基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接探討黃連溫膽湯治療幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎的作用機(jī)制

摘要： "運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接方法探索黃連溫膽湯治療幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎的分子機(jī)制。應(yīng)用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)對(duì)黃連溫膽湯藥物活性成分及藥物作用靶點(diǎn)基因進(jìn)行篩選。通過(guò)Genecards 數(shù)據(jù)庫(kù)、DisGENET數(shù)據(jù)庫(kù)查找幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎疾病相關(guān)靶點(diǎn)，利用維恩在線繪圖工具獲得疾病與藥物的共同靶點(diǎn)基因。利用Cytoscape 3.8.2軟件以及STRING數(shù)據(jù)庫(kù)分別構(gòu)建藥物-化合物-靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)及蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。運(yùn)用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行基因本體功能和京都基因與基因組百科全書通路富集分析。選取度值排名前3的靶點(diǎn)蛋白和活性成分使用AutoDockTools 1.5.6軟件進(jìn)行分子對(duì)接。共篩選得到槲皮素、川皮苷、柚皮素等127種黃連溫膽湯藥物活性成分，并獲得Akt1、JUN、TNF-α、STAT3等101個(gè)潛在靶點(diǎn)蛋白，涉及P53信號(hào)通路、NOD樣受體信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路等90條信號(hào)通路。分子對(duì)接結(jié)果顯示關(guān)鍵靶點(diǎn)STAT3、TP53、Akt1與活性成分槲皮素、川皮苷、柚皮素的親和力較好，其中以Akt1與柚皮素的結(jié)合能力最強(qiáng)。通過(guò)分析黃連溫膽湯治療幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎的作用靶點(diǎn)和相關(guān)信號(hào)通路，能夠?yàn)榕R床應(yīng)用和后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究提供理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： 黃連溫膽湯；幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；分子對(duì)接

中圖分類號(hào)： R285 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：1002-4026（2023）02-0023-10

開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)志碼（OSID）：

Network pharmacology and molecular docking analysis of the

mechanism of Huanglian Wendan Decoction in the treatment

of Helicobacter pylori associated gastritis

LIU Wenwen， GAO Yunyun， YIN Zhipeng， L Gang， WANG Yu， ZHAO Yinghui

（School of Basic Medical Science， Shandong First Medical University， Tai′an 271000， China）

Abstract∶ This study aimed to explore the mechanism of Huanglian Wendan Decoction in the treatment of Helicobacter pylori associated gastritis by network pharmacology and molecular docking methods. The active ingredients and drug target genes of Huanglian Wendan Decoction were screened using the traditional Chinese medicine system pharmacology database and analysis platform. The H. pylori associated gastritis disease-related targets were found by the GeneCards and DisGENET databases， and the common target genes of diseases and drugs were obtained via the Venny online mapping tool. Cytoscape 3.8.2 software and the STRING database were used to construct a drug-compound-target interaction network and a protein-protein interaction network diagram， respectively. Gene ontology function and Kyoto encyclopedia of genes and genomes pathway enrichment analysis were performed using the DAVID database. The target proteins and active ingredients with the top three selection scores were selected for molecular docking using Autodocktools 1.5.6 software. A total of 127 active ingredients of Huanglian Wendan Decoction were screened， such as quercetin， nobiletin， and naringenin. A total of 101 potential target proteins were obtained， such as Akt1， JUN， TNF-α， and STAT3， which involved 90 signal pathways， including the p53 signal pathway， NOD-like receptor signal pathway， and TNF signal pathway. Molecular docking results revealed that the key targets， STAT3， TP53， and Akt1， had high affinity for the active ingredients quercetin， nobiletin， and naringenin. In addition， Akt1 had the highest binding affinity for naringenin. Network pharmacology and molecular docking analysis predicted the action target and related signal pathway of Huanglian Wendan Decoction in the treatment of H. pylori associated gastritis， which will provide a theoretical basis for clinical application and subsequent experimental research.

Key words∶ Huanglian Wendan Decoction; Helicobacter pylori associated gastritis; network pharmacology; molecular docking

幽門螺桿菌Helicobacter pylori是感染胃黏膜最常見(jiàn)的病原體[1]，流行病學(xué)研究表明，全球大約有一半人口感染幽門螺桿菌，在中國(guó)其感染率高達(dá)50%以上[2-4]。幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎是一種由幽門螺桿菌感染后所引發(fā)的胃黏膜炎癥，可形成慢性炎癥，預(yù)后不良，被認(rèn)為是消化性潰瘍和胃癌發(fā)生發(fā)展的潛在危險(xiǎn)因素[5]。目前，臨床上通常將抗生素作為根除幽門螺桿菌感染的首選方法，主要包括標(biāo)準(zhǔn)的三聯(lián)療法和在其基礎(chǔ)上加入鉍劑的四聯(lián)療法[6-7]。近幾年，隨著抗生素廣泛使用，細(xì)菌的耐藥性不斷增加，尤其以克拉霉素為核心藥物的標(biāo)準(zhǔn)三聯(lián)療法耐藥情況最為嚴(yán)重[6]。2017年，WHO將耐克拉霉素的幽門螺桿菌列為對(duì)人類健康威脅最大的12種細(xì)菌之一[8]。因此，尋找能夠補(bǔ)充替代抗生素治療的其他方法，對(duì)于根治幽門螺桿菌感染至關(guān)重要。

已有研究表明，中藥在根除幽門螺桿菌和治療慢性胃炎方面具有較好的臨床效果[9]。黃連溫膽湯具有抗炎、調(diào)理脾胃失調(diào)、清熱燥濕等功效[10]，研究發(fā)現(xiàn)，其藥物成分能夠抑制胃酸的分泌，并對(duì)幽門螺桿菌具有一定清除作用，對(duì)幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎治療效果較為顯著[11]。但該藥物對(duì)幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎治療的分子生物學(xué)機(jī)制還不清楚。因此，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接的方法預(yù)測(cè)黃連溫膽湯治療幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎的潛在靶點(diǎn)和相關(guān)信號(hào)通路等藥理機(jī)制，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究和在臨床上的應(yīng)用提供參考。

1材料與方法

1.1黃連溫膽湯藥物活性成分及靶點(diǎn)的篩選

分別對(duì)黃連溫膽湯中的黃連、半夏、甘草、茯苓、枳實(shí)、生姜、陳皮等7種藥物運(yùn)用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform， TCMSP）（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）進(jìn)行檢索，將篩選條件設(shè)置為口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，類藥性（drug-likeness，DL）≥0.18，進(jìn)一步獲得藥物的主要活性成分，之后運(yùn)用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)查詢上述藥物活性成分所對(duì)應(yīng)的藥物作用蛋白靶點(diǎn)[12]。將獲得的所有蛋白靶點(diǎn)去重處理，利用Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行基因Symbol的轉(zhuǎn)換，最終獲得藥物活性成分的靶點(diǎn)基因。

1.2篩選疾病相關(guān)靶點(diǎn)和黃連溫膽湯治療幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎的潛在靶點(diǎn)

在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.genecards.org/）和DisGENET數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.disgenet.org/）中輸入關(guān)鍵詞“Helicobacter pylori associated gastritis”、“Gastritis correlated to Helicobacter pylori”，查找幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎疾病相關(guān)靶點(diǎn)，然后對(duì)疾病靶點(diǎn)進(jìn)行合并去重處理[13-14]。運(yùn)用Venny 2.1在線繪圖工具（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html） 將幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎疾病靶點(diǎn)基因和黃連溫膽湯藥物成分靶點(diǎn)基因進(jìn)行整合，取交集后，最終獲得黃連溫膽湯治療幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎的潛在靶點(diǎn)[15]。

1.3藥物-活性成分-潛在靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將藥物、活性成分、潛在靶點(diǎn)的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理整合后導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2作圖軟件，構(gòu)建藥物-活性成分-潛在靶點(diǎn)可視化網(wǎng)絡(luò)圖[16]。利用不同形狀的節(jié)點(diǎn)分別代表藥物、藥物活性成分、潛在靶點(diǎn)，邊用于表示三者之間的相互作用關(guān)系，運(yùn)用Tool工具中的network analysis選項(xiàng)對(duì)節(jié)點(diǎn)進(jìn)行分析，最終獲得各節(jié)點(diǎn)對(duì)應(yīng)的度值（degree）。

1.4蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

運(yùn)用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.string-db.org/）對(duì)潛在靶點(diǎn)基因進(jìn)行分析[17]。將物種設(shè)為“homo sapiens”，“high confidence”設(shè)置為0.9，獲得蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction，PPI）關(guān)系后將TSV數(shù)據(jù)導(dǎo)出。將上述獲得的數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2作圖軟件，通過(guò)設(shè)置degree值范圍，完成PPI網(wǎng)絡(luò)圖的繪制，其中節(jié)點(diǎn)的大小代表度值的高低，邊的粗細(xì)代表PPI關(guān)系的強(qiáng)弱程度。

1.5GO生物過(guò)程和KEGG通路富集分析

將黃連溫膽湯治療幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎的潛在靶點(diǎn)基因輸入DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//david.ncifcrf.gov/）中[18]。設(shè)定物種為“Homo sapiens”，設(shè)定閾值Plt;0.01，分別進(jìn)行基因本體（ gene ontology， GO）分析和京都基因與基因組百科全書 （ Kyoto encyclopedia of genes and genomes， KEGG）通路富集分析，得到數(shù)據(jù)后，將其導(dǎo)出，數(shù)據(jù)中-lg P值的大小代表著富集程度，值越大表示富集程度越大，最終選取富集程度排名前10的GO值和排名前20的KEGG值分別進(jìn)行條形圖和氣泡圖的繪制。

1.6構(gòu)建BP-CC-MF-KEGG-潛在靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

將藥物與疾病的交集靶點(diǎn)、GO分析中生物過(guò)程（biological process， BP）、細(xì)胞組分（cellular component， CC）、分子功能（molecular function， MF）富集度排名前10的數(shù)據(jù)和排名前20的KEGG信號(hào)通路數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2軟件作圖工具，繪制BP-CC-MF-KEGG-潛在靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。

1.7分子對(duì)接

從PPI網(wǎng)絡(luò)圖和藥物-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖中分別選取度值排名前3的靶點(diǎn)蛋白STAT3、TP53、Akt1與藥物活性成分槲皮素、川皮苷、柚皮素進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證。從PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中下載有效活性成分的結(jié)構(gòu)式，利用Chem3D軟件制作相應(yīng)的3D結(jié)構(gòu)，并輸出為mol*2格式[19]。再?gòu)腜DB 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.rcsb.org/）下載核心蛋白結(jié)構(gòu)域的pdb格式，得到STAT3、TP53、Akt1的PBD編號(hào)分別為6NJS、6VIP、3O96，接著利用 PyMOL 軟件對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行去水、去磷酸根等操作。利用AutoDockTools 1.5.6軟件將藥物活性成分及核心蛋白基因文件pdb 格式轉(zhuǎn)換為pdbqt格式并尋找活性口袋，最后運(yùn)行Vina腳本進(jìn)行分子結(jié)合能計(jì)算以及分子對(duì)接結(jié)果展示，同時(shí)運(yùn)行Discovery Studio 2019尋找對(duì)接位點(diǎn)并計(jì)算柔性結(jié)合的LibDockScore，將輸出的分子對(duì)接結(jié)果導(dǎo)入PyMOL軟件進(jìn)行分子對(duì)接構(gòu)象展示。若結(jié)合能為負(fù)值，說(shuō)明配體與受體可自發(fā)結(jié)合，當(dāng)Vina結(jié)合能≤-5.0 kJ/mol以及DS能找到對(duì)接位點(diǎn)，且LibDockScore≥100，說(shuō)明兩者形成穩(wěn)定對(duì)接，對(duì)配體-受體復(fù)合物進(jìn)行分子對(duì)接結(jié)果3D、2D展示，以評(píng)價(jià)生物信息分析預(yù)測(cè)的可靠性。

2結(jié)果

2.1黃連溫膽湯藥物活性成分及靶點(diǎn)的篩選

運(yùn)用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)檢索黃連溫膽湯中的黃連、半夏、甘草、茯苓、枳實(shí)、生姜、陳皮等7種藥物活性成分，按照OB≥30%和DL≥0.18的檢索條件，共篩選得到166種藥物活性成分，將其中21種無(wú)對(duì)應(yīng)藥物靶點(diǎn)蛋白的化合物和7種多藥物共有成分刪除、去重整合后，最終得到137種藥物活性化合物，多藥物共有活性成分見(jiàn)表1。利用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)137種藥物活性化合物對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行查詢，獲得2 717個(gè)藥物作用的靶點(diǎn)蛋白，經(jīng)過(guò)去重處理后，剩余260個(gè)。將260個(gè)藥物作用的靶點(diǎn)蛋白利用Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行規(guī)范化處理后，完成基因Symbol的轉(zhuǎn)換。

2.2篩選疾病相關(guān)靶點(diǎn)和黃連溫膽湯治療幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎的潛在靶點(diǎn)

利用幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎的英文名稱為關(guān)鍵詞在Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)和DisGENET數(shù)據(jù)庫(kù)經(jīng)過(guò)查找篩選，共得到800個(gè)疾病靶點(diǎn)，與上述獲得的260個(gè)藥物作用靶點(diǎn)進(jìn)行維恩分析，最終得到101個(gè)交集靶點(diǎn)，作為黃連溫膽湯治療幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎的直接作用靶點(diǎn)（OSID科學(xué)數(shù)據(jù)與內(nèi)容附圖1）。

2.3藥物-活性成分-潛在靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

為了進(jìn)一步探索黃連溫膽湯治療幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎的作用機(jī)制，將137種藥物活性成分對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)去重后，與101個(gè)交集靶點(diǎn)分別進(jìn)行比對(duì)篩選，刪除10種無(wú)對(duì)應(yīng)交集靶點(diǎn)的藥物活性成分，最終將剩余的127種藥物活性成分，7個(gè)藥物節(jié)點(diǎn)（黃連、半夏、甘草、茯苓、枳實(shí)、生姜、陳皮），101個(gè)交集靶點(diǎn)的數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2軟件，完成藥物-活性成分-潛在靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)模型的構(gòu)建，見(jiàn)OSID科學(xué)數(shù)據(jù)與內(nèi)容附圖2，圖中正方形節(jié)點(diǎn)代表藥物活性成分、六邊形節(jié)點(diǎn)代表藥物、菱形節(jié)點(diǎn)代表交集靶點(diǎn)。利用network analysis選項(xiàng)對(duì)網(wǎng)絡(luò)中的節(jié)點(diǎn)進(jìn)行分析，最終得到各節(jié)點(diǎn)的度值。在藥物活性化合物中，度值越高表示藥物活性成分對(duì)應(yīng)的交集靶點(diǎn)越多，交集靶點(diǎn)的度值越高，說(shuō)明作用于該靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)藥物活性成分越多。

經(jīng)分析可知，平均每種藥物的活性成分對(duì)應(yīng)8個(gè)交集靶點(diǎn)，127種藥物活性成分中有49種活性成分作用的靶點(diǎn)數(shù)大于均值，表明這49種藥物成分為有效活性成分；平均每個(gè)交集靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)11種藥物活性成分，101個(gè)交集靶點(diǎn)中有15個(gè)靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)的藥物活性成分高于平均值，說(shuō)明這15個(gè)靶點(diǎn)為黃連溫膽湯治療幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎的關(guān)鍵靶點(diǎn)。表2列舉了度值最高的前8種（度值gt;15）藥物活性成分，表3列舉了度值高于均值的前15個(gè)交集靶點(diǎn)。

2.4PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

運(yùn)用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)和Cytoscape 3.8.2作圖軟件進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，見(jiàn)OSID科學(xué)數(shù)據(jù)與內(nèi)容附圖3，該網(wǎng)絡(luò)由92個(gè)節(jié)點(diǎn)和453條邊組成，圓形節(jié)點(diǎn)的直徑代表著度值，直徑越大度值越大。邊的粗細(xì)代表PPI關(guān)系的強(qiáng)弱程度，邊由粗到細(xì)，作用關(guān)系由強(qiáng)到弱，顏色由藍(lán)色向橙色過(guò)渡。其中度值≥20的節(jié)點(diǎn)有10個(gè)，節(jié)點(diǎn)顏色用黃色表示；度值介于10～20之間有27個(gè)節(jié)點(diǎn)，節(jié)點(diǎn)顏色用紅色表示；剩余55個(gè)節(jié)點(diǎn)度值 lt;10，節(jié)點(diǎn)顏色用紫色表示。度值較大的10個(gè)節(jié)點(diǎn)蛋白分別為STAT3、TP53、Akt1、TNF、JUN、MAPK3、MAPK1、IL-6、MAPK14、MAPK8。

2.5GO功能和KEGG通路富集分析

將101個(gè)潛在靶基因利用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)分別進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG信號(hào)通路富集分析，在Plt;0.01條件下，共得到349條GO富集類目和90條信號(hào)通路，其中BP 285條類目、CC 25條類目、MF 39條類目。按照P值的大小和靶點(diǎn)數(shù)進(jìn)行排序，篩選出排名前10的GO條目用于條形圖的構(gòu)建（OSID科學(xué)數(shù)據(jù)與內(nèi)容附圖4），篩選出排名前20的KEGG條目用于氣泡圖的繪制（OSID科學(xué)數(shù)據(jù)與內(nèi)容附圖5）。

結(jié)果顯示黃連溫膽湯治療幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎的潛在作用靶點(diǎn)可以參與藥物反應(yīng)、脂多糖反應(yīng)、酒精反應(yīng)、雌二醇反應(yīng)和有機(jī)環(huán)化合物的細(xì)胞反應(yīng)，參與凋亡過(guò)程的負(fù)調(diào)控、缺乏配體的外源凋亡信號(hào)通路，參與基因表達(dá)的正調(diào)控、RNA聚合酶II啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄正調(diào)控等生物過(guò)程；主要定位在細(xì)胞外隙、胞質(zhì)、胞外區(qū)、線粒體、蛋白質(zhì)復(fù)合體、膜筏、線粒體外膜、核原生質(zhì)、膜小凹、細(xì)胞外基質(zhì)等；同時(shí)還可參與酶結(jié)合、同源蛋白結(jié)合、蛋白結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、蛋白激酶結(jié)合、蛋白磷酸酶結(jié)合、支架蛋白結(jié)合、細(xì)胞因子活性、異源蛋白二聚體活性、同源蛋白二聚體活性等分子功能。黃連溫膽湯治療幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎富集主要涉及6條癌癥相關(guān)通路，7條感染相關(guān)通路，以及其他富集度較高的P53信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、Nod樣受體信號(hào)通路、T細(xì)胞受體信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路等。

2.6構(gòu)建BP-CC-MF-KEGG-潛在靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

將上述得到的潛在靶點(diǎn)、GO功能分析中BP、CC、MF排名前10的數(shù)據(jù)、KEGG通路富集分析中排名前20的數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2中，完成BP-CC-MF-KEGG-潛在靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖的繪制，見(jiàn)OSID科學(xué)數(shù)據(jù)與內(nèi)容附圖6，圖中紅色節(jié)點(diǎn)代表潛在靶點(diǎn)、藍(lán)色節(jié)點(diǎn)代表KEGG分析、黃色節(jié)點(diǎn)代表BP分析、綠色節(jié)點(diǎn)代表CC分析、紫色節(jié)點(diǎn)代表MF分析，可以看到黃連溫膽湯作用的靶點(diǎn)主要分布在細(xì)胞外間隙和胞質(zhì)等多細(xì)胞組分中，通過(guò)酶或蛋白等多種結(jié)合方式參與藥物、脂多糖、外源刺激等反應(yīng)以及凋亡過(guò)程的負(fù)調(diào)控、缺乏配體的外源凋亡信號(hào)通路等生物過(guò)程，并通過(guò)調(diào)控P53信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路等多條信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)對(duì)幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎的治療。

2.7分子對(duì)接

從PPI網(wǎng)絡(luò)圖和藥物-活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖中，分別選擇度值排名前3的靶點(diǎn)蛋白STAT3、TP53、Akt1與藥物活性成分槲皮素、川皮苷、柚皮素進(jìn)行結(jié)合能力預(yù)測(cè)，結(jié)合能為負(fù)值說(shuō)明受體與配體具有親和力。分子對(duì)接結(jié)果見(jiàn)表4，活性成分槲皮素、川皮苷、柚皮素與靶點(diǎn)蛋白STAT3、TP53、Akt1形成的對(duì)接模型的結(jié)合能均小于-5 kJ/mol，說(shuō)明親和力較好。另外，應(yīng)用Discovery Studio 2019軟件對(duì)活性成分槲皮素、川皮苷、柚皮素及靶點(diǎn)蛋白STAT3、TP53、Akt1進(jìn)行對(duì)接，計(jì)算LibDockScore見(jiàn)表4，其中靶點(diǎn)蛋白STAT3、TP53與活性成分柚皮素，以及靶點(diǎn)蛋白Akt1與活性成分槲皮素、柚皮素形成的對(duì)接模型LibDockScore均大于100，其余對(duì)接體形成的對(duì)接模型LibDockScore＜100。綜合分析發(fā)現(xiàn)，靶點(diǎn)蛋白Akt1與柚皮素結(jié)合能力最強(qiáng)，能形成最穩(wěn)定的對(duì)接模型。由于不同靶點(diǎn)蛋白與不同活性分子在不同氨基酸位點(diǎn)形成不同的氫鍵及疏水鍵聯(lián)系，因此彼此形成不一樣的對(duì)接體。最后，把Vina輸出的化合物結(jié)果導(dǎo)入Pymol中，利用Discovery Studio 2019軟件，與蛋白配體進(jìn)行3維及2維分子對(duì)接展示，見(jiàn)圖1和OSID科學(xué)數(shù)據(jù)與內(nèi)容附圖7。

3討論

本文運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析黃連溫膽湯治療幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎的機(jī)制，通過(guò)構(gòu)建藥物-活性成分-潛在靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)模型，篩選出127種活性成分。其中度值大于15的8種藥物活性成分，已有部分活性成分經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明具有抑制幽門螺桿菌增殖、治療幽門螺桿菌相關(guān)性疾病的作用[20]。在這8種活性成分中以槲皮素作用的靶點(diǎn)數(shù)最多，槲皮素是黃酮醇類黃酮亞類的主要代表，在抗氧化、抗炎、抗纖維化、抑制幽門螺桿菌增殖等方面發(fā)揮重要作用，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)槲皮素能夠通過(guò)抑制p38 MAPK和BAX表達(dá)，調(diào)控胃黏膜上皮細(xì)胞增殖和凋亡之間的平衡，對(duì)幽門螺桿菌誘導(dǎo)的胃炎起到保護(hù)作用[21-22]。黃岑素是黃岑最主要活性成分，能夠抑制幽門螺桿菌在胃黏膜中的定植，減少對(duì)胃黏膜的損傷，同時(shí)可以降低核轉(zhuǎn)錄因子（NF-κB）的表達(dá)水平，抑制炎性因子的產(chǎn)生，增強(qiáng)對(duì)胃黏膜的保護(hù)作用[23]。上述兩種活性成分已被證實(shí)能夠通過(guò)抑制幽門螺桿菌增殖發(fā)揮對(duì)胃黏膜的保護(hù)作用，而其余幾種作用靶點(diǎn)較多的活性成分對(duì)幽門螺桿菌的抑制作用還有待進(jìn)一步研究。

利用TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)查詢137種藥物活性成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)蛋白，獲得黃連溫膽湯相關(guān)靶點(diǎn)260個(gè)，同時(shí)運(yùn)用GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)和DisGENET數(shù)據(jù)庫(kù)獲取800個(gè)幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎相關(guān)靶點(diǎn)，將得到的藥物相關(guān)靶點(diǎn)與疾病相關(guān)靶點(diǎn)取交集，最終得到101個(gè)交集靶點(diǎn)作為黃連溫膽湯治療幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎的關(guān)鍵靶點(diǎn)。利用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)和Cytoscape 3.8.2繪圖軟件對(duì)101個(gè)交集靶點(diǎn)進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，其中Akt1、P53、TNF-a、IL-6、STAT3等蛋白與其他靶點(diǎn)聯(lián)系密切，是調(diào)控整個(gè)網(wǎng)絡(luò)的樞紐，在黃連溫膽湯治療幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎過(guò)程中起到關(guān)鍵作用。

Akt又稱蛋白激酶B，參與多條信號(hào)通路，其中PI3K/Akt信號(hào)通路對(duì)于維持細(xì)胞的完整性，細(xì)胞生長(zhǎng)、生存、死亡和代謝至關(guān)重要，該通路的激活參與多種癌癥的發(fā)生[24-25]。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，幽門螺桿菌感染會(huì)增加活性氧水平，導(dǎo)致PI3K/Akt通路持續(xù)激活，進(jìn)而促進(jìn)p-Akt （Ser473）和下游蛋白p-GSK-3β （Ser9）的激活，有助于細(xì)胞增殖和胃癌發(fā)生[26]。通過(guò)分析，黃連溫膽湯可能通過(guò)Akt1參與的信號(hào)通路發(fā)揮治療幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎的作用以及降低下一步轉(zhuǎn)化為胃癌的風(fēng)險(xiǎn)。

[STBX]P53[STBZ]基因是一種重要的抑癌基因，具有修復(fù)受損DNA，并維持受損DNA基因組穩(wěn)定性的功能，被稱為“基因的守護(hù)者”。幽門螺桿菌感染可通過(guò)調(diào)節(jié)各種細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)，包括活性氧和活性氮的產(chǎn)生以及抑癌基因的異常激活，來(lái)調(diào)控宿主P53信號(hào)通路[27]。慢性幽門螺桿菌感染可通過(guò)誘導(dǎo)[STBX]P53[STBZ]突變、蛋白酶體降解、轉(zhuǎn)錄后修飾，來(lái)降低P53的表達(dá)水平，導(dǎo)致細(xì)胞過(guò)度增殖和凋亡受損，從而增加胃癌發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)[28]。黃連溫膽湯可影響P53的表達(dá)，進(jìn)而抑制幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎轉(zhuǎn)化為胃癌的風(fēng)險(xiǎn)。

抗凋亡蛋白BCL-2和促凋亡蛋白BAX屬于[STBX]BCL-2[STBZ]基因家族成員，共同參與線粒體凋亡通路。BAX位于P53信號(hào)通路的下游，可以與BCL-2構(gòu)成異源二聚體形式，同P53一起參與細(xì)胞凋亡過(guò)程[22]。幽門螺桿菌感染可上調(diào)BAX基因，引起B(yǎng)CL-2與BAX蛋白表達(dá)比例降低，誘導(dǎo)慢性胃炎患者胃黏膜上皮細(xì)胞發(fā)生凋亡[29]。研究證實(shí)，黃連溫膽湯可以通過(guò)下調(diào)BAX，提高BCL-2蛋白表達(dá)，抑制胃黏膜細(xì)胞凋亡，對(duì)慢性胃炎的胃黏膜損傷具有一定修復(fù)作用[30]，這與本文分析一致。

幽門螺桿菌分泌的Tipa毒素與細(xì)胞表面受體結(jié)合后，通過(guò)激活NF-κB信號(hào)通路誘導(dǎo)炎性因子TNF-a的分泌，加速胃炎的進(jìn)展，并誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)的轉(zhuǎn)變[31]。同時(shí)TNF-a的異常表達(dá)與幽門螺桿菌誘導(dǎo)胃黏膜病變的嚴(yán)重程度有關(guān)，是促進(jìn)淺表性胃炎向胃癌方向轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵因素[32]。Chen等[33]發(fā)現(xiàn)Tipa可以通過(guò)激活I(lǐng)L-6/STAT3通路促進(jìn)上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而加速胃癌細(xì)胞的侵襲。信號(hào)傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3 （STAT3）作為轉(zhuǎn)錄因子，能夠在感染、生長(zhǎng)因子等各種條件刺激下，介導(dǎo)下游信號(hào)的傳遞，參與炎癥及相關(guān)腫瘤的發(fā)展[34]。Piao等[35]研究發(fā)現(xiàn)，幽門螺桿菌的感染能夠誘導(dǎo)活性氧產(chǎn)生，并通過(guò)刺激IL-6炎性因子的上調(diào)，促進(jìn)STAT3磷酸化激活，介導(dǎo)下游信號(hào)轉(zhuǎn)錄，加速胃炎和胃癌的發(fā)生發(fā)展。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）是多種細(xì)胞信號(hào)通路的關(guān)鍵調(diào)控因子[36]，在眾多信號(hào)通路中，MAPK通路在細(xì)胞增殖、分化、凋亡、血管生成和腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要的作用[37]。細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）、p38 MAPK和ERK5信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是4種MAPK級(jí)聯(lián)通路[30]。其中JNK/p38 MAPK通路主要與細(xì)胞的應(yīng)激和凋亡有關(guān)，而ERK/MAPK信號(hào)通路主要與細(xì)胞增殖和分化密切相關(guān)[38]。幽門螺桿菌感染胃黏膜細(xì)胞后，可以觸發(fā)ERK1/2、JNK、p38 MAPK多條MAPK信號(hào)通路的激活，誘導(dǎo)IL-8、TNF-a、IL-1β和IL-17等炎性因子的分泌，造成嚴(yán)重的胃黏膜炎癥性損傷[39-40]。有研究發(fā)現(xiàn)，黃連溫膽湯可通過(guò)降低炎性因子TNF-a和IL-8的分泌，減輕幽門螺桿菌誘導(dǎo)的胃黏膜炎癥性損傷，從而改善臨床癥狀[41]。黃連溫膽湯調(diào)控上述信號(hào)分子，在信號(hào)通路中起作用的具體機(jī)制亟待研究。

本研究將101個(gè)潛在靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析，在Plt;0.01的條件下篩選出的90條相關(guān)通路中，癌癥通路如P53信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路等在KEGG中富集程度較高，除此之外還包括Toll樣受體信號(hào)通路、Nod樣受體信號(hào)通路、T細(xì)胞受體信號(hào)通路等。Toll樣受體I型跨膜受體，可在病原體的誘導(dǎo)刺激下啟動(dòng)免疫應(yīng)答反應(yīng)，而MyD88是信號(hào)傳導(dǎo)的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)[42]。有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)幽門螺桿菌感染細(xì)胞后，其自身的配體可與胃上皮細(xì)胞上TLR2、TLR4結(jié)合啟動(dòng)一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)而刺激MyD88和NF-κB下游信號(hào)通路的激活，造成機(jī)體免疫功能紊亂，加深胃炎和胃潰瘍的嚴(yán)重程度[43-44]。而NOD樣受體（NOD-like receptors， NLR）不僅能夠識(shí)別病原相關(guān)分子，還能識(shí)別損傷相關(guān)分子，NLR受體與配體結(jié)合后被激活并參與炎性小體的形成，誘導(dǎo)Caspase-1前體蛋白募集，并自剪切成Caspase-1活體形式，促進(jìn)炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，從而導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的發(fā)生[45-46]。所以黃連溫膽湯可能通過(guò)作用于以上通路發(fā)揮對(duì)幽門螺桿菌誘發(fā)的相關(guān)性胃病的治療作用。

本文采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)探究黃連溫膽湯治療幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎的作用靶點(diǎn)和分子機(jī)制，通過(guò)構(gòu)建藥物-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，分析其藥理作用，證實(shí)黃連溫膽湯通過(guò)槲皮素、川皮苷、柚皮素等藥物活性成分，經(jīng)過(guò)抗炎、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等多種途徑作用于STAT3、TP53、Akt1等關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白，發(fā)揮治療幽門螺桿菌相關(guān)性胃炎的作用。本研究?jī)H是理論上的預(yù)測(cè)，能夠?yàn)楹罄m(xù)的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證提供理論基礎(chǔ)，并為臨床藥物的推廣提供科學(xué)依據(jù)。

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