竹紅菌素中試提純工藝及抑菌活性研究

摘要： "為了研究竹紅菌素的中試提純工藝及抑菌效果，在中試生產中，通過不同溶劑、提取方法提取竹紅菌素，研究鹽析法、降溫法和超濾法對竹紅菌素的純化效果。結果表明使用氣流粉碎法竹紅菌素提取量可達21.4 mg/g，超濾法純化后，竹紅菌素的純度達到90%以上。對竹紅菌素的抑菌活性分析發(fā)現，其熱穩(wěn)定性良好，并且對大腸埃希氏菌和白色念珠菌均有抑制作用。竹紅菌素具有天然抗菌和良好的熱穩(wěn)定性，易提取純化，可作為一種抑菌藥物應用到醫(yī)藥等領域。

關鍵詞： 竹紅菌素；提取；純化；穩(wěn)定性；抑菌

中圖分類號： R284.2 文獻標志碼：A文章編號：1002-4026（2023）02-0008-08

開放科學（資源服務）標志碼（OSID）：

Study on pilot-scale purification process and antibacterial activity of hypocrellin

SUN Botong1，2，LI Hongliang1，HAN Rubing3，WANG Ying1，ZHANG Sichen1*

（1.Science and Technology Service Platform（Overseas Chinese Pioneer Park），Qilu University of Technology

（Shandong Academy of Sciences）， Jinan 250100，China;2.Shandong SME Productivity Promotion Center，

Jinan 250000，China;3. Zibo Municipal Hospital， Zibo 255400，China）

Abstract∶ To study the pilot-scale purification process and bacteriostatic effect of hypocrellin during the pilot-scale production， we extracted hypocrellin using different solvents and extraction methods. Then， we investigated the purification effects of the hypocrellin using salting-out， physical cooling， and ultrafiltration methods. The results showed that the amount of hypocrellin extracted using the jet pulverization method could reach up to 21.4 mg/g， and its density could exceed 90% after its purification via ultrafiltration. The analysis of the bacteriostatic activity of hypocrellin showed that it had good thermal stability and inhibitory effects against Escherichia coli and Candida albicans. We found that hypocrellin has natural antibacterial properties and good thermal stability， is easy to extract and purify， and can be used as a bacteriostatic drug in medicine and other applications.

Key words∶ hypocrellin; extraction; purification; stability; bacteriostatic activity

竹黃菌Shiraia bambusicola P.Hennings又名竹黃，隸屬于子囊菌門假球殼目竹黃科，是我國民族特色中藥，分布在云南、廣西、貴州等西南地區(qū)。民間多用竹黃浸酒，用于治療風濕性關節(jié)炎、坐骨神經痛、腰肌勞損、跌打損傷、虛寒胃痛、小兒驚風和急性肝炎等。現代醫(yī)學研究表明，竹黃的藥用價值主要體現在抑菌消炎、鎮(zhèn)痛以及抗病毒等方面[1-2]。

竹紅菌素（Hypocrellin）是竹黃的天然活性產物，二十世紀七十年代，云南微生物研究所率先從竹黃中分離出竹紅菌素。隨著研究的深入，逐步從竹黃中分離出甘露醇、尿囊素、氨基酸、痂囊腔菌素B、麥角固醇、過氧化麥角固醇以及軟脂酸單甘油酯等活性物質。通過不斷的純化分析，發(fā)現竹紅菌素包含竹紅菌甲素、竹紅菌乙素、竹紅菌丙素、竹紅菌丁素[3-4]。1980年萬象義等[5]首次發(fā)現了竹紅菌素的光動力活性。1990年，以蔣麗金院士[6]為首的團隊對竹紅菌素的光活化機制展開了深入的研究，證明了竹紅菌素具有光敏性，在光敏劑受光激發(fā)后產生活性氧，有氧條件下產生多種生物活性氧物質，包括單重態(tài)氧、超氧陰離子、羥基自由基和過氧化氫等，可以破壞生物分子的結構和功能，抑制膜上的酶蛋白和受體，最終引起細胞的凋亡與壞死，因而對細菌、病毒等微生物都有較強的殺傷力。

經過多年的研究發(fā)現，竹紅菌素利用其光敏性通過特殊途徑會引起腫瘤細胞凋亡，達到靶向治療腫瘤的效果[7-9]。有研究發(fā)現在光誘導下，竹紅菌素誘發(fā)人肺腺癌細胞內活性氧自由基升高，從而造成細胞皺縮、細胞膜磷脂酰絲氨酸外翻、DNA片段化、線粒體結構和功能的破壞，最終引發(fā)人肺腺癌細胞凋亡[10-11]。此外，還有研究表明竹紅菌素甲素和乙素在光誘導作用下，對金黃色葡萄球菌和白色念珠菌有抑菌作用[12-14]。

竹紅菌素作為一種新型、高效的光敏劑得到了國內外學者的廣泛關注，逐漸在生物醫(yī)藥、食品防腐、病蟲害防治等領域展現出巨大的應用潛力，其合成、生產、應用等是主要的研究熱點[15-16]。但是對竹紅菌素提取純化和抑菌性評價的研究大多集中在實驗室，鮮有報道竹紅菌素的中試及工業(yè)化生產，這也極大限制了竹黃的生產與應用。

本研究以竹黃180709為實驗材料，結合中試條件及生產設備，通過不同溶劑和不同的提純方法對竹紅菌素進行初步研究，并對竹紅菌素的抑菌能力進行部分驗證，為該菌株的規(guī)模開發(fā)利用提供中試理論基礎。

1材料

1.1實驗材料

竹黃180709購自亳州市永剛飲片廠有限公司，大腸埃希氏菌Escherichia coli 8099和白色念珠菌candida Albicans ATCC10231 均購自中國普通微生物菌種保藏管理中心。

1.2儀器和試劑

電熱恒溫鼓風干燥箱DHG-9070A（上海儀天科學儀器有限公司），超聲破碎儀TL-150Y（恒敏儀器有限公司），氣流粉碎機JXFT（山東經欣粉體工程設備有限公司），膠體磨FM60Y（山西立利通機械制造有限公司），旋轉蒸發(fā)儀RE-52CS（上海亞榮生化儀器廠），電熱恒溫水浴鍋HH-M8（上海赫田科學儀器有限公司），紫外可見分光光度儀V-1800PC（上海精密儀器儀表有限公司），高效液相色譜 LC-1200（日本島津公司），恒溫恒濕培養(yǎng)箱BJPX-HT100（山東博科生物科技有限公司），超凈工作臺BBS-DDC（山東博科科學儀器有限公司）等。無水乙醇（分析純）、二氯甲烷（分析純）、氯仿（分析純）、正己烷（分析純）、氮酮（分析純）、LB液體培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、YPD培養(yǎng)基、沙氏培養(yǎng)基（天津化學試劑廠）。

2方法與結果

2.1竹紅菌素提取方法

2.1.1浸泡提取

竹黃75 ℃烘干3 h，研缽粉碎后過篩（80目），稱取200 g竹黃粉末按料液比1[JX-*4]：[JX*4]20（g/mL）加入無水乙醇，pH調至8，配制提取液。將提取液放入50 ℃水浴鍋中加熱攪拌1 h，3 000 r/min轉速下離心，取沉淀物再次按料液比1[JX-*4]：[JX*4]15 （g/mL）配制提取液，循環(huán)上述步驟將沉淀物按料液比1[JX-*4]：[JX*4]10 （g/mL）配制提取液，重復上述方法，將3次獲得的上清液混勻得到竹紅菌素粗提液，采用比色法測定竹紅菌素含量。

2.1.2超聲提取

竹黃75 ℃烘干3 h，研缽粉碎后過篩（80目），稱取200 g竹黃粉末按料液比1[JX-*4]：[JX*4]20 （g/mL）加入無水乙醇，pH調至8，配制提取液。在40 kHz條件下超聲提取40 min，3 000 r/min轉速下離心，取沉淀物再次按料液比1[JX-*4]：[JX*4]20 （g/mL）配制提取液，在30 kHz條件下超聲提取20 min，將兩次獲得的上清液混勻得到竹紅菌素粗提液，采用比色法測定竹紅菌素含量。

2.1.3回流提取

竹黃75 ℃烘干3 h，膠體磨粉碎后稱取200 g竹黃粉，按料液比1[JX-*4]：[JX*4]20 （g/mL）加入無水乙醇，pH調至8，配制提取液，在70 ℃水浴鍋中加熱回流提取2 h，濾紙過濾，取濾液用比色法測定竹紅菌素含量。

2.1.4氣流粉碎提取

竹黃75 ℃烘干3 h，檢測竹黃含水量低于12%后，將5 kg竹黃在氣壓0.8 MPa、頻率3 Hz的條件下進料，調整分級機變頻器，分別采用頻率20、40、60 Hz通過氣流磨粉碎機粉碎竹黃，在1 000 r/min轉速下離心，收取竹黃粉末。稱取200 g竹黃粉末按料液比1[JX-*4]：[JX*4]30（g/mL）加入無水乙醇，pH調至8，配制提取液。將提取液放入50 ℃水浴鍋中加熱攪拌1 h，3 000 r/min轉速下離心，取上清液采用比色法測定竹紅菌素含量。

2.1.5竹紅菌素標準曲線的繪制

利用本實驗室提取得到的竹紅菌素純品，經烘干后溶于無水乙醇中， 依次稀釋配成5個梯度的系列竹紅菌素標準溶液， 利用紫外分光光度計在465 nm處測其吸光度， 繪制標準曲線y = 0.024 1x + 0.142 4。

2.1.6提取方法對竹紅菌素產量的影響

由圖1可知，竹紅菌素的提取方法中提取效率為氣流粉碎提取gt;回流提取gt;超聲提取gt;浸泡提取，采用氣流粉碎提取竹紅菌素含量高達21.4 mg/g。應用SPSS分析，結果表明氣流粉碎技術提取效果具有顯著性提高。

2.2最佳提取溶劑的選擇

竹黃經研缽粉碎后，取1 g分別用45 mL甲醇、丙酮、氯仿、正己烷、無水乙醇在70 ℃水浴振蕩提取2 h，通過過濾和旋轉蒸發(fā)除去溶劑雜質，旋蒸瓶中的殘留物用相同體積的溶液復溶，適當稀釋后，比色法測定竹紅菌素提取效果，確定最佳提取溶劑。

如圖2所示，通過SPSS分析，結果顯示實驗選取的溶劑丙酮、氯仿、無水乙醇、甲醇、正己烷提取效果依次遞減，從中試投入產出比、環(huán)保政策等因素考慮，本實驗選用無水乙醇作為提取溶劑。

2.3純化方法的選擇

2.3.1鹽析法

取1 L提取液，分別加入1.25 g的氯化鈉和硫酸鋅，45 ℃水浴加熱，攪拌30 min，靜置1 h，離心取上清液，采用高效液相色譜測定竹紅菌素含量。

2.3.2超濾法

取1 L提取液，加入0.05 g氫氧化鈉，攪拌15 min，依次使用2、0.8、0.45、0.2 μm有機濾膜，去除溶液中的蛋白質、糖類、脂質等大分子物質，采用高效液相色譜測定竹紅菌素含量。

2.3.3降溫法

取1 L提取液，加入0.05 g氫氧化鈉，攪拌15 min，放置在4 ℃下，靜置6 h，離心取上清液，加入0.01 g氫氧化鈉，攪拌15 min，在-20 ℃條件下，靜置6 h，離心取上清液，采用高效液相色譜測定竹紅菌素含量。

2.3.4純化方法對提取率的影響

由圖3所示，超濾法純化后，HPLC檢測到純化物中雜峰少，通過峰值計算，純度可達到90%以上，純化效果優(yōu)于鹽析法和降溫法。利用超濾法有機半透膜的微孔結構，分級阻擋蛋白質和脂類等大分子物質，最終實現竹紅菌素的分離純化。超濾法操作簡單、分離效率高，更有利于竹紅菌素在中試及大規(guī)模生產中采用。

2.4竹紅菌素熱穩(wěn)定性評價

吸取50 mL竹紅菌素液放置在10、20、40、60、80 ℃環(huán)境中，靜置20 min后取出，冷卻到室溫，乙醇定容至50 mL，采用比色法檢測光密度值ρOD，并比較不同溫度下竹紅菌素的穩(wěn)定性。

從圖4可知，竹紅菌素在10～80 ℃時，ρOD變化微小，表明在此范圍內，溫度對竹紅菌素影響較小，為后續(xù)高溫復配軟膏或制備其他產品時保持良好的穩(wěn)定性提供了實驗基礎。

2.5竹紅菌素的抑菌活性

取大腸埃希氏菌接種到LB培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)37 ℃，250 r/min，18～24 h。白色念珠菌接種到YPD培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)28 ℃，180 r/min，36～48 h。吸取兩種培養(yǎng)的受試菌液，配制成（1～5）×106 cfu/mL的受試菌懸液。各吸取1 mL受試菌懸液快速加入到未凝固的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基和沙氏培養(yǎng)基中，快速混勻。取無菌平板，在內部放置3個牛津杯[17]，將受試菌培養(yǎng)基緩慢倒入平板上（切勿倒入牛津杯中），待凝固后將牛津杯取出。取純化后的竹紅菌素液，通過干燥技術制備成竹紅菌素粉，取 200 mg 分別放置于牛津杯內，無菌水作對照（CK）。大腸埃希氏菌37 ℃培養(yǎng)24～36 h，白色念珠菌28 ℃培養(yǎng)36～48 h，觀察牛津杯底部的周圍有無抑菌圈，并測量抑菌圈直徑（d），取平均值。

根據《消毒技術規(guī)范》（2002版）[18]，抑菌環(huán)直徑大于7 mm者，判為有抑菌作用；抑菌環(huán)直徑小于或等于7 mm者，判為無抑菌作用。此外還有研究指出，抑菌圈大于10 mm表明有抑菌性，抑菌圈10～15 mm為中度敏感，抑菌圈大于或等于20 mm為高度敏感[19]。實驗結果表明，竹紅菌素對大腸埃希氏菌、白色念珠菌有抑菌效果，對大腸埃希氏菌抑菌圈可達15.3 mm，對白色念珠菌抑菌圈可達20 mm，對大腸埃希氏菌為中度敏感，白色念珠菌為高度敏感（圖5，表1）。

3討論

目前對竹紅菌素的研究多集中在竹黃人工培養(yǎng)及實驗室應用方面，對中試提取和純化的研究甚少。本實驗采取氣流粉碎和超濾法優(yōu)化提取和純化工藝，針對申請消字號產品必須檢測的兩類微生物指標進行實驗研究，對竹紅菌素進行抑菌實驗，以期為相關產品的開發(fā)利用提供依據。

竹黃中提取竹紅菌素受提取溫度、pH、料液比、金屬離子、提取溶劑、提取方法等多種因素的影響。杜文等[20]對竹紅菌素采用浸泡提取。邵穎等[21]對竹紅菌素的提取時間、料液比、溫度和有機溶劑等因素進行了分析，并指出用丙酮和正丁醇作提取劑，利用超聲浸提法提取的竹紅菌素含量最高，分別高達3.680 mg/g和3.593 mg/g。本實驗采用丙酮、氯仿、無水乙醇、甲醇和正己烷作提取劑，浸泡提取竹紅菌素，結果發(fā)現丙酮提取竹紅菌素含量達到22.3 mg/g，無水乙醇提取竹紅菌素含量是18.6 mg/g，提取量都得到較大的提高，可能是竹黃通過粉碎后粒徑小，提取時比表面積大，更易提取。

竹紅菌素作為脂溶性色素，在水中溶解度較差，之前研究認為丙酮對竹紅菌素的提取效果比無水乙醇好，但是大多限于實驗室水平，從生產角度，無水乙醇的毒性較小，使用簡單，因此在中試時選擇無水乙醇作為提取溶劑，更有利于在商品化生產中減少有毒物質的釋放，減輕環(huán)保壓力。純化選擇的超濾技術有效地去除了大分子的蛋白質和脂類物質，同時保護竹紅菌素結構不受影響，操作簡單、能耗低且分離效率高，更適合竹紅菌素大規(guī)模生產使用。

很多研究發(fā)現竹黃對微生物具有抑菌效果，從野生竹黃菌分離得到竹黃菌無性型菌株，利用發(fā)酵液做的抑菌實驗表明其對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白地霉和黑曲霉均有抑菌性[22]。對固載竹紅菌素的納米纖維膜進行抑菌實驗，在黑暗條件下，發(fā)現纖維膜對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均具有良好的抑菌效果；在光照條件下，對金黃色葡萄球菌的抑菌率達到90%以上[23]。對滇西竹黃提取物進行抑菌研究時發(fā)現，其對革蘭氏陽性菌的抑制效果明顯，而對陰性菌有抑制效果但不明顯[24]。通過本實驗研究發(fā)現，在抑菌方面，竹紅菌素對大腸埃希氏菌和白色念珠菌具有抑菌作用，但是對大腸埃希氏菌的抑菌能力較弱，對白色念珠菌的抑菌能力較強。本文在前期研究的基礎上，進一步證明了竹紅菌素對大腸埃希氏菌和白色念珠菌有抑制作用，為今后利用竹紅菌素復配抑菌產品提供了依據。

[JP3]竹紅菌素經過多年的研究，培養(yǎng)及提取技術不斷提高，產量已經由原來的0. 04 mg/g，提升至9.37 mg/g[25-26]。本實驗結合生產設備模擬中試環(huán)境，按照1[JX-*4]：[JX*4]20料液比，用無水乙醇做提取劑，利用氣流粉碎法優(yōu)化了傳統(tǒng)竹紅菌素提取的方法，使提取量增長到21.4 mg/g，實現了量的突破。通過超濾法純化竹紅菌素，純度達到90%以上，可作為食品、飼料、化妝品添加劑應用到多個領域。通過熱穩(wěn)定性實驗證明竹紅菌素在80 ℃下含量穩(wěn)定性不變，對其進行大腸埃希氏菌和白色念珠菌抑菌評價，為后續(xù)進行消字號軟膏的復配提供了可能性，同時也為竹黃資源的有效利用提供了新的思路。

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