysaccharide-producing strain TL-8 with a yield of 1.1 g/L"was obtained by re-screening of shaking flask fermentation after initial screening from rotton wood. Through morphological observation， molecular biology identification and phylogenetic tree construction， TL-8 was identified as Irpex lacteus. Based on initial conditions of the basic fermentation medium， its culture conditions （i.e.， fermentation time， pH value， shaking speed， and temperature） and medium components （i.e.， nitrogen source and carbon source） were optimized and screened by the single factor experiment; furthermore， the chosen parameters were subject to the orthogonal test to determine the optimal fermentation conditions of producing extracellular polysaccharide by strain TL-8. The results showed that the optimal fermentation conditions were： yeast extract 6.0 g/L+

soybean residue powder 9.0 g/L （mixed nitrogen sources）， glucose 28.0 g/L+lactose 12.0 g/L （mixed carbon sources）， potassium dihydrogen phosphate 2.0 g/L， magnesium sulfate 1.0 g/L， ferrous chloride 0.2 g/L， pH 6.0， shaking speed 160 r/min， liquid filling volumn 100 mL in 250 mL flask， incubation at 30 ℃ for 8 days， under which the yield of extracellular polysaccharide and biomass by strain TL-8 reached 5.49 g/L and 15.78 g/L， respectively.

Key words： filamentous fungi; polysaccharide; Irpex lacteus; shaking fermentation optimization

真菌多糖為天然大分子活性物質，具有抗氧化、抗腫瘤、抗病毒、抗疲勞、消炎、降血糖、降血壓以及免疫調節功能[1-3]。銀耳、香菇、平菇、靈芝、猴頭菇、茯苓、桑黃等大型真菌多糖得到廣泛深入研究[4-6]。與DNA、蛋白質等直鏈大分子相比，真菌多糖的組分及結構復雜，有支鏈特性，且分子量極大。目前，人們對真菌多糖大分子生物學特性及多樣性的認識還不全面，真菌多糖的獲取途徑主要為野生采摘提取、栽培后提取、液體深層發酵制備、人工化學合成等。其中，液體發酵可以在短時間內獲得真菌多糖[3]。為了探索真菌多糖的多樣性，筆者從自然界篩選了產多糖的真菌，擬通過液體發酵探索制備真菌多糖的可行方案。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試培養基及配方如下。（1）篩選培養基：馬鈴薯汁（PDA）培養基，121℃滅菌25 min，冷卻至60℃左右，再加入1.0 g/L硫酸鏈霉素。（2）斜面培養基：PDA斜面，121℃滅菌25 min。（3）發酵基本培養基：酵母膏1.0 g，葡萄糖2.0 g，磷酸二氫鉀0.2 g，硫酸鎂0.1 g，氯化亞鐵0.02 g，蒸餾水100 mL，裝入250 mL錐形瓶，自然pH值，8層紗布夾心棉封口，121℃滅菌25 min。培養基材料均為市售。

主要試驗試劑：工業酒精、硫酸、苯酚等常規試劑，均為國產分析純。

主要儀器設備：ZS-BRM振蕩培養箱（浙江華源儀器有限公司）、HSX-250智能恒溫恒濕箱（上海福瑪實驗設備有限公司）、U2000紫外可見分光光度計（上海佑科儀器儀表有限公司）、SX500滅菌鍋（日本tomy公司）、CR21G離心機（日本HITACHI公司）、HCF96-IIN超聲波破碎儀（天津歐諾儀器股份有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品采集 在湖南省會同縣鷹嘴界自然保護區竹坡村地界海拔600～800 m的森林中，采集長有小子實體或白色菌絲的枯枝腐木，用無菌食用菌袋封裝，帶回實驗室于4℃冰箱保存備用。

1.2.2 菌株初篩 將篩選培養基趁熱搖勻，倒平板，冷卻凝固。取玻璃珠20～30粒，投入250 mL錐形瓶，一并配制無菌生理鹽水90 mL。用無菌小刀將枯枝腐木表層樣品10～20 g削碎，投入預制無菌生理鹽水中，于200 r/min搖床中震蕩30 min，然后按十倍稀釋法稀釋至10-6。在稀釋度為10-3～10-6的樣品中，分別取0.1 mL涂布平板，每個梯度涂布3～6個平皿，于28℃恒溫培養箱倒置培養3～6 d，每天至少觀察一次，待菌落直徑大于1.0 cm時，觀察菌落形態變化，淘汰有色菌落（黑色、綠色、紅色、褐色、黃色等），選取白色絲狀菌落接種至試管斜面，于28℃恒溫培養箱培養至斜面長出菌苔，置于4℃冰箱保存備用。

1.2.3 搖瓶發酵復篩 將初篩斜面接種至發酵培養基，于28℃震蕩培養，轉速160 r/min，每天觀察菌絲體生長和發酵液色澤情況，發酵培養7 d后用定性濾紙過濾發酵液，濾液用于胞外多糖提取測定，濾渣用于胞內多糖的提取測定。選取胞外多糖產量較大的菌株，進一步發酵，重復驗證3次，篩選最優多糖產生菌株。

1.2.4 菌株胞外多糖的提取 發酵液濾液在10 000 g條件下高速離心8 min，取上清2 mL，加入工業酒精6 mL，4℃冰箱醇沉過夜，10 000 g條件下繼續離心8 min后，棄上清，用濾紙吸去沉淀表面酒精，再用2 mL蒸餾水復溶沉淀，測定多糖含量，篩選發酵多糖性能優良的菌株。

1.2.5 多糖的測定 參照NY/T 1676—2008[7]中的方法測定食用菌中粗多糖含量，以葡萄糖為標樣，用苯酚-硫酸法測定發酵液胞外多糖及胞內多糖的含量。

1.2.6 優良菌株的鑒定 將發酵胞外多糖性能優良的菌株寄送上海生物工程有限公司進行分子鑒定，與基因庫比對構建系統發育樹，確定菌株種屬。

1.2.7 優良菌株發酵產胞外多糖培養基配方及培養條件的優化 在發酵基礎培養基初始條件下，分別以培養基成分（如氮源、碳源等）和培養條件（如溫度、搖床轉速、pH值、發酵時間等）作單因素優化，并根據單因素優化結果篩選影響較大的因素進行正交試驗優化，確定最優胞外多糖的發酵條件。試驗數據重復3次，利用SPSS20軟件進行顯著性分析。

多糖得率的計算：

多糖得率（%）=多糖質量/培養基總質量×100

菌絲體多糖生產率（%）=多糖含量/菌絲體含量×100

式中，多糖質量和培養基總質量的單位均為g，多糖含量和菌絲體含量的單位均為g/L。

2 結果與分析

2.1 產多糖真菌初篩及搖瓶復篩結果

經9批次初篩，用硫酸鏈霉素抑制細菌的干擾，同時淘汰類似黑曲霉、青霉、木霉、黃曲霉、米曲霉等大量產生有色孢子的絲狀真菌，共獲得71株類似擔子菌的絲狀真菌。部分初篩結果見圖1a。從圖1a可知，絲狀真菌初期均為白色菌絲，后期形態分化為各色菌落。因此，篩選過程中要及時轉接斜面，淘汰非目標菌株。71株白色絲狀真菌，經液體發酵7 d的復篩，其中有15株的胞外多糖含量大于0.5 g/L，

32株介于0.1～0.5 g/L之間，24株幾乎無多糖產生。進一步重復發酵驗證，獲得最優菌株TL-8，胞外多糖產量達1.1 g/L。因此，選取TL-8菌株深入研究培養基配方和發酵條件，并進行鑒定。

2.2 TL-8菌株的形態觀察與分子生物學鑒定

TL-8菌株純化培養后形態特征如圖1b所示，菌絲為白色，培養3～4 d菌落直徑為4～6 cm，一般呈三圈圓環，外環的分生菌絲較平展，中環略隆起，內環略凹陷；在光學顯微鏡下，其菌絲偶見鎖狀聯合，菌絲有隔，直徑1.5～2.5 μm，擔孢子圓柱狀，透明平滑（圖1c）。TL-8菌株能廣泛利用秸稈纖維、淀粉、糊精、葡萄糖、果糖、乳糖、麥芽糖、蔗糖、阿拉伯糖、木糖等碳源生長；能很好地利用酵母膏、黃豆餅粉、菜籽餅粉、玉米漿、蛋白胨、牛肉膏等有機氮源生長；而對硫酸銨、硝酸鈉、尿素等無機氮源的利用較緩慢。在培養基起始pH 值5.0～6.0的環境下生長繁殖較快；適宜培養溫度為26～34℃。

經ITS測序處理獲得了TL-8菌株遺傳序列，在NCBI進行比對并利用MEGA 7構建進化樹，結果如圖2所示，TL-8菌株與Irpex lacteus系列菌株遺傳距離最近，這與形態鑒定結果也相符，因此TL-8菌株被鑒定為耙齒菌屬（Irpex），推測其為白囊耙齒菌（Irpex lacteus），命名為白囊耙齒菌TL-8（Irpex lacteus TL-8）。

2.3 培養條件對白囊耙齒菌TL-8產胞外多糖的影響

以發酵基本培養基為初始配方，分別進行單因素試驗，考察發酵時間、培養基初始pH值、搖床轉速和培養溫度等條件對白囊耙齒菌TL-8的生物量與多糖得率的影響。

2.3.1 發酵時間 由表1可知，白囊耙齒菌TL-8在發酵3～8 d內，隨著時間的延長，生物量和胞外多糖產量均呈上升趨勢，發酵第8天時達峰值，分別為5.58和1.38 g/L。發酵第7天的生物量和胞外多糖產量與前6 d相比顯著增加（P＜0.05），隨后保持相對平穩，考慮到時間成本，選擇發酵時間為7～9 d進行進一步優化。

2.3.2 培養基初始pH值 由表2可知，白囊耙齒菌TL-8在培養基初始pH值為5.5～6.5時均能較好地生長，胞外多糖產量較高，偏離這一pH值范圍，不論生物量還是胞外多糖產量均顯著降低，因此確定發酵培養基的初始pH值為 6.0進行后續試驗。

2.3.3 搖床轉速 由表3可知，白囊耙齒菌TL-8在搖床轉速為160 r/min時，生物量與胞外多糖產量最優，分別為5.51和1.37 g/L，與其他轉速條件存在顯著差異；高于此轉速，攪拌槳線速度增加，剪切力顯著增大，可能對菌絲體造成一定損傷；低于此轉速，可能溶氧不足，導致菌體生長和多糖合成受阻。因此，確定搖床轉速為160 r/min進行后續試驗。

2.3.4 培養溫度 由表4可知，白囊耙齒菌TL-8在26～34℃條件下均能很好地生長，說明該菌溫度適應性較好，其中培養溫度為30℃時，生物量和胞外多糖產量最高，分別為5.63和1.55 g/L，其他溫度條件下產量顯著減少。因此，確定培養溫度為30℃進行后續試驗。

2.4 單一碳源對白囊耙齒菌TL-8生物量和產胞外多糖的影響

多糖是由單糖連接的大分子，單糖是微生物重要的碳源。通過變更發酵基本培養基中的碳源種類（濃度均為20 g/L），獲得最優碳源優次關系，結果如表5所示。其中，乳糖和可溶性淀粉對白囊耙齒菌TL-8的生物量影響最顯著，生物量分別達6.29和6.14 g/L。乳糖對胞外多糖產量的影響最顯著，達1.80 g/L；其次是可溶性淀粉和葡萄糖，胞外多糖產量分別達1.53和1.46 g/L。從單位菌體的多糖生產率來看，乳糖最優，達29.33%；其次是葡萄糖和蔗糖，菌絲體多糖生產率分別達26.88%和25.60%。由于該試驗采用的是苯酚-硫酸法測定發酵液胞外多糖，而該方法不適用添加淀粉和糊精的產品。因此研究也發現，以淀粉為碳源的發酵液能使碘液變藍，其中仍然有未被完全利用的淀粉存在，導致所測多糖數據偏高。由此表明，淀粉作為白囊耙齒菌TL-8培養基的碳源并不是十分理想。

2.5 復合碳源對白囊耙齒菌TL-8的生物量與胞外胞外多糖的影響

盡管試驗結果顯示，乳糖作為白囊耙齒菌TL-8培養基的碳源，其多糖發酵水平及菌絲體多糖生產率均最優，但是乳糖的市場價格遠遠高于葡萄糖。基于此，該研究從成本和效益2個方面綜合考慮探討了以葡萄糖和乳糖作復合碳源進行發酵的可行性。由表6可知，在碳源總濃度為20.0 g/L的前提下，葡萄糖與乳糖的比例為14∶6時，白囊耙齒菌TL-8的生物量與胞外多糖產量最優，分別達6.54和2.24 g/L，與其他配比存在顯著性差異，具有協同提高作用，比單一碳源處理的生物量與胞外多糖產量顯著提高。從表7還可發現，隨著復合碳源濃度的提高，白囊耙齒菌TL-8的生物量和胞外多糖產量也進一步增加，當濃度提高到35 g/L時，白囊耙齒菌TL-8的生物量與胞外多糖產量分別達7.24和2.65 g/L，再繼續增加復合碳源濃度，其生物量與胞外多糖也無顯著增加。

2.6 單一氮源對白囊耙齒菌TL-8產胞外多糖的影響

氮素是菌體細胞和產物構成的重要元素之一。通過變更發酵基本培養基中的氮源種類（濃度均為10.0 g/L）獲得氮源優次關系，結果如表8所示，有機氮源的效果普遍優于無機氮源。其中，豆渣粉對白囊耙齒菌TL-8的生物量和胞外多糖影響最顯著，生物量和胞外多糖產量分別達到7.20和1.46 g/L；豆粕粉雖然也能較好的提高生物量，但其胞外多糖產量顯著低于豆渣粉和酵母膏。酵母膏作為氮源，雖然對生物量的影響不如豆渣粉和豆粕粉，但其對胞外多糖產量的影響僅次于豆渣粉，而且其多糖菌體生產率為最優，達24.37%。因此，研究進一步探討了酵母膏和豆渣粉作復合氮源的可行性。

2.7 復合氮源對白囊耙齒菌TL-8生物量與胞外多糖產量的影響

以酵母膏和豆渣粉作為復合氮源，進一步優化不同比例復合氮源（總含量為10.0 g/L）對白囊耙齒菌TL-8生物量與胞外多糖產量的影響，結果見表9。從表9可知，當酵母膏與豆渣粉的比例為4∶6時，白囊耙齒菌TL-8的生物量與胞外多糖產量表現較優，分別達7.37和2.21 g/L，胞外多糖產量與其他配比存在顯著性差異，具有協同提高作用，比單一氮源處理的生物量與胞外多糖產量顯著提高。從表10還可發現，隨著復合氮源含量的提高，生物量和胞外多糖產量也進一步增加，當復合氮源濃度為15 g/L時，白囊耙齒菌TL-8的生物量與胞外多糖產量分別達7.56和2.52 g/L，再增加復合氮源濃度，其生物量與胞外多糖無顯著增加。

2.8 白囊耙齒菌TL-8培養條件與培養基關鍵配方的正交試驗

從單因素分析來看，復合碳源濃度、復合氮源濃度以及發酵時間對白囊耙齒菌TL-8產多糖影響顯著。因此，設計正交試驗考察這3個要素的協同作用，正交試驗設計及結果見表11。從極差結果來看，培養條件3因素對白囊耙齒菌TL-8產多糖的影響程度依次為A（復合碳源濃度）＞C（培養時間）＞B（復合氮源濃度）。從K值結果來看，最佳組合為A3B2C2，即，復合碳源濃度40.0 g/L，復合氮源濃度15.0 g/L，培養時間8 d。由于該組合不在正交試驗設計之列，經3次重復驗證，在最優組合條件下，即，酵母膏6.0 g/L，豆渣粉9.0 g/L，葡萄糖28.0 g/L，乳糖12.0 g/L，磷酸二氫鉀2.0 g/L，硫酸鎂1.0 g/L，氯化亞鐵0.2 g/L，pH 值6.0，搖床轉速160 r/m，裝液量為100 mL/250 mL，培養溫度30℃的條件下培養8 d，白囊耙齒菌TL-8的胞外多糖產量達5.49 g/L，生物量達15.78 g/L。

3 討論與結論

在腫瘤、免疫力下降等多種疾病的治療過程中，真菌多糖都占據重要的地位，逐漸成為研究熱點之一。目前，對白囊耙齒菌多糖生物學功能的報道較少。研究表明，白囊耙齒菌多糖可顯著抑制腎系膜細胞的增殖[8]，還具有促進昆明小鼠抗疲勞的功效[9]，其抗腫瘤、抗氧化等特性有待進一步挖掘。該研究在篩選產多糖真菌的過程中，采用硫酸鏈霉素較好地抑制了細菌的生長，并根據“產多糖的大型真菌菌絲及孢子均為白色”這一形態特征，在生長后期觀察孢子顏色，淘汰了有色孢子的其他真菌，使篩選過程更具有目標性，提高了篩選效率，方法切實可行。趙興紅[10]的研究表明，白囊耙齒菌發酵的最適合碳源為乳糖，生物量可達14.31 g/L，這與筆者的試驗結果一致。筆者的試驗結果顯示，在發酵基本培養基的基礎上，采用乳糖（12 g/L）和葡萄糖（28 g/L）作復合碳源，采用酵母膏（6.0 g/L）和豆渣粉（9.0 g/L）作復合氮源，pH值6.0，搖床轉速160"r/min，裝液量為100 mL/250 mL，培養溫度30℃的條件下培養8 d，白囊耙齒菌TL-8的生物量達15.78 g/L，胞外多糖產量達5.49 g/L。

參考文獻：

[1] CHOI S I，LA I J，HAN X G，et al. Immunomodulatory effect of polysaccharide from fermented Morinda citrifolia L.（noni）on RAW 264.7 macrophage and balb/c mice[J]. Foods（Basel，Switzerland），2022，11（13）：1925.

[2] ZHAO Y M，SONG J H，WANG J，et al. Optimization of cellulase-assisted extraction process and antioxidant activities of polysaccharides from Tricholoma mongolicum Imai[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture，2016，96（13）：4484-4491.

[3] 姜 浩，孫 濤，姚皓昱，等. 食用真菌多糖的研究進展[J]. 食品工業科技，2022，43（12）：447-456.

[4] 劉炳莉，樊紅秀，邵 添，等. 銀耳多糖抑制鮮濕面水分遷移及改善黏連的作用[J]. 食品科學，2023，44（2）：79-86.

[5] 魏 奇，翁 馨，吳艷欽，等. 食用菌多糖降血糖活性及其作用機制的研究進展[J]. 食品工業，2022，43（7）：250-254.

[6] 李彥穎，張 祺，陳曉華，等. 桑黃多糖的分離純化、生物活性及其產品開發研究進展[J]. 食藥用菌，2022，30（1）：26-31，61.

[7] 中華人民共和國農業部. 中華人民共和國農業行業標準 食用菌中粗多糖含量的測定：NY/T 1676—2008[S]. 北京：中國農業出版社，2008.

[8] 吳 凌，張喜光，石陶圣，等. 白囊耙齒菌多糖提取條件優化及其生物活性[J]. 時珍國醫國藥，2010，21（12）：3094-3096.

[9] WANG J，LI C L，HU W J，et al. Studies on the anti-fatigue activities of Irpex lacteus polysaccharide-enriched extract in mouse model[J]. Pakistan Journal of Pharmaceutical Sciences，2019，32（3）：1011-1018.

[10] 趙興紅. 白囊耙齒菌的液體發酵及其多糖抗腫瘤活性的研究[D]. 長春：吉林大學，2009.

（責任編輯：成 平）